• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大鼠發(fā)育期熱性驚厥后海馬microRNA差異表達譜的相關(guān)研究*

    2021-03-26 08:34:34徐健李曉東孫明強何小華高振忠
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:基因芯片熱性海馬

    徐健,李曉東,孫明強,何小華,高振忠

    [1.濰坊醫(yī)學院婦幼保健院(濰坊市婦幼保健院),山東 濰坊261011;2.武漢大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院,湖北 武漢430071]

    熱性驚厥在嬰兒和兒童中很常見,約占2%,是兒童最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。根據(jù)美國兒科學會的定義,熱性驚厥是一種無代謝異常或顱內(nèi)感染,與發(fā)熱性疾病相關(guān)的驚厥,可分為單純型驚厥和復雜型驚厥[2],與體溫達39℃或更高有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn),急性電解質(zhì)失衡、發(fā)育遲緩、病毒感染、有發(fā)燒痙攣家族史[3-4],以及鐵、鋅的缺乏可能是導致熱性驚厥的潛在危險因素[5]。臨床研究表明,單純退熱治療對預(yù)防熱性驚厥復發(fā)無效,與苯巴比妥聯(lián)合使用可有效預(yù)防熱性驚厥的復發(fā)[6]。由于這些藥物潛在的毒性已遠遠超過了兒童熱性驚厥造成的危害,因此迫切需要尋找更多新的生物標志物來預(yù)測、診斷和治療熱性驚厥。

    近年來,隨著對非編碼RNA 的深入研究,microRNA(miRNA)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用,尤其是與大腦發(fā)育的關(guān)系越來越受到重視[7-9]。miRNA屬于一個非編碼的微小RNA 家族,是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,可以抑制mRNA 翻譯或直接降解靶mRNA[10]。miRNA 對神經(jīng)元的正常發(fā)育至關(guān)重要,與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),其機制仍有待研究。例如miRNA 在涉及大腦發(fā)育和成人神經(jīng)可塑性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用[9]。miR-124a 和miR-9 能夠調(diào)節(jié)胚胎干細胞向神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的分化[11],而腦特異性miR-9 在調(diào)節(jié)干細胞衍生的神經(jīng)前體細胞的細胞行為中起關(guān)鍵作用。miRNA 作為一種表觀遺傳學調(diào)控方式,在驚厥、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮非常重要的作用。

    本研究首先通過經(jīng)典熱水浴誘導驚厥的方法復制反復熱性驚厥大鼠模型。隨后利用大鼠miRNA表達譜芯片比較分析大鼠發(fā)育期反復熱性驚厥后海馬和健康大鼠海馬中差異表達的miRNA,并采用多種生物信息學方法如分級聚類分析、功能分類、基因網(wǎng)絡(luò)分析、靶基因預(yù)測分析等對芯片數(shù)據(jù)進行深入挖掘和分析,以獲取大量生物信息。這些候選的易感miRNA 及潛在的芯片數(shù)據(jù)信息對研究熱性驚厥的發(fā)病機制及其與癲癇的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系具有重要的作用,為發(fā)現(xiàn)新的熱性驚厥臨床分子生物靶標提供重要依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 反復熱性驚厥模型的復制

    選取10 只SPF 級14 d日齡健康SD 大鼠,通過經(jīng)典熱水浴誘導驚厥,復制熱性驚厥動物模型,連續(xù)熱水浴7 d,按照熱性驚厥的5 級行為學評分標準[12],選取熱性驚厥行為綜合評分最高的3 只SD 大鼠進行miRNA 表達譜基因芯片分析,同時選取3只健康SD 大鼠。實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2014-0012;實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2014-0067。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 miRNA 表達譜基因芯片將兩組大鼠海馬組織樣本送至上??党苫蚬?,按照安捷倫miRNA 表達譜芯片(大鼠)標準化操作流程進行芯片分析。

    1.2.2 差異表達miRNA的篩選從miRNA 表達譜基因芯片中獲得標準化數(shù)據(jù),首先以隨機方差模型和Limma 算法作為差異鑒別方法,以P<0.05,F(xiàn)C>1.5 為差異基因標準,篩選出兩組間存在差異表達的miRNA。

    1.2.3 miRNA靶基因預(yù)測成熟的miRNA 序列均來 自miRBase(http://www.mirbase.org)。分別利用TargetScan(http://www.targetscan.org)和miRDB(http://www.mirdb.org)2 個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA 的潛在靶基因,并取兩者的交集作為最終候選靶基因。

    1.2.4 差異表達miRNA 靶基因的生物信息分析通過生物信息學對上述篩選的候選靶基因進行GO 功能注釋分析。通過計算其P值(Fisher 確切概率法)、富集分數(shù),可獲得顯著富集的GO 類別。通過GO 功能分析可聚焦具有顯著差異的功能集群,篩選并鑒定感興趣的靶基因與何種基因功能相關(guān)[13]。通過聯(lián)合KEGG 等多種數(shù)據(jù)庫,利用Fisher 精確概率法對候選靶基因的Pathway 進行顯著性富集分析。通過信號通路分析可以篩選及鑒定候選靶基因所參與的Pathway,進而研究靶基因與哪些細胞信號通路的改變相關(guān)。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析是利用STRING 數(shù)據(jù)庫結(jié)合Cytoscape 軟件分析miR-148a-3p 靶基因(蛋白)之間的相互作用關(guān)系。

    1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗證基因芯片數(shù)據(jù)采用qRT-PCR 驗證差異表達miRNA。通過提取海馬組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并以此為模板。根據(jù)miRNA 序列設(shè)計PCR引物,并檢測其相對表達量;按照Qiagen 試劑盒說明書進行操作。選取U6基因為內(nèi)參基因。根據(jù)公式2-△△Ct=[Ct(target)-Ct(U6)]A-[Ct(target)-Ct(U6)]B,計算miRNA 相對表達量。引物序列見表1。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.3 統(tǒng)計學方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,兩樣本差異分析用t檢驗,多組間比較用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 差異表達miRNA聚類分析

    分級聚類主要根據(jù)基因表達譜數(shù)據(jù)的相似性,利用Pearson 相關(guān)系數(shù)作為相似性度量,最后將個體樣本進行集群分析。經(jīng)過分級聚類分析,所有實驗樣本被分為2 個主要的不同集群,符合筆者預(yù)期的實驗分組結(jié)果。以P<0.05,F(xiàn)C >1.5 為篩選標準,篩選獲得31個差異表達miRNA,其中包括21個上調(diào)miRNA 和10 個下調(diào)miRNA(見圖1A)。

    2.2 qRT-PCR驗證差異表達miRNA

    為進一步證實基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性,隨機挑選9 個差異表達miRNA。結(jié)果顯示,qRT-PCR 的驗證結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相符,證明基因芯片數(shù)據(jù)可靠(見圖1B)。

    圖1 差異表達miRNA熱圖和qRT-PCR驗證實驗

    2.3 差異表達miRNA的靶基因GO功能和Path‐way分析

    為進一步分析篩選得到的差異表達miRNA 的靶基因的GO 功能,利用miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 預(yù)測出3 247 個交集靶基因。利用生物信息學方法對靶基因進行GO 功能分類。以P<0.01 為閾值,獲得顯著差異的GO 功能集群,主要包括基因轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)元分化、大腦及海馬發(fā)育等。見圖2。

    圖2 31個差異表達miRNA的GO功能分析

    同時,以P<0.05 為篩選標準,對差異表達基因參與的顯著性Pathway 進行分析。獲得具有顯著差異的TOP 10 信號通路,主要包括:顯著富集的Pathway 主要包括癌癥相關(guān)、FoxO信號通路、PI3K/Akt信號通路、多巴胺突觸通路等,這些信號通路均與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。見圖3。

    圖3 31個差異表達miRNA信號通路分析

    2.4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測分析

    根據(jù)生物信息及文獻檢索分析,筆者選定miR-148a-3p 作為候選易感miRNA 進行后續(xù)研究。首先通過miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 進行靶基因預(yù)測篩選,共獲得186個靶基因,其中120 個靶基因(紅色)參與神經(jīng)、免疫、表觀遺傳等功能,其是驚厥、癲癇等的重要影響因素。見圖4。

    2.5 miR-148a-3p靶基因GO功能和Pathway分析

    為進一步分析篩選得到的miR-148a-3p 靶基因的GO 功能,利用miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 共預(yù)測186 個交集靶基因(見圖4)。結(jié)合AmiGO 多個數(shù)據(jù)庫的信息對186 個靶基因進行GO 功能分析。以P<0.05 為閾值,獲得具有顯著差異GO 功能分類,包括神經(jīng)元生成及分化、大腦發(fā)育、轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合、組蛋白修飾等多種與神經(jīng)、免疫及表觀遺傳相關(guān)的功能,這些因素與驚厥及癲癇有著非常密切的聯(lián)系(見圖5A~C)。

    圖4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測結(jié)果

    同時,以P<0.05 為閾值,對186 個靶基因所參與的顯著性Pathway 進行分析,獲得具有顯著差異的TOP 10 信號通路,主要包括:FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路、TGF-β信號通路、Hippo信號通路等,這些信號通路都與驚厥和癲癇疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。見圖5D。

    2.6 miR-148a-3p 靶基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

    通常情況下,基因不是單獨起作用,而是多個基因形成相互作用的復雜的分子網(wǎng)絡(luò)從而控制機體的生物進程。為進一步探索靶基因之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,筆者選取186 個交集靶基因,利用STRING 數(shù)據(jù)庫進行靶基因蛋白相互作用分析,結(jié)果表明分子網(wǎng)絡(luò)中紅顏色的基因(Ube2d1、Ube2d2、Ube3b、Skp1、Fbxl19、Ccnf、Smurf2)位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的中心,被認為是在該網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因。見圖6。

    2.7 miR-148a-3p的靶基因NCOA1

    通過生物信息分析及文獻搜索,筆者發(fā)現(xiàn)NCOA1的功能與神經(jīng)、免疫系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系,因此確定NCOA1作為候選靶基因進行驗證。通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),NCOA1基因上存在miR-148a-3P 的靶基因作用位點(見圖7)。通過雙熒光素酶報告實驗進一步驗證NCOA1是否為miR-148a-3p 的真正靶基因。將構(gòu)建成功的WT-pGL3-NCOA13'-UTR 載 體、MUT-pGL3-NCOA13'-UTR 載體,分別與miRNA-148a-3p mimics或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元細胞,48 h 后檢測熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示,對照組、miR-148a-3p mimics 組、共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性分別為(0.96±0.01)、(0.13±0.00)、(0.98±0.10),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=224.899,P=0.000)。與對照組比較,miR-148a-3p mimics 組和共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性受到抑制(P<0.05),而miR-148a-3p mimics 組與共轉(zhuǎn)染組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗結(jié)果表明,miR-148a-3p 與NCOA1的靶位點共同存在時,才能抑制熒光素酶基因表達,將靶位點部分堿基突變后,則不能發(fā)揮抑制作用。實驗表明NCOA1是miR-148a-3p 作用的靶基因,下一步可進行其功能機制的研究。

    圖5 miR-148a-3p預(yù)測靶基因的GO功能和Pathway分析

    圖6 miR-148a-3p 靶基因蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖

    圖7 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因位點示意圖

    3 討論

    熱性驚厥在0~5 歲幼兒和兒童中常見,多種因素可能會增加熱性驚厥風險[10]。不同種類的miRNA 在大腦中表達,并在驚厥及癲癇等神經(jīng)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中miR-148a-3p 參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和動態(tài)平衡,且參與多種類型的癌癥、自身免疫性疾病、炎癥疾病及其他病理過程。鑒于以上原因,本研究利用miRNA 表達譜基因芯片技術(shù),探討miRNA 在熱性驚厥中的作用機制,以期更好地研究熱性驚厥的病理機制。

    本研究首先復制熱性驚厥大鼠模型,利用miRNA 表達譜基因芯片技術(shù)對驚厥和健康大鼠海馬組織miRNA 表達進行深入分析。根據(jù)分級聚類分析的結(jié)果,6 組實驗樣本被分成2 個不同集群,由此可推斷出實驗樣本分類是可靠的,與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)過信息分析,獲得31個差異表達miRNA 及相關(guān)的功能信息。21 個miRNA 顯著上調(diào),包括miR-542-5p、miR-499-5p、miR-148a-3p、miR-451-5p。11個miRNA顯著下調(diào),其中以miR-207、miR-130b-3p下調(diào)最為顯著。這些差異表達miRNA 是否參與熱性驚厥的發(fā)生、發(fā)展過程需要進一步研究。同時,為驗證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性,選取10 個差異表達miRNA,利用qRT-PCR 進行驗證,結(jié)果與芯片結(jié)果相符,為后續(xù)表達譜基因芯片的分析提供可靠的基礎(chǔ)。

    隨后,經(jīng)過信息綜合分析發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p 在海馬組織的表達水平升高,與qRT-PCR 結(jié)果一致,因此選取miR-148a-3p 進行深入研究和分析。差異表達miR-148a-3p 的功能與神經(jīng)免疫、細胞凋亡都有密切聯(lián)系。最新研究表明,在缺血性腦卒中疾病中,miR-148a-3p 可以與lncRNA-h19和ROCK2基因形成作用路徑,進而調(diào)節(jié)由于缺血性腦卒中造成的氧化應(yīng)激[14]。另外,miR-148a-3p 可以靶向KLF6基因,調(diào)節(jié)骨骼肌細胞的增殖和凋亡[15]。miR-148a 作為miR-148a-3p 的前體,與其有著同樣的活性,并且可以調(diào)控多種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的蛋白因子。在帕金森和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,miR-148a 的表達存在顯著異常。生物信息分析篩選獲得的其他差異表達的miRNA 也值得去研究,其功能都與神經(jīng)免疫等因素有緊密的聯(lián)系。研究表明,在缺血缺氧性腦病中,miR-499-5p可以通過調(diào)節(jié)C 反應(yīng)蛋白的表達水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。miR-207 可能參與了OSA 誘導的認知障礙。另外,miR-130b-3p 可以抑制eCIRP 誘導的炎癥反應(yīng)[17]。

    筆者通過TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-148a-3p 的靶基因,獲得交集靶基因186 個。利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息構(gòu)建靶基因關(guān)系圖。在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)KLF6基因被證實是miR-148a-3p 的靶基因,并且可以促進神經(jīng)元的軸突再生[18]。同時,在預(yù)測的靶基因中,發(fā)現(xiàn)多個靶基因與神經(jīng)免疫功能密切相關(guān)。例如,NCOA1、NOG、NPTN等。NCOA1又名SRC-1,可以影響大鼠海馬突觸可塑性和空間學習記憶能力,并且可以影響下丘腦神經(jīng)元的功能。隨后筆者通過雙熒光素酶報告實驗驗證NCOA1是miR-148a-3p 調(diào)節(jié)的靶基因。另有研究發(fā)現(xiàn),基因NOG拮抗劑可以恢復海馬神經(jīng)干細胞的數(shù)量和神經(jīng)生成,同時可以促進髓鞘的修復[19]。Neuronplastin(NPTN)作為一種多功能的神經(jīng)元黏附分子,與長時程的突觸可塑性密切相關(guān)[20]。

    選取miR-148a-3p 的186 個候選靶基因進行GO功能和Pathway 分析。分析結(jié)果提示熱性驚厥與神經(jīng)免疫炎癥關(guān)系密切,為研究免疫炎癥在熱性驚厥中的作用提供了重要線索。例如,顯著GO 功能包括神經(jīng)元分化、大腦發(fā)育、突觸發(fā)生等。在差異顯著Pathway 中,F(xiàn)oxO信號通路存在顯著差異。在癲癇狀態(tài)下,通過激活FoxO信號通路可引起驚厥誘導的神經(jīng)元的死亡[21]。同時,F(xiàn)oxO信號通路家族可以參與多種病理條件下的細胞死亡[22]。FoxO1和FoxO2在免疫細胞的發(fā)育、分化中起重要作用。FoxO1和FoxO3可以促進調(diào)節(jié)性T 細胞的形成,抑制Th1 和Th17 細胞的形成[23]。

    最新研究表明,miRNA 與神經(jīng)系統(tǒng)疾病中海馬神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)[24-25]。miR-223 表達上調(diào)可以抑制驚厥大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡和大腦損傷[26]。miR-421 可以通過TLR 受體信號通路進而抑制癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡[27]。沉默miR-134 可以減輕癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元損傷及自發(fā)驚厥頻率[28]。另有研究表明,miR-148a-3p 與細胞凋亡關(guān)系密切。miR-148a-3p 與DNMT1 形成調(diào)控路徑,促進腫瘤的增生[29]。另有研究表明,在急性胰腺炎疾病中,miR-148a-3p 可以通過靶向PTEN 來抑制細胞壞死[30]。上調(diào)miR-210-3p 可以抑制缺氧誘導的海馬神經(jīng)元凋亡[31]。miR-34a 抑制劑可以通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元細胞凋亡[32]。在前面的研究中,課題組采用miRNA 表達譜芯片及qRT-PCR證實大鼠發(fā)育期反復驚厥后海馬miR-148a-3p 顯著上調(diào),提示miR-148a-3p 可能參與驚厥的發(fā)生、發(fā)展。其可能通過分析結(jié)果中預(yù)測的某個靶基因或者信號通路參與驚厥的發(fā)生、發(fā)展過程。

    綜上所述,本研究通過對反復驚厥大鼠海馬miRNA 表達譜基因芯片進行分析,獲得一系列的差異表達miRNA 和候選預(yù)測靶基因的GO 及Pathway等相關(guān)信息。這些豐富的數(shù)據(jù)對于后期研究熱性驚厥的發(fā)病機制起重要的提示作用,為發(fā)現(xiàn)新的熱性驚厥臨床分子靶標提供有利的證據(jù)。

    猜你喜歡
    基因芯片熱性海馬
    海馬
    出生時即可預(yù)判發(fā)育潛力 基因芯片精準篩選肉牛良種
    關(guān)于兒童熱性驚厥的20個疑問
    海馬
    關(guān)于兒童熱性驚厥的20個疑問
    “海馬”自述
    雙管單色熒光PCR法與基因芯片法檢測CYP2C19基因多態(tài)性的比較研究
    應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測四種結(jié)核藥物敏感試驗的研究
    海馬
    熱性驚厥首次復發(fā)的相關(guān)因素探討
    免费人成在线观看视频色| 国产中年淑女户外野战色| 欧美bdsm另类| 亚洲欧美精品专区久久| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品99久久久久久久久| 欧美潮喷喷水| 成人亚洲精品av一区二区| 精品人妻熟女av久视频| 日本一二三区视频观看| 成人午夜高清在线视频| 国产精品精品国产色婷婷| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产免费又黄又爽又色| 黄色日韩在线| 最新中文字幕久久久久| 观看美女的网站| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲av熟女| 亚洲在线观看片| 国产色爽女视频免费观看| 国产一区有黄有色的免费视频 | 久久久久久伊人网av| av在线蜜桃| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 日本三级黄在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产视频内射| 一本久久精品| 国产精品久久久久久av不卡| 国产亚洲精品久久久com| 国产真实乱freesex| 桃色一区二区三区在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 在线播放国产精品三级| 麻豆乱淫一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品三级大全| www.色视频.com| av免费观看日本| 午夜日本视频在线| 久久久久久九九精品二区国产| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品.久久久| 不卡视频在线观看欧美| 午夜视频国产福利| 联通29元200g的流量卡| 国产免费又黄又爽又色| 日韩视频在线欧美| a级一级毛片免费在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美丝袜亚洲另类| 久久精品夜色国产| 久久99热6这里只有精品| 韩国av在线不卡| 日韩欧美精品v在线| 日本免费在线观看一区| 久久久久久久久久久免费av| 夫妻性生交免费视频一级片| 小说图片视频综合网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久久久久久久中文| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 日本av手机在线免费观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久6这里有精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 男插女下体视频免费在线播放| 国内精品宾馆在线| 亚洲最大成人手机在线| 禁无遮挡网站| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩亚洲欧美综合| 如何舔出高潮| 国产免费男女视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品久久久久久av不卡| av黄色大香蕉| 精品一区二区三区人妻视频| 国产私拍福利视频在线观看| 免费观看的影片在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 波野结衣二区三区在线| 国产精品,欧美在线| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲中文字幕日韩| 我的女老师完整版在线观看| 久久久色成人| 国产精品野战在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美日韩在线观看h| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品久久视频播放| 我要搜黄色片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 69人妻影院| 精品无人区乱码1区二区| 国产 一区 欧美 日韩| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲无线观看免费| 黄色一级大片看看| 伦理电影大哥的女人| 国产高清不卡午夜福利| 精品久久久噜噜| 男人和女人高潮做爰伦理| 老司机影院成人| 最近的中文字幕免费完整| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日本一本二区三区精品| 国产午夜精品一二区理论片| 看非洲黑人一级黄片| 69人妻影院| 亚洲人成网站在线播| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲av成人av| a级毛色黄片| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲五月天丁香| 亚洲图色成人| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲av福利一区| 日本一二三区视频观看| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 黄色欧美视频在线观看| 特级一级黄色大片| 免费观看在线日韩| 久久99精品国语久久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品野战在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 美女国产视频在线观看| 久99久视频精品免费| 成人午夜精彩视频在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲高清免费不卡视频| 婷婷色av中文字幕| 亚洲综合精品二区| 久久99精品国语久久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美精品一区二区大全| 波多野结衣高清无吗| 欧美bdsm另类| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久综合国产亚洲精品| 久久精品夜色国产| 欧美人与善性xxx| 村上凉子中文字幕在线| 少妇丰满av| 校园人妻丝袜中文字幕| 美女内射精品一级片tv| 日日撸夜夜添| 国产免费一级a男人的天堂| 三级国产精品欧美在线观看| 成人国产麻豆网| 春色校园在线视频观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲国产精品国产精品| 国产视频内射| 成人av在线播放网站| videossex国产| 国产人妻一区二区三区在| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线播放国产精品三级| 中文字幕av在线有码专区| 国产免费一级a男人的天堂| av在线观看视频网站免费| 国产一区二区在线观看日韩| 久久综合国产亚洲精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 国产高清国产精品国产三级 | 精品酒店卫生间| 国产一级毛片七仙女欲春2| 婷婷六月久久综合丁香| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 最近视频中文字幕2019在线8| 高清av免费在线| 只有这里有精品99| 中文欧美无线码| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 欧美精品一区二区大全| 免费看a级黄色片| 少妇人妻一区二区三区视频| 大话2 男鬼变身卡| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美日韩在线观看h| 日韩欧美精品v在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久精品人妻少妇| 久久久精品94久久精品| 三级国产精品片| 国产淫语在线视频| 婷婷色综合大香蕉| 性插视频无遮挡在线免费观看| 超碰97精品在线观看| 在线a可以看的网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产极品精品免费视频能看的| 日韩强制内射视频| 欧美丝袜亚洲另类| 不卡视频在线观看欧美| 黄片wwwwww| 免费观看的影片在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产黄片美女视频| 青春草亚洲视频在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 免费av观看视频| 国产免费一级a男人的天堂| 青青草视频在线视频观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 在线a可以看的网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在线免费十八禁| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产av在哪里看| 我要看日韩黄色一级片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 99久久九九国产精品国产免费| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲精品乱久久久久久| 久久草成人影院| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲国产精品sss在线观看| 一本久久精品| 亚洲在久久综合| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产淫片久久久久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 三级国产精品欧美在线观看| 好男人视频免费观看在线| 内地一区二区视频在线| 三级经典国产精品| 99九九线精品视频在线观看视频| 极品教师在线视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 听说在线观看完整版免费高清| 久久99热6这里只有精品| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 久久久久久久国产电影| 国产免费一级a男人的天堂| 99在线人妻在线中文字幕| 乱系列少妇在线播放| 国产午夜精品论理片| 亚洲精品成人久久久久久| 欧美激情在线99| 午夜福利成人在线免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲精品国产成人久久av| 51国产日韩欧美| 波多野结衣巨乳人妻| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产三级中文精品| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久精品影院6| 国产人妻一区二区三区在| 久久久久久久久久久丰满| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 亚洲精品成人久久久久久| 成人av在线播放网站| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品一及| 亚洲av不卡在线观看| 少妇高潮的动态图| 18禁在线播放成人免费| 久久久国产成人免费| 精品酒店卫生间| 亚洲综合色惰| 女人被狂操c到高潮| 国产毛片a区久久久久| 特大巨黑吊av在线直播| 日本-黄色视频高清免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 婷婷色av中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 嫩草影院入口| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久热精品热| 免费搜索国产男女视频| 中国美白少妇内射xxxbb| www日本黄色视频网| 午夜激情福利司机影院| 国产探花极品一区二区| 亚洲最大成人av| 婷婷色av中文字幕| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲av一区综合| 一级av片app| 日韩av不卡免费在线播放| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲人成网站在线播| 国产三级在线视频| 大香蕉97超碰在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲精品色激情综合| 久99久视频精品免费| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久久久久黄片| 干丝袜人妻中文字幕| 欧美日韩国产亚洲二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久精品夜色国产| 黄色日韩在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲av成人精品一二三区| 久久午夜福利片| 亚洲在久久综合| 久久这里只有精品中国| 91精品国产九色| 亚洲av中文av极速乱| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久欧美国产精品| 欧美bdsm另类| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国内精品美女久久久久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品人妻久久久久久| 成人三级黄色视频| 成年免费大片在线观看| 久久精品91蜜桃| 色播亚洲综合网| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本免费在线观看一区| 天堂√8在线中文| 亚洲国产色片| www.av在线官网国产| 中文天堂在线官网| 国产淫片久久久久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 我的女老师完整版在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区三区av在线| 毛片一级片免费看久久久久| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久久午夜欧美精品| 国产淫片久久久久久久久| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久精品欧美日韩精品| 久久精品国产亚洲av天美| 一级黄色大片毛片| 亚洲综合色惰| 三级国产精品片| 国产精品电影一区二区三区| 七月丁香在线播放| 久久久国产成人精品二区| 两个人的视频大全免费| 久久午夜福利片| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产男人的电影天堂91| 午夜福利成人在线免费观看| 天堂中文最新版在线下载 | 天堂网av新在线| 国产一区二区三区av在线| 韩国高清视频一区二区三区| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品国产av成人精品| 中文资源天堂在线| 久久99热这里只有精品18| 欧美极品一区二区三区四区| 中文天堂在线官网| 六月丁香七月| 91狼人影院| 丰满人妻一区二区三区视频av| 九九爱精品视频在线观看| 久久热精品热| 六月丁香七月| 国产精品永久免费网站| 美女大奶头视频| 日本黄色片子视频| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 狠狠狠狠99中文字幕| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产av不卡久久| 国产综合懂色| 日本免费在线观看一区| 一区二区三区四区激情视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 91久久精品国产一区二区三区| 直男gayav资源| 熟女电影av网| 亚洲欧美日韩高清专用| 一个人看视频在线观看www免费| 综合色丁香网| 成年版毛片免费区| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人精品久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 最近的中文字幕免费完整| 久久久欧美国产精品| 听说在线观看完整版免费高清| 高清在线视频一区二区三区 | 永久免费av网站大全| 国产亚洲91精品色在线| 波多野结衣巨乳人妻| 草草在线视频免费看| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品亚洲一区二区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲成人av在线免费| 最近手机中文字幕大全| 97超碰精品成人国产| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产综合懂色| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 午夜激情欧美在线| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产熟女欧美一区二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日本免费在线观看一区| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美三级亚洲精品| 嫩草影院新地址| 白带黄色成豆腐渣| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费黄色在线免费观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 1024手机看黄色片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 天天躁日日操中文字幕| 国产成人精品久久久久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 免费av不卡在线播放| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久久久久久久大av| 午夜激情欧美在线| 我的老师免费观看完整版| 日本av手机在线免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一级二级三级毛片免费看| 精品国内亚洲2022精品成人| 乱人视频在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品一及| av线在线观看网站| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品久久久久久av不卡| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产男人的电影天堂91| 免费看日本二区| 中文字幕av成人在线电影| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久久国产网址| 午夜老司机福利剧场| 尾随美女入室| 69av精品久久久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 69人妻影院| 日韩成人伦理影院| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产在线男女| 欧美精品国产亚洲| 麻豆成人av视频| 国国产精品蜜臀av免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 九九热线精品视视频播放| 一级av片app| 亚洲综合色惰| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲av免费在线观看| av线在线观看网站| 亚洲内射少妇av| 国产成人精品一,二区| 久久久久久久午夜电影| 青春草视频在线免费观看| 午夜a级毛片| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品,欧美在线| 成人欧美大片| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 精品久久国产蜜桃| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成人漫画全彩无遮挡| www.av在线官网国产| 亚洲av一区综合| 亚洲成人av在线免费| 国产成人a∨麻豆精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 禁无遮挡网站| 日本与韩国留学比较| 久久久久性生活片| 久久亚洲精品不卡| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产成人精品婷婷| 国产在视频线在精品| 亚洲av男天堂| 熟女人妻精品中文字幕| 91久久精品电影网| 简卡轻食公司| 黄片wwwwww| 国产成人a区在线观看| 日本五十路高清| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久人人爽人人爽人人片va| 成人综合一区亚洲| 免费大片18禁| 色5月婷婷丁香| 性色avwww在线观看| 看十八女毛片水多多多| 成人av在线播放网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 色综合亚洲欧美另类图片| 国产91av在线免费观看| 九色成人免费人妻av| 日本黄色片子视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 黑人高潮一二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品精品国产色婷婷| 久久亚洲国产成人精品v| 日韩欧美精品免费久久| 免费av不卡在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲第一区二区三区不卡| 久99久视频精品免费| 最新中文字幕久久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 国产亚洲精品久久久com| 搞女人的毛片| 日韩av在线大香蕉| 男女啪啪激烈高潮av片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日韩av不卡免费在线播放| 国产久久久一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久精品大字幕| 综合色丁香网| 九草在线视频观看| 精品人妻熟女av久视频| 男的添女的下面高潮视频| 成年av动漫网址| 村上凉子中文字幕在线| 久久久精品大字幕| 两个人视频免费观看高清| 色综合色国产| 国产美女午夜福利| 精品一区二区三区人妻视频| 三级毛片av免费| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产免费男女视频| 我要看日韩黄色一级片| 国产激情偷乱视频一区二区| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 亚洲,欧美,日韩| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费av观看视频| 亚洲av熟女| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 一级毛片久久久久久久久女| 久久久久久久久久久免费av| 日本av手机在线免费观看| 老司机影院毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 人体艺术视频欧美日本| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产v大片淫在线免费观看| 1000部很黄的大片| 一级黄片播放器| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜激情欧美在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 免费在线观看成人毛片| 男人舔女人下体高潮全视频| 18禁动态无遮挡网站| 久久久久久大精品| 国产日韩欧美在线精品| 一区二区三区四区激情视频| 精品人妻偷拍中文字幕|