陰道白假絲酵母菌生物膜形成、免疫逃避策略及治療思路的研究進展*

牟一凡，史文華，沈 影，韓鳳娟

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院婦產科，哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院婦科，哈爾濱 150040)

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是臨床常見的婦科疾病之一。近年來VVC在我國的發(fā)病率居高不下，約75%婦女一生中至少患過1次VVC，40%～50%的女性可患2次或2次以上，約5%～8%的患者發(fā)展為復發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC)[1]。90%以上的VVC或RVVC患者是以感染白假絲酵母菌為主[2]。研究發(fā)現(xiàn)，VVC的發(fā)生與白假絲酵母菌生物膜的形成密切相關，生物膜是構成真菌毒力的主要因素，可促進真菌的黏附、增殖及擴散，且形成后不易清除，導致臨床癥狀反復發(fā)作，治療周期延長，難以根治，嚴重影響了女性的生活質量和身心健康。

1 白假絲酵母菌生物膜

白假絲酵母菌生物膜是由大量菌絲相細胞、少量酵母相細胞及細胞外基質(extracellular polymeric substances,EPS)組成的復雜結構，大量的菌絲相酵母菌可維持生物膜的完整性并構成生物膜的三維立體結構。

白假絲酵母菌生物膜的形成分為四個發(fā)展階段：早期階段(基底細胞黏附)、中間階段(生物膜初步形成)、成熟階段(生物膜成熟)以及擴散階段(生物膜擴散)[3]。在早期階段，酵母細胞黏附于陰道黏膜表面，此過程是生物膜形成的關鍵步驟，且黏附力的強弱與致病性和耐藥性之間呈正相關[4]，隨后酵母細胞通過增殖擴散產生菌落，進而形成生物膜的基底層。酵母細胞轉變?yōu)榫z相，Lagree等[5]觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲具有較強的黏附力，可形成高度纏繞的生物膜，具有侵襲性和毒性，這些特性增加了生物膜的厚度和復雜性。隨著菌絲的出現(xiàn)和包裹著酵母和菌絲的EPS產生，生物膜的發(fā)展進入了高代謝活動的中間階段。EPS作為生物膜重要的組成部分，為細胞的聚集和黏附提供一個支架并維持生物膜的結構，同時也是細胞吸收水分和營養(yǎng)的必經通道。在成熟階段，細胞外基質物質大量積累，形成復雜的生物膜結構。生物膜形成的最后一步被認為是細胞的釋放，脫落的酵母細胞作為種子傳播，通過細胞增殖擴散形成新的生物膜，這也是播散性感染的原因[4]。

白假絲酵母菌生物膜成熟是VVC致病的基礎。生物膜內存在簡單的循環(huán)系統(tǒng)，有利于營養(yǎng)物質的交換，為生物膜內真菌提供適宜的生存環(huán)境，當生物膜內微環(huán)境高度協(xié)調，致密的胞間基質將假絲酵母菌包被其中，建立物理屏障，增強了對化學消毒劑、宿主防御等負性刺激的抵抗力，且人體宿主免疫系統(tǒng)不能有效將其清除。生物膜中有一部分致病菌處于休眠狀態(tài)，此類致病菌其活性降低且EPS延緩抗真菌藥物的滲透，有利于菌間發(fā)生表型轉化以及耐藥基因的形成、表達、進化及共享，表現(xiàn)出更強的耐藥性，使VVC易于反復發(fā)作。

2 陰道局部免疫

為更好地理解生物膜狀態(tài)下白假絲酵母菌免疫逃避機制，首先簡單介紹免疫系統(tǒng)清除浮游態(tài)假絲酵母菌時發(fā)生的變化。當接觸白假絲酵母菌后先天免疫系統(tǒng)快速激活，通過吞噬作用釋放抗菌肽和細胞因子清除白假絲酵母菌。先天性免疫發(fā)揮作用后，是由T淋巴細胞和B淋巴細胞介導的適應性免疫。

2.1 先天性免疫 外陰及陰道獨特的解剖結構及生理特點是阻擋白假絲酵母菌入侵機體的重要天然屏障。清除白假絲酵母菌在很大程度上依賴于陰道黏膜上皮細胞、中性粒細胞及巨噬細胞等先天免疫細胞的吞噬作用[6]，其中中性粒細胞發(fā)揮主要作用[7]。陰道黏膜表面上皮細胞是最先與白假絲酵母菌接觸的細胞，通過模式識別受體(pattern recognition receptors,PRR)與白假絲酵母菌上的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相結合，對其進行識別進而啟動相關免疫應答[6]。中性粒細胞、樹突細胞、巨噬細胞、B細胞和T細胞也表達PRR。PRR可分為3類：Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)、C型凝集素樣受體(C-type lectin receptor,CLR)和甘露糖結合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)等。通過受體識別，刺激免疫細胞分泌抗菌肽(antimicrobial peptide AMP)、細胞因子和趨化因子，如IL-37、防御素、IL-1α、IL-1β、IL-6及IL-8等。IL-37能與白假絲酵母菌細胞壁結合，使其黏附能力下降。細胞因子和趨化因子可趨化中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞募集到感染部位。巨噬細胞吞噬假絲酵母菌，加工呈遞特異性抗原，并分泌TNF-α和IL-1，募集并活化中性粒細胞，發(fā)揮吞噬和殺菌作用，中性粒細胞還能通過壞死或凋亡方式形成中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs)，捕獲并殺死白假絲酵母菌，NETs對清除假絲酵母菌至關重要[8]。

2.2 適應性免疫 陰道局部的特異性免疫，包括細胞免疫和體液免疫。(1)細胞免疫。T淋巴細胞及B淋巴細胞都參與細胞免疫應答，以T淋巴細胞更為重要。T淋巴細胞按其功能和表面標志可分為4個亞型，輔助性T細胞(Th)、殺傷性T細胞(Tc)、抑制性T細胞(Ts)及遲發(fā)型超敏反應T細胞[7]。其中以Th為代表的細胞免疫為主。Th細胞可在細胞因子誘導下分化為3種細胞Th1、Th2、Th17，進而調節(jié)免疫過程。Th1免疫反應在防御假絲酵母菌中起關鍵作用，產生的細胞因子，如IL-1、IL-2及IFN-γ可激活巨噬細胞和中性粒細胞[7]。Th17細胞分泌細胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22，使中性粒細胞募集到感染部位并驅動上皮細胞產生細胞因子、趨化因子和抗菌肽。抗菌肽具有抑制生物膜形成、破壞生物膜結構及殺死假絲酵母菌的能力。Th2細胞分泌IL-4、IL-5和IL-13，阻礙假絲酵母菌清除。目前普遍認為，Th1、Th17細胞可促進免疫對假絲酵母菌的清除，Th2則對病原菌清除起相反作用[9]。(2)體液免疫。陰道基底層的淋巴細胞群可產生各類抗體并分布于分泌液中，其中起重要作用的是sIgA，其他免疫球蛋白在抗感染中也起一定作用。研究表明[10]，在VVC患者的陰道灌洗液中，sIgA、IgG水平較健康組明顯升高。在對小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，在假絲酵母菌初次感染和再次感染的任何階段均可在陰道灌洗液中檢測出假絲酵母菌特異性抗體sIgA及IgG。由此可見，體液免疫在清除白假絲酵母菌和防止其過度生長方面也發(fā)揮一定的作用。

3 白假絲酵母菌生物膜逃避宿主免疫機制

當生物膜形成并成熟后，能采用精準策略長期逃避宿主免疫細胞的識別和清除，使免疫系統(tǒng)無法清除生物膜，可總結為以下兩方面。

3.1 生物膜抵抗宿主免疫 (1)干擾PRR識別。生物膜狀態(tài)下，模式識別受體TLR2、TLR4含量減少。EPS包裹假絲酵母菌細胞壁表面的PAMP，阻止TLR2、TLR4識別假絲酵母菌，逃避免疫追蹤。(2)阻礙中性粒細胞、巨噬細胞清除。與浮游狀態(tài)相比，生物膜對中性粒細胞殺傷的抵抗力高出5倍以上，中性粒細胞對防御假絲酵母菌感染至關重要[8]，通過釋放NETs，抑制真菌的生長和傳播。在生物膜狀態(tài)下，釋放的NETs大幅度減少，而相比處于浮游狀態(tài)的假絲酵母菌，中性粒細胞會在4h內釋放大量NETs以清除致病菌。當通過物理或基因手段破壞EPS后，中性粒細胞又恢復釋放NETs的能力。研究發(fā)現(xiàn)[8]，EPS中的葡聚糖阻止中性粒細胞形成NETs。此外，生物膜抑制中性粒細胞產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。ROS是參與NETs生成的重要信號通路，與浮游狀態(tài)相比，ROS含量減少4倍。這些研究表明，生物膜可通過直接與間接方式抑制NETs釋放，有助于免疫逃避，為假絲酵母菌提供生存優(yōu)勢，但如能解決這種抑制作用，NETs將是破壞生物膜的有效方式[11]。生物膜結構保護白假絲酵母菌免受巨噬細胞的識別與殺傷，抑制巨噬細胞的遷移，并且菌絲相假絲酵母菌可通過物理穿透方式殺死巨噬細胞，從而使假絲酵母菌從巨噬細胞內逃逸[12]。(3)減少細胞因子、抗體分泌量。研究表明[12-13]，生物膜組細胞因子IL-1、IFN-γ及TNF-α表達量明顯低于健康對照組，抑制吞噬細胞活化。Pra1、Gpd2、Msb2基因在生物膜形成過程中高度表達，Pra1、Gpd2基因能單獨阻斷補體激活，抑制陰道免疫球蛋白sIgA作用[14]。Msb2基因可編碼一種黏蛋白，結合宿主分泌的抗菌肽，阻礙抗菌肽發(fā)揮作用。(4)破壞陰道組織結構。白假絲酵母菌可分泌細胞外水解酶，其中分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)被認為是最關鍵的毒力因子之一，因為它與宿主免疫系統(tǒng)的黏附、侵襲、組織損傷和逃避有關，能水解各種宿主蛋白質，破壞陰道黏膜屏障，細長的菌絲還可穿透組織造成組織損傷[2]。Sap還可降解補體因子C3b，從而抑制免疫細胞識別和吞噬。

3.2 生物膜促使免疫偏移，將有效免疫轉化為無效免疫 Netea等[15]研究發(fā)現(xiàn)，生物膜可產生使免疫發(fā)生偏移的影響因子，這些因素可直接或間接驅動免疫偏移。

細胞因子IL-1、IFN-γ及TNF-α分泌減少，阻礙Th分化為Th1細胞，致使Th1型免疫應答減弱。細胞因子IL-4含量明顯增高且白假絲酵母菌細胞壁成份誘導IL-10表達[15]，促進Th分化為Th2，觸發(fā)Th2型免疫應答。

由此可見，生物膜成熟后，可通過阻止免疫細胞PRR識別，干擾中性粒細胞、巨噬細胞功能，降低細胞因子、趨化因子含量，破壞陰道局部黏膜組織，還可將有效免疫轉化為無效免疫等方式逃避免疫系統(tǒng)的識別與清除，使免疫系統(tǒng)無法清除生物膜結構。

4 治療思路

通過對生物膜的形成過程及免疫逃避策略的綜述，可以得出，治療VVC的關鍵在于干擾生物膜的形成及其作用發(fā)揮、提高陰道局部免疫力等方面。

4.1 干擾生物膜形成及其作用發(fā)揮 (1)干擾群體感應系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，在生物膜的形成過程中，群體感應系統(tǒng)發(fā)揮著重要作用。群體感應(QS)是微生物之間的通訊機制，介導生物膜的形成。QS系統(tǒng)通過監(jiān)測來控制整個細胞群體的生長、代謝等行為，以確保生物膜中微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)與代謝物的正常分泌，避免營養(yǎng)缺乏等，為菌體生長及生物膜形成提供保障。法尼醇是一種由白假絲酵母菌產生的胞外群體感應分子，而一定濃度的法尼醇可抑制酵母相至菌絲相的轉換[16]，并且可把生物膜保持在靜止狀態(tài)從而抑制其生成[4]。Paluch等[17]研究了群體猝滅(QQ)技術，可中斷微生物的交流。故可通過分子手段抑制信號分子的生成，研制信號分子競爭抑制劑等方式靶向破壞QS系統(tǒng)從而抑制生物膜形成。(2)抑制EPS形成。研究表明，EPS有以下功能：維持生物膜的穩(wěn)定性；延緩抗菌藥物滲透，使致病菌產生耐藥性；抗宿主免疫作用。通過研制抑制EPS形成、破壞EPS的蛋白酶，阻礙生物膜功能的正常發(fā)揮。(3)阿司匹林。Alem等[18]在白假絲酵母菌生物膜形成的不同階段加不同濃度的環(huán)氧酶抑制劑阿司匹林和前列腺素E2，發(fā)現(xiàn)其可抑制生物膜形成的各個階段，且抑制程度與藥物濃度成正相關，阿司匹林對成熟生物膜亦有抑制作用。(4)硼酸。有研究表明，硼酸具有抑制假絲酵母菌生物膜的作用。其作用機制為抑制生物膜形成過程中所需的氧化代謝反應，從而抑制生物膜形成[19]。(5)抗菌肽。Fais等[20]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽hLFl-11可通過顯著降低生物膜細胞密度和代謝活性，下調生物膜形成相關基因表達。MAF-1是經免疫誘導后從家蠅幼蟲血淋巴中分離得到的一個新型抗真菌肽。羅振華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，隨著MAF-1藥物劑量及作用時間的增加，抑制生物膜形成作用增強，菌絲形成減少，部分酵母菌出現(xiàn)一個或多個穿孔，嚴重的呈碎片狀，正常的代謝反應發(fā)生紊亂。提示抗菌肽對生物膜形成具有較好的抑制作用。(6)其他。桑黃正丁醇提取物、白頭翁湯正丁醇提取物、藁本揮發(fā)油、大蒜素、去甲亞精胺等均可抑制生物膜形成。

4.2 提高陰道局部免疫能力 (1)臭氧。臭氧對陰道局部的免疫反應具有促進作用。通過激活巨噬細胞和吞噬細胞的免疫應答，提高NK細胞的殺菌活性，增強局部組織抵抗力，臭氧還可對各類DNA依賴的細胞因子和抗體的產生具有促進作用，從而影響細胞免疫和體液免疫的作用，加快免疫調節(jié)[22]。(2)乳酸菌活菌制劑。乳酸菌活菌制劑可刺激宿主的陰道局部免疫，加強吞噬細胞的吞噬能力，增強T細胞的增殖、分化和產生細胞因子的能力，可在循環(huán)中誘導特異性IgG分泌，提高黏膜的屏障作用，增強宿主免疫防御功能。乳酸菌可降低VVC的患病率，研究發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌發(fā)酵上清液可顯著抑制初始黏附和菌絲形成、降低胞外多糖的含量來抑制白假絲酵母菌生物膜的形成[23]。

5 結 語

綜上所述，陰道免疫防御可清除浮游狀態(tài)的白假絲酵母菌，恢復陰道微生態(tài)的平衡，進而控制陰道炎癥。但當白假絲酵母菌生物膜形成后，通過一系列手段逃避免疫系統(tǒng)的識別與清除，使VVC反復發(fā)作。此外，生物膜的三維網狀結構決定了生物膜本身抵抗力強，其內致病菌易產生耐藥基因，使抗真菌藥物治療效果欠佳，導致治療VVC難度進一步增加。通過提高陰道局部免疫與干擾生物膜形成及其作用發(fā)揮等方法，對治療VVC有較好的臨床效果。此外，應進一步研究生物膜的結構和成份、生物膜的作用機制，更深一步了解生物膜與VVC之間的關系，為未來靶向治療VVC提供可能。