粉防己堿抗腫瘤作用機制的研究進(jìn)展

尚雯倩，張艾民，付 燕，孔 寧，劉新苑

(1. 山東省淄博市婦幼保健院，山東 淄博 255000；2. 山東理工大學(xué)，山東 淄博 255000)

粉防己堿又名漢防己甲素，是一種雙芐基異喹啉類生物堿，主要從中藥粉防己(Stephania tetrandra S. Moor)根中提取，屬于天然產(chǎn)物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為 2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，分子式為C38H42N2O6，呈無色針狀結(jié)晶，幾乎不溶于水?，F(xiàn)代藥理研究顯示，粉防己堿具有多種生物活性，包括鈣通道阻滯劑、抗炎、免疫抑制、抗過敏、抗氧化，抗癌，抗菌等作用[1]。近年來針對粉防己堿抗腫瘤作用的研究越來越多，其對肝癌、腎癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、口腔癌和前列腺癌等[2-9]多種腫瘤均有明顯抑制作用。本文主要從以下幾個方面，對粉防己堿抗腫瘤作用機制進(jìn)行綜述，以進(jìn)一步探討其作為抗腫瘤藥物的前景。

1 抑制腫瘤細(xì)胞增殖

細(xì)胞增殖是細(xì)胞物質(zhì)積累與細(xì)胞分裂的循環(huán)過程，是通過細(xì)胞周期來實現(xiàn)的。腫瘤進(jìn)展過程中，異常細(xì)胞分裂導(dǎo)致的細(xì)胞增殖常伴有細(xì)胞周期的失調(diào)[10]。細(xì)胞周期的各個階段是由周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)和細(xì)胞周期蛋白協(xié)同控制的。因此，細(xì)胞周期蛋白可作為癌癥治療的潛在靶點[11]。

有研究顯示粉防己堿可以抑制Huh-7肝癌細(xì)胞的增殖，藥物作用24 h和48 h后的IC50分別是20.8和8.0 μM[2]。隨著粉防己堿濃度的增加，S期和G2期細(xì)胞百分率下降，G1期細(xì)胞百分率上升。Chen等[3]發(fā)現(xiàn)粉防己堿對786-O,769-P和ACHN腎癌細(xì)胞系均有抑制作用。其研究表明，粉防己堿可以通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白p21 WAF1/CIP1和p27(kip1)誘導(dǎo)G1期細(xì)胞阻滯。此外，粉防己堿可抑制小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞增殖，通過下調(diào)cyclin D、cyclin E和CDKs的表達(dá)，使G1/S期細(xì)胞阻滯[12]。Wu等[13]研究發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以通過靶向Wnt/β-catenin通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-5參與了結(jié)腸癌的發(fā)生，外源性的IGFBP-5可以減弱粉防己堿的抗癌作用，但I(xiàn)GFBP-5敲除后粉防己堿的抗癌作用增強。實驗數(shù)據(jù)表明粉防己堿可能是通過將調(diào)節(jié)IGFBP-5的表達(dá)，以抑制Wnt/β-catenin信號通路。

2 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是受到特定刺激后，細(xì)胞發(fā)生的程序性死亡的過程[14]。細(xì)胞凋亡主要由兩種途徑引發(fā)：一種是死亡配體與死亡受體的結(jié)合，另一種是由“線粒體”起始的內(nèi)源性途徑[15]。近年來發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的新凋亡途徑。誘導(dǎo)凋亡信號分子的失控和促凋亡基因的突變，會引起腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[16]。目前研究報道了粉防己堿通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.1線粒體途徑 當(dāng)線粒體受到刺激后，會釋放凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，引發(fā)細(xì)胞凋亡。常見的凋亡相關(guān)因子，如Bcl-2、細(xì)胞色素 C、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、線粒體衍生的第二種半胱天冬酶激活劑(Smac)、高溫應(yīng)激蛋白 A2(HtrA2)、核酸內(nèi)切酶G等。蛋白酶 caspase是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)器，分為凋亡起始者和凋亡執(zhí)行者。受到外界刺激后，凋亡起始者(如caspase-9)可以激活凋亡執(zhí)行者(如 caspase-3、7)，從而引發(fā)凋亡[17]。Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)粉防己堿不僅抑制SiHa細(xì)胞的增殖，而且在體內(nèi)可以抑制宮頸癌腫瘤體積和質(zhì)量的增長。體內(nèi)外均實驗顯示粉防己堿可通過上調(diào)活化的caspase 3的表達(dá)，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。ROS主要由線粒體產(chǎn)生，可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。有研究顯示粉防己堿可以通過提高ROS的水平，激發(fā)促凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3的表達(dá)，以誘導(dǎo)乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞的凋亡[20]。粉防己堿還可以引起人口腔癌cal27細(xì)胞ROS的積累，并促進(jìn)細(xì)胞色素C、AIF、Bax和活化caspase-3, 28, 29的表達(dá)，降低Endo G的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。Tao等[22]實驗顯示，粉防己堿處理過的U2-OS和MG-63骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞色素c、Apaf-1、Bax表達(dá)增加，Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)減少。說明粉防己堿可通過線粒體途徑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種重要的細(xì)胞器，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白增加或鈣離子穩(wěn)態(tài)改變時，可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)[23]。嚴(yán)重持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路中的信號分子CHOP/GADD153、Bcl-2、ATF4、JNK、ATF6f、Caspase-12等及凋亡蛋白抑制劑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中都起到重要作用[24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78是UPR的主調(diào)節(jié)器，具有阻斷細(xì)胞凋亡的能力，在惡性腫瘤中呈過度表達(dá)[25]。Lin等[4]通過對人鼻咽癌NPC-TW 076細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，粉防己堿可引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，引發(fā)細(xì)胞G0/G1期阻滯，增加ROS和Ca2+的產(chǎn)生。Western blot實驗顯示粉防己堿可以增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白如GADD153,GRP78,ATF-6α和ATF-6β的表達(dá)。另有研究者發(fā)現(xiàn)粉防己堿作用NPC-TW 039細(xì)胞24 h后GRP78和GADD153蛋白的表達(dá)會增加，表明粉防己堿可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞死亡[26]。

2.3其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 經(jīng)典細(xì)胞信號通路PI3K/AKT、MAPK、JAK-STAT等與腫瘤生長和凋亡密切相關(guān)。Tian等[27]發(fā)現(xiàn)粉防己堿可通過激活骨肉瘤143B細(xì)胞中的p38 MAPK來上調(diào)PTEN，從而發(fā)揮抗癌作用。Chen等[28]研究顯示，粉防己堿可通過上調(diào)TGF-β1，減少PTEN的磷酸化，以抑制PI3K/Akt信號通路，以誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的凋亡。此外，粉防己堿可以抑制肺癌的生長，通過激活PARP-Akt-Bax和VEGF/HIF-1α/ICAM-1細(xì)胞通路，發(fā)揮誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞的凋亡[29]。另有實驗顯示粉防己堿在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[30]。粉防己堿可以減少膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞p-STAT3和其下游蛋白Bcl-2、CyclinD1、HIF-α、VEGFA的表達(dá)。說明粉防己堿可通過抑制STAT3磷酸化來抑制細(xì)胞存活、增殖和腫瘤血管生成，從而抑制膠質(zhì)瘤的生長。

3 細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是受細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞成分調(diào)節(jié)的動態(tài)過程，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)容物被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體吞沒，隨后與溶酶體融合，裂解酶降解并循環(huán)利用[31]。細(xì)胞自噬在細(xì)胞生存和死亡之間起到平衡作用[32]。在癌細(xì)胞中，自噬具有雙重作用，是腫瘤發(fā)生和治療的重要途徑[33]。自噬的發(fā)生機制涉及多個過程和信號通路。mTOR在細(xì)胞自噬中起著門控作用，可與ULK復(fù)合體結(jié)合使其失活，抑制自噬。Beclin-1是自噬核心復(fù)合物中重要的組成部分, 也是自噬能否得以活化的關(guān)鍵, 體外實驗表明激活Beclin-1活化自噬可以抑制腫瘤的發(fā)生[34]。Beclin1、LC3和p62是自噬的主要參與者，可用于細(xì)胞自噬水平的評估。

Guo等[5]實驗顯示12.8，16.1和25.7 μmol/L濃度的粉防己堿對三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。粉防己堿通過降低p62/SQSTM1表達(dá)，提高Beclin1和LC3-II/LC3-I的表達(dá)，抑制PI3K/AKT/mTOR通路(降調(diào)p-AKT、ser473/AKT、p-PI3K/PI3K p110α、p-mTORser2448/mTOR和升高PTEN的表達(dá))誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬。Wong等[35]將粉防己堿作用于多種細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)自噬潮及自噬小體，進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)粉防己堿通過mTOR依賴誘導(dǎo)自噬。有研究發(fā)現(xiàn)粉防己堿可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的自噬，可以降調(diào)自噬相關(guān)蛋Beclin-1、LC3-II、p62的表達(dá),減少AKT/mTOR、PS6K和P-4EBP1的磷酸化[36]。當(dāng)加入自噬抑制劑3-MA或Baf-A1，會增加粉防己素堿加藥細(xì)胞的活力，證實了自噬在胃癌中的作用。粉防己堿通過誘導(dǎo)Akt/mTOR通路的自噬和凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。多位學(xué)者研究顯示粉防己堿也可以誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞的自噬。經(jīng)粉防己堿處理后，SAS和CAL27細(xì)胞LC3-I、LC3-II、Atg-5和beclin-1蛋白的表達(dá)水平均升高，用siRNA敲除Atg-5、beclin-1后，與對照組相比，粉防己堿組細(xì)胞增殖明顯下降?？梢娫诜鄯兰簤A誘導(dǎo)SAS和CAL27細(xì)胞自噬中，Atg-5和beclin-1的上調(diào)起著關(guān)鍵作用。對于口腔癌HSC-3細(xì)胞粉防己堿也是主要通過Beclin-1/LC3-Ⅰ、Ⅱ信號通路誘導(dǎo)其自噬[8]。

4 抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲

腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲離不開腫瘤血管的生成[38]。據(jù)報道，MMPs表達(dá)水平的升高與癌細(xì)胞血管生成、遷移和侵襲水平的升高有關(guān)[39]。常用MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平評估癌細(xì)胞的入侵和遷移。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)粉防己堿作用的腎癌786-O和769-P細(xì)胞Akt、NF-κB、MMP-9蛋白的表達(dá)量均顯著下降[40]，說明粉防己堿可通過調(diào)節(jié)Akt/NF-κB/MMP-9信號通路來抑制腎癌在體外的遷移和侵襲。Liu等[41]通過劃痕實驗和transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以抑制前列腺癌DU145和PC-3細(xì)胞的遷移和侵襲。Juan等[42]發(fā)現(xiàn)粉防己堿顯著降低了結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的遷移率，10 μM粉防己堿作用24 h和48 h，與對照組相比將抑制遷移率分別提高到176.74和183.45%。Westernblot實驗顯示粉防己堿可顯著降低該細(xì)胞系MMP-2、MMP-9、MMP-1和TIMP1蛋白表達(dá)水平，并呈濃度依賴性。

5 逆轉(zhuǎn)多藥耐藥

化療是癌癥治療的常用方法，但多藥耐藥嚴(yán)重影響了化療的療效。目前常用化療藥如順鉑、卡鉑、5-氟尿嘧啶及紫杉醇等，雖然療效確切，但不良反應(yīng)多，易產(chǎn)生多藥耐藥。因此，尋找抗多藥耐藥的新型藥物，是抗癌藥物抵抗問題的潛在方向[43]。這些藥物與抗癌藥物聯(lián)合作用，通過提高細(xì)胞內(nèi)藥物存留，恢復(fù)細(xì)胞對化療藥物敏感性，以提高抗癌作用。

Ye等[44]研究發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以提高順鉑耐藥細(xì)胞A549對順鉑的敏感性，而且粉防己堿與順鉑聯(lián)合用藥，與順鉑單藥組比，可更好地抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)自噬。粉防己堿還可在體內(nèi)外增強順鉑對人卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[45]。通過調(diào)控Wnt/cadherin信號通路粉防己堿可提高卵巢癌對順鉑的敏感性。Yuan等[46]將亞砷酸鹽、粉防己堿及兩者聯(lián)合用藥分別作用于MDA-MB-231荷瘤小鼠10周，腫瘤體積與空白組相比分別減少了35.8%，37.2%，51.6%，腫瘤重量聯(lián)合組也明顯輕于單藥組。通過說明粉防己堿可以提高亞硫酸鹽的體外抗腫瘤活性。此外，粉防己堿還可與紫杉醇、氯喹、蛋白酶抑制劑H89協(xié)同提高抗腫瘤作用[47-49]。

6 提高放療敏感性

放療是惡性腫瘤的另一種重要治療方法?？鼓[瘤藥物不僅可以與其他化療藥物聯(lián)合作用，還可以配合放療以增強腫瘤細(xì)胞對放射線的敏感性，以增強抗癌效果。Zhao等[50]發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以增強肝癌細(xì)胞HepG2和LM3放療的敏感性，并且隨粉防己堿濃度的增加，敏感性增強。Westernblot實驗顯示粉防己堿與放療聯(lián)合作用組凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-3的表達(dá)較單獨作用組均明顯下降。Wang等[51]將放療和最大無細(xì)胞毒劑量粉防己堿聯(lián)合處理鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2，細(xì)胞的生存率顯著降低。兩者聯(lián)合作用可抑制CDK1和CDC25C的磷酸化，增加cyclin B1的表達(dá)。說明粉防己堿可通過CDC25C/CDK1/cyclin B1途徑增強鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性。此外，粉防己堿可通過降低磷酸化ERK及其下游蛋白的表達(dá)來提高人腦膠質(zhì)瘤的放療敏感性[52]。

7 討 論

癌癥是全球人類死亡的主要原因，隨著人口的增長和老齡化，癌癥的發(fā)病率還會增加，這種趨勢在欠發(fā)達(dá)地區(qū)尤其嚴(yán)重[53]。WHO組織預(yù)測到2030年，全球癌癥死亡人數(shù)將達(dá)到1 140萬[54]。傳統(tǒng)抗癌藥物常易引起嚴(yán)重胃腸反應(yīng)、骨髓抑制、肝腎毒性等明顯不良反應(yīng)。天然藥物容易獲得、不良反應(yīng)少，可作為抗癌藥物研究的重點[55]。

粉防己堿是一種典型的天然藥物，目前對粉防己堿抗腫瘤機制的研究，主要集中在抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡，引發(fā)自噬，抑制遷移和侵入，逆轉(zhuǎn)多藥物耐藥性及放療增敏等方面。粉防己堿抗腫瘤分子機制是復(fù)雜多樣的，既往研究主要針對caspase、PI3K/Akt、MAPK、Wnt/β-catenin等通路及自噬相關(guān)蛋白。對其他通路如NF-κB、Notch、JNK等及調(diào)控靶點的研究較少，而且對細(xì)胞信號通路的研究不夠深入，大多未深入研究影響通路的機制。其次，由于癌癥的復(fù)雜性，涉及多個信號通路，單一化合物很難對抗癌癥，可重點研究粉防己堿聯(lián)合用藥或聯(lián)合治療等方面。再次，目前的研究主要局限于體外研究，應(yīng)繼續(xù)加強體內(nèi)研究，適當(dāng)進(jìn)行一些臨床試驗。同時需要更多的基于機制的藥理學(xué)、代謝、藥代動力學(xué)和毒理學(xué)研究。雖然粉防己堿是一種潛在的抗腫瘤藥物，但存在生物利用度低的問題。因此，我們應(yīng)重點加強對遞藥方式(如合成納米粒子)或改變粉防己堿分子式(如將其鹽化)的研究，以提高生物利用度，才能開發(fā)利用，應(yīng)用于臨床。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。