微小RNA調(diào)控牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化的研究進(jìn)展

胡榮榮 王玉良

【關(guān)鍵詞】 牙髓干細(xì)胞 微小RNA 成牙本質(zhì)向分化

[Key words] Dental pulp stem cells microRNA Odontogenic differentiation

First-author’s address： School of Stomatology， Binzhou Medical University， Yantai 264000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.26.045

作為嚴(yán)重威脅人們口腔健康的疾病之一，齲病可繼發(fā)牙髓炎、根尖周炎，甚至各種頜骨炎癥，最終造成牙體缺損、甚至牙體缺失。與其他組織（如骨組織）相比，受損后具有自我修復(fù)和重塑的能力，牙體組織則不容易完全再生且修復(fù)程度有限[1]。目前，缺損的牙體組織主要依賴(lài)口腔充填材料修復(fù)，且無(wú)法完全恢復(fù)牙齒的生物學(xué)性能。所以，牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）在組織再生領(lǐng)域的相關(guān)研究受到越來(lái)越多患者及科學(xué)家的普遍關(guān)注。

DPSCs是一類(lèi)來(lái)源于牙髓組織的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），可在活髓組織中分離和培養(yǎng)，有較強(qiáng)的增殖、自我更新能力以及分化為多種細(xì)胞的潛能，且容易獲得、來(lái)源較為豐富、對(duì)供體損傷不大、不涉及倫理問(wèn)題，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣闊[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）作為內(nèi)源性RNA，大量存在于生物體內(nèi)，同時(shí)，在轉(zhuǎn)錄后相關(guān)基因的調(diào)控中具有不可替代作用，參與諸多生物發(fā)生過(guò)程，如細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡等[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA參與牙齒的發(fā)育和再生[4]。

1 DPSCs

人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）是外胚層來(lái)源的成體干細(xì)胞，源于遷移的神經(jīng)嵴細(xì)胞[5]。2000年，由Gronthos等[6]首次分離、鑒定及命名。在體內(nèi)和體外適宜培養(yǎng)條件下，DPSCs可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞[7]，其中牙向分化能力在口腔相關(guān)研究中非常重要。成骨誘導(dǎo)可顯著增強(qiáng)DPSCs的礦化能力，同時(shí)以HA/TCP為載體與DPSCs結(jié)合，可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生牙本質(zhì)/牙髓樣復(fù)合物[6，8]，以此證明了DPSCs良好的組織再生能力。

2 miRNA

只有1%～2%的RNA分子可翻譯成蛋白質(zhì)，稱(chēng)為編碼RNA，大多數(shù)是非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）[9]。作為一類(lèi)重要的ncRNA，miRNA由19～25個(gè)核苷酸組成，長(zhǎng)度為18～22 nt。最早發(fā)現(xiàn)的2個(gè)miRNA分別是lin-4和let-7[10-11]，且都存在于線蟲(chóng)體內(nèi)。miRNA不僅可以降解mRNA的翻譯，還能抑制mRNA的翻譯，負(fù)性調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[11]。核酸酶Dicer在miRNA形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，文獻(xiàn)[12]研究報(bào)道，條件性敲除小鼠的Dicer1會(huì)導(dǎo)致牙齒原有的大小和形狀發(fā)生改變，這表明牙齒的發(fā)育受到miRNA的嚴(yán)格調(diào)控。

3 DPSCs和miRNA

3.1 miRNA在DPSCs成牙本質(zhì)向分化中的作用 miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)信使RNA（mRNA）向蛋白質(zhì)翻譯，在所有生物活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。miRNA具有明顯的特異性，即不僅在不同物種、組織及細(xì)胞間會(huì)有不同的表達(dá);而且在相同物種、組織及細(xì)胞發(fā)育的不同時(shí)期，其表達(dá)也不盡相同[14]。呂紅兵等[15]指出，與非DPSCs對(duì)比，DPSCs中表達(dá)超過(guò)2倍的miRNA有14個(gè)，其中有11個(gè)上調(diào)和3個(gè)下調(diào);同時(shí)推測(cè)，表達(dá)譜的差異可能與細(xì)胞干性有關(guān)。有研究利用PCR對(duì)104種已知miRNA分析發(fā)現(xiàn)，與BM-MSCs相比，DPSCs中差異表達(dá)的miRNA共有48個(gè)，其中上調(diào)的19個(gè)，下調(diào)的29個(gè)[16]。Gong等[3]使用微陣列分析來(lái)篩選和比較hDPCs牙源性分化過(guò)程中miRNA譜的變化，發(fā)現(xiàn)有22個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中12個(gè)上調(diào)，10個(gè)下調(diào)。

miRNA對(duì)于DPSCs成牙本質(zhì)向分化的調(diào)控具有雙向作用，它不僅可以促進(jìn)成牙本質(zhì)向分化，還可以抑制此過(guò)程[9]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-720在明顯降低其增殖能力的同時(shí)，可促進(jìn)DPC成牙本質(zhì)向分化;同時(shí)指出，miR-720將成為DPC分化過(guò)程中的新型miRNA[17]。研究利用miR-210模擬物和抑制物調(diào)節(jié)DPSCs中miR-210的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-210可促進(jìn)DSPP、DMP1 mRNA及蛋白的表達(dá);抑制其表達(dá)，則結(jié)果相反。從而提示miR-210在DPSCs成牙本質(zhì)向分化過(guò)程中起正向調(diào)節(jié)作用，不過(guò)，其中作用機(jī)制需進(jìn)一步研究[18]。邱在玲等[19]通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs過(guò)表達(dá)miR-146a-5p，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組中成牙分化標(biāo)志物（Dspp、Dmp1）表達(dá)顯著上調(diào)，由此證明miR-146a-5p正向調(diào)控hDPSCs牙向分化。Chang等[4]發(fā)現(xiàn)miR-218在DPSCs中表達(dá)下調(diào)，且miR-218模擬物可顯著降低DPSCs的增殖和分化能力。吳韞慧等[20]發(fā)現(xiàn)，miR-431在DPSCs成牙分化過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，成牙分化標(biāo)志物表達(dá)顯著上調(diào)，推測(cè)miR-431負(fù)向調(diào)控成牙本質(zhì)向分化。另外，還有較多miRNA正向調(diào)節(jié)DPSCs牙向分化，如miR-21、miR-223、miR-27a-5p、miR-125a-3p、miR-135b[3，21-24];而miR-143、miR-145、miR-488則可負(fù)向調(diào)節(jié)這一過(guò)程[25-26]。

Liu等[25]利用微陣列分析小鼠DPSCs中miRNA的表達(dá)，其中，miR-143和miR-145下調(diào)最明顯，可與KLF4形成調(diào)節(jié)反饋環(huán)抑制Dspp和Dmp1 mRNA及蛋白的表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)控牙向分化。成牙本質(zhì)向分化過(guò)程中，這是首個(gè)涉及miRNA的反饋環(huán)調(diào)控報(bào)道。Quaking（QKI）是STAR家族的成員之一，作為RNA結(jié)合蛋白直接與RNA結(jié)合，存在于各種細(xì)胞類(lèi)型中，影響RNA代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。隨后的文獻(xiàn)[27]研究中發(fā)現(xiàn)，QKI不僅可以作為KLF4的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（competent endogenous RNA，ceRNA），通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)其共有的miRNA（miR-124-3p、miR-128-3p、miR-145-5p、miR-429）上調(diào)KLF4來(lái)促進(jìn)hDPSCs成牙本質(zhì)向分化，還可作為DSPP mRNA的結(jié)合蛋白來(lái)促進(jìn)hDPSCs的成牙本質(zhì)向分化。

每個(gè)miRNA可以靶向調(diào)控多個(gè)mRNA;同時(shí)，每個(gè)mRNA也可以由多個(gè)miRNA靶向調(diào)控。一方面，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平抑制或降解mRNA翻譯;另一方面，miRNA似乎還具有后續(xù)作用，可能通過(guò)相應(yīng)反調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮其他mRNA水平及蛋白質(zhì)相互作用[16]。

3.2 miRNA調(diào)控DPSCs成牙本質(zhì)向分化中相關(guān)的信號(hào)通路 DPSCs成牙本質(zhì)向分化過(guò)程中受多種因素（如miRNA、信號(hào)通路等）調(diào)控。包括細(xì)胞分化在內(nèi)的諸多生物發(fā)生過(guò)程都離不開(kāi)miRNA的參與。已有研究證明，miRNA通過(guò)相關(guān)信號(hào)途徑在DPSCs成牙本質(zhì)向分化中發(fā)揮重要作用。

3.2.1 Notch信號(hào)通路 邱在玲等[28]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-146a-5p表達(dá)后，DPSCs增殖能力下降，然而可顯著促進(jìn)DPSCs分化;反之，則結(jié)果相反。利用siRNA-Notch1轉(zhuǎn)染DPSCs來(lái)干擾Notch信號(hào)，可促進(jìn)DPSCs分化而抑制其增殖，Notch1作為miR-146a-5p的直接靶點(diǎn)，由此證明，miR-146a-5p可通過(guò)Notch1參與調(diào)控Notch信號(hào)通路，在促進(jìn)DPSCs分化中發(fā)揮重要作用。

3.2.2 NF-κB信號(hào)通路 Wang等[23]指出miR-125a-3p可能與齲齒的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，在齲齒中，侵入髓腔的病原體通過(guò)釋放各種炎癥因子導(dǎo)致DPSCs中miR-125a-3p表達(dá)增加，致使Fyn上調(diào)。Fyn與NRP1相互作用形成NRP1-Fyn復(fù)合物來(lái)激活NF-κB信號(hào)通路。結(jié)果顯示，DPSCs的成牙本質(zhì)向分化能力降低，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大，最終破壞了正常的牙齒組織致使齲齒更加嚴(yán)重。

3.2.3 MAPK信號(hào)通路 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可識(shí)別各種胞外部信號(hào)，并被激活，在信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)過(guò)程中具有重要作用[29]。MAPK可分為4個(gè)亞族：ERK、p38、JNK和ERK5。有文獻(xiàn)證明，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和機(jī)械刺激通常通過(guò)激活MAPK（特別是通過(guò)ERK1/2途徑）誘導(dǎo)細(xì)胞分化和礦化變化。

研究發(fā)現(xiàn)miR-135b的潛在靶基因有APC、MEF2C和COL5A1，于是推測(cè)表達(dá)下調(diào)的miR-135b通過(guò)它們來(lái)調(diào)控MAPK和Wnt信號(hào)通路，從而促進(jìn)hDPCs牙源性分化[3]。Chang等[4]指出miR-218通過(guò)ERK1/2途徑負(fù)向調(diào)節(jié)DPSCs牙本質(zhì)生成。研究證明，過(guò)度表達(dá)的miR-143-5p可以通過(guò)降低p38 MAPK通路相關(guān)基因（MAPK14、Ras和MKK3/6）和成牙本質(zhì)向分化標(biāo)志物（ALP、DSPP、OCN）的表達(dá)來(lái)負(fù)向調(diào)控這一過(guò)程[30];同時(shí)，文獻(xiàn)[26]報(bào)道稱(chēng)，miR-488的下調(diào)可通過(guò)MAPK1激活p38 MAPK信號(hào)通路，同時(shí)增加DSPP、ALP和OCN的表達(dá)，從而證明miR-488在hDPSCs成牙本質(zhì)向分化過(guò)程中起負(fù)向調(diào)控作用。另外，也可利用OPG/RANKL信號(hào)通路調(diào)控Runx2表達(dá)來(lái)負(fù)向調(diào)控這一過(guò)程[31]。

除以上幾種信號(hào)通路，此外與DPSCs成牙本質(zhì)向分化相關(guān)的信號(hào)通路還有Wnt、TGF-β1/smads、LPS/TLR-4、OPG/RANKL等信號(hào)通路[3，21，32-33]。miRNA與這些信號(hào)通路及其他相關(guān)因子形成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)控DPSCs成牙本質(zhì)向分化。

4 小結(jié)與展望

目前，miRNA調(diào)控DPSCs成牙本質(zhì)向分化的具體機(jī)制尚不清楚，其中涉及復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。DPSCs成牙本質(zhì)向分化過(guò)程中涉及較多的信號(hào)通路，目前有關(guān)MAPK途徑的報(bào)道較多;已發(fā)現(xiàn)較多數(shù)量的特定miRNA，還有更多miRNA等待發(fā)現(xiàn);它們對(duì)牙向分化具有雙向作用;現(xiàn)相關(guān)研究?jī)H處于分子水平，接下來(lái)還需可靠的臨床前動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。因此，人們還需不斷研究和探索，為實(shí)現(xiàn)牙本質(zhì)再生及牙再生提供理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-12-02） （本文編輯：張爽）