• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大鼠發(fā)育期熱性驚厥后海馬microRNA差異表達譜的相關(guān)研究*

    2021-03-26 08:34:34徐健李曉東孫明強何小華高振忠
    中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:基因芯片熱性海馬

    徐健,李曉東,孫明強,何小華,高振忠

    [1.濰坊醫(yī)學院婦幼保健院(濰坊市婦幼保健院),山東 濰坊261011;2.武漢大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院,湖北 武漢430071]

    熱性驚厥在嬰兒和兒童中很常見,約占2%,是兒童最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。根據(jù)美國兒科學會的定義,熱性驚厥是一種無代謝異常或顱內(nèi)感染,與發(fā)熱性疾病相關(guān)的驚厥,可分為單純型驚厥和復雜型驚厥[2],與體溫達39℃或更高有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn),急性電解質(zhì)失衡、發(fā)育遲緩、病毒感染、有發(fā)燒痙攣家族史[3-4],以及鐵、鋅的缺乏可能是導致熱性驚厥的潛在危險因素[5]。臨床研究表明,單純退熱治療對預(yù)防熱性驚厥復發(fā)無效,與苯巴比妥聯(lián)合使用可有效預(yù)防熱性驚厥的復發(fā)[6]。由于這些藥物潛在的毒性已遠遠超過了兒童熱性驚厥造成的危害,因此迫切需要尋找更多新的生物標志物來預(yù)測、診斷和治療熱性驚厥。

    近年來,隨著對非編碼RNA 的深入研究,microRNA(miRNA)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用,尤其是與大腦發(fā)育的關(guān)系越來越受到重視[7-9]。miRNA屬于一個非編碼的微小RNA 家族,是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,可以抑制mRNA 翻譯或直接降解靶mRNA[10]。miRNA 對神經(jīng)元的正常發(fā)育至關(guān)重要,與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān),其機制仍有待研究。例如miRNA 在涉及大腦發(fā)育和成人神經(jīng)可塑性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用[9]。miR-124a 和miR-9 能夠調(diào)節(jié)胚胎干細胞向神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的分化[11],而腦特異性miR-9 在調(diào)節(jié)干細胞衍生的神經(jīng)前體細胞的細胞行為中起關(guān)鍵作用。miRNA 作為一種表觀遺傳學調(diào)控方式,在驚厥、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮非常重要的作用。

    本研究首先通過經(jīng)典熱水浴誘導驚厥的方法復制反復熱性驚厥大鼠模型。隨后利用大鼠miRNA表達譜芯片比較分析大鼠發(fā)育期反復熱性驚厥后海馬和健康大鼠海馬中差異表達的miRNA,并采用多種生物信息學方法如分級聚類分析、功能分類、基因網(wǎng)絡(luò)分析、靶基因預(yù)測分析等對芯片數(shù)據(jù)進行深入挖掘和分析,以獲取大量生物信息。這些候選的易感miRNA 及潛在的芯片數(shù)據(jù)信息對研究熱性驚厥的發(fā)病機制及其與癲癇的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系具有重要的作用,為發(fā)現(xiàn)新的熱性驚厥臨床分子生物靶標提供重要依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 反復熱性驚厥模型的復制

    選取10 只SPF 級14 d日齡健康SD 大鼠,通過經(jīng)典熱水浴誘導驚厥,復制熱性驚厥動物模型,連續(xù)熱水浴7 d,按照熱性驚厥的5 級行為學評分標準[12],選取熱性驚厥行為綜合評分最高的3 只SD 大鼠進行miRNA 表達譜基因芯片分析,同時選取3只健康SD 大鼠。實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2014-0012;實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2014-0067。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 miRNA 表達譜基因芯片將兩組大鼠海馬組織樣本送至上??党苫蚬?,按照安捷倫miRNA 表達譜芯片(大鼠)標準化操作流程進行芯片分析。

    1.2.2 差異表達miRNA的篩選從miRNA 表達譜基因芯片中獲得標準化數(shù)據(jù),首先以隨機方差模型和Limma 算法作為差異鑒別方法,以P<0.05,F(xiàn)C>1.5 為差異基因標準,篩選出兩組間存在差異表達的miRNA。

    1.2.3 miRNA靶基因預(yù)測成熟的miRNA 序列均來 自miRBase(http://www.mirbase.org)。分別利用TargetScan(http://www.targetscan.org)和miRDB(http://www.mirdb.org)2 個在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA 的潛在靶基因,并取兩者的交集作為最終候選靶基因。

    1.2.4 差異表達miRNA 靶基因的生物信息分析通過生物信息學對上述篩選的候選靶基因進行GO 功能注釋分析。通過計算其P值(Fisher 確切概率法)、富集分數(shù),可獲得顯著富集的GO 類別。通過GO 功能分析可聚焦具有顯著差異的功能集群,篩選并鑒定感興趣的靶基因與何種基因功能相關(guān)[13]。通過聯(lián)合KEGG 等多種數(shù)據(jù)庫,利用Fisher 精確概率法對候選靶基因的Pathway 進行顯著性富集分析。通過信號通路分析可以篩選及鑒定候選靶基因所參與的Pathway,進而研究靶基因與哪些細胞信號通路的改變相關(guān)。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析是利用STRING 數(shù)據(jù)庫結(jié)合Cytoscape 軟件分析miR-148a-3p 靶基因(蛋白)之間的相互作用關(guān)系。

    1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)驗證基因芯片數(shù)據(jù)采用qRT-PCR 驗證差異表達miRNA。通過提取海馬組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并以此為模板。根據(jù)miRNA 序列設(shè)計PCR引物,并檢測其相對表達量;按照Qiagen 試劑盒說明書進行操作。選取U6基因為內(nèi)參基因。根據(jù)公式2-△△Ct=[Ct(target)-Ct(U6)]A-[Ct(target)-Ct(U6)]B,計算miRNA 相對表達量。引物序列見表1。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.3 統(tǒng)計學方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,兩樣本差異分析用t檢驗,多組間比較用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 差異表達miRNA聚類分析

    分級聚類主要根據(jù)基因表達譜數(shù)據(jù)的相似性,利用Pearson 相關(guān)系數(shù)作為相似性度量,最后將個體樣本進行集群分析。經(jīng)過分級聚類分析,所有實驗樣本被分為2 個主要的不同集群,符合筆者預(yù)期的實驗分組結(jié)果。以P<0.05,F(xiàn)C >1.5 為篩選標準,篩選獲得31個差異表達miRNA,其中包括21個上調(diào)miRNA 和10 個下調(diào)miRNA(見圖1A)。

    2.2 qRT-PCR驗證差異表達miRNA

    為進一步證實基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性,隨機挑選9 個差異表達miRNA。結(jié)果顯示,qRT-PCR 的驗證結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相符,證明基因芯片數(shù)據(jù)可靠(見圖1B)。

    圖1 差異表達miRNA熱圖和qRT-PCR驗證實驗

    2.3 差異表達miRNA的靶基因GO功能和Path‐way分析

    為進一步分析篩選得到的差異表達miRNA 的靶基因的GO 功能,利用miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 預(yù)測出3 247 個交集靶基因。利用生物信息學方法對靶基因進行GO 功能分類。以P<0.01 為閾值,獲得顯著差異的GO 功能集群,主要包括基因轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)元分化、大腦及海馬發(fā)育等。見圖2。

    圖2 31個差異表達miRNA的GO功能分析

    同時,以P<0.05 為篩選標準,對差異表達基因參與的顯著性Pathway 進行分析。獲得具有顯著差異的TOP 10 信號通路,主要包括:顯著富集的Pathway 主要包括癌癥相關(guān)、FoxO信號通路、PI3K/Akt信號通路、多巴胺突觸通路等,這些信號通路均與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。見圖3。

    圖3 31個差異表達miRNA信號通路分析

    2.4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測分析

    根據(jù)生物信息及文獻檢索分析,筆者選定miR-148a-3p 作為候選易感miRNA 進行后續(xù)研究。首先通過miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 進行靶基因預(yù)測篩選,共獲得186個靶基因,其中120 個靶基因(紅色)參與神經(jīng)、免疫、表觀遺傳等功能,其是驚厥、癲癇等的重要影響因素。見圖4。

    2.5 miR-148a-3p靶基因GO功能和Pathway分析

    為進一步分析篩選得到的miR-148a-3p 靶基因的GO 功能,利用miRNA 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan 和miRDB 共預(yù)測186 個交集靶基因(見圖4)。結(jié)合AmiGO 多個數(shù)據(jù)庫的信息對186 個靶基因進行GO 功能分析。以P<0.05 為閾值,獲得具有顯著差異GO 功能分類,包括神經(jīng)元生成及分化、大腦發(fā)育、轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合、組蛋白修飾等多種與神經(jīng)、免疫及表觀遺傳相關(guān)的功能,這些因素與驚厥及癲癇有著非常密切的聯(lián)系(見圖5A~C)。

    圖4 miR-148a-3p靶基因預(yù)測結(jié)果

    同時,以P<0.05 為閾值,對186 個靶基因所參與的顯著性Pathway 進行分析,獲得具有顯著差異的TOP 10 信號通路,主要包括:FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路、TGF-β信號通路、Hippo信號通路等,這些信號通路都與驚厥和癲癇疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。見圖5D。

    2.6 miR-148a-3p 靶基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

    通常情況下,基因不是單獨起作用,而是多個基因形成相互作用的復雜的分子網(wǎng)絡(luò)從而控制機體的生物進程。為進一步探索靶基因之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,筆者選取186 個交集靶基因,利用STRING 數(shù)據(jù)庫進行靶基因蛋白相互作用分析,結(jié)果表明分子網(wǎng)絡(luò)中紅顏色的基因(Ube2d1、Ube2d2、Ube3b、Skp1、Fbxl19、Ccnf、Smurf2)位于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的中心,被認為是在該網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵調(diào)控作用的基因。見圖6。

    2.7 miR-148a-3p的靶基因NCOA1

    通過生物信息分析及文獻搜索,筆者發(fā)現(xiàn)NCOA1的功能與神經(jīng)、免疫系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系,因此確定NCOA1作為候選靶基因進行驗證。通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),NCOA1基因上存在miR-148a-3P 的靶基因作用位點(見圖7)。通過雙熒光素酶報告實驗進一步驗證NCOA1是否為miR-148a-3p 的真正靶基因。將構(gòu)建成功的WT-pGL3-NCOA13'-UTR 載 體、MUT-pGL3-NCOA13'-UTR 載體,分別與miRNA-148a-3p mimics或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染海馬神經(jīng)元細胞,48 h 后檢測熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示,對照組、miR-148a-3p mimics 組、共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性分別為(0.96±0.01)、(0.13±0.00)、(0.98±0.10),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=224.899,P=0.000)。與對照組比較,miR-148a-3p mimics 組和共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性受到抑制(P<0.05),而miR-148a-3p mimics 組與共轉(zhuǎn)染組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。實驗結(jié)果表明,miR-148a-3p 與NCOA1的靶位點共同存在時,才能抑制熒光素酶基因表達,將靶位點部分堿基突變后,則不能發(fā)揮抑制作用。實驗表明NCOA1是miR-148a-3p 作用的靶基因,下一步可進行其功能機制的研究。

    圖5 miR-148a-3p預(yù)測靶基因的GO功能和Pathway分析

    圖6 miR-148a-3p 靶基因蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖

    圖7 TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因位點示意圖

    3 討論

    熱性驚厥在0~5 歲幼兒和兒童中常見,多種因素可能會增加熱性驚厥風險[10]。不同種類的miRNA 在大腦中表達,并在驚厥及癲癇等神經(jīng)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中miR-148a-3p 參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和動態(tài)平衡,且參與多種類型的癌癥、自身免疫性疾病、炎癥疾病及其他病理過程。鑒于以上原因,本研究利用miRNA 表達譜基因芯片技術(shù),探討miRNA 在熱性驚厥中的作用機制,以期更好地研究熱性驚厥的病理機制。

    本研究首先復制熱性驚厥大鼠模型,利用miRNA 表達譜基因芯片技術(shù)對驚厥和健康大鼠海馬組織miRNA 表達進行深入分析。根據(jù)分級聚類分析的結(jié)果,6 組實驗樣本被分成2 個不同集群,由此可推斷出實驗樣本分類是可靠的,與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)過信息分析,獲得31個差異表達miRNA 及相關(guān)的功能信息。21 個miRNA 顯著上調(diào),包括miR-542-5p、miR-499-5p、miR-148a-3p、miR-451-5p。11個miRNA顯著下調(diào),其中以miR-207、miR-130b-3p下調(diào)最為顯著。這些差異表達miRNA 是否參與熱性驚厥的發(fā)生、發(fā)展過程需要進一步研究。同時,為驗證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性,選取10 個差異表達miRNA,利用qRT-PCR 進行驗證,結(jié)果與芯片結(jié)果相符,為后續(xù)表達譜基因芯片的分析提供可靠的基礎(chǔ)。

    隨后,經(jīng)過信息綜合分析發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p 在海馬組織的表達水平升高,與qRT-PCR 結(jié)果一致,因此選取miR-148a-3p 進行深入研究和分析。差異表達miR-148a-3p 的功能與神經(jīng)免疫、細胞凋亡都有密切聯(lián)系。最新研究表明,在缺血性腦卒中疾病中,miR-148a-3p 可以與lncRNA-h19和ROCK2基因形成作用路徑,進而調(diào)節(jié)由于缺血性腦卒中造成的氧化應(yīng)激[14]。另外,miR-148a-3p 可以靶向KLF6基因,調(diào)節(jié)骨骼肌細胞的增殖和凋亡[15]。miR-148a 作為miR-148a-3p 的前體,與其有著同樣的活性,并且可以調(diào)控多種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的蛋白因子。在帕金森和阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,miR-148a 的表達存在顯著異常。生物信息分析篩選獲得的其他差異表達的miRNA 也值得去研究,其功能都與神經(jīng)免疫等因素有緊密的聯(lián)系。研究表明,在缺血缺氧性腦病中,miR-499-5p可以通過調(diào)節(jié)C 反應(yīng)蛋白的表達水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16]。miR-207 可能參與了OSA 誘導的認知障礙。另外,miR-130b-3p 可以抑制eCIRP 誘導的炎癥反應(yīng)[17]。

    筆者通過TargetScan 和miRDB 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-148a-3p 的靶基因,獲得交集靶基因186 個。利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息構(gòu)建靶基因關(guān)系圖。在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)KLF6基因被證實是miR-148a-3p 的靶基因,并且可以促進神經(jīng)元的軸突再生[18]。同時,在預(yù)測的靶基因中,發(fā)現(xiàn)多個靶基因與神經(jīng)免疫功能密切相關(guān)。例如,NCOA1、NOG、NPTN等。NCOA1又名SRC-1,可以影響大鼠海馬突觸可塑性和空間學習記憶能力,并且可以影響下丘腦神經(jīng)元的功能。隨后筆者通過雙熒光素酶報告實驗驗證NCOA1是miR-148a-3p 調(diào)節(jié)的靶基因。另有研究發(fā)現(xiàn),基因NOG拮抗劑可以恢復海馬神經(jīng)干細胞的數(shù)量和神經(jīng)生成,同時可以促進髓鞘的修復[19]。Neuronplastin(NPTN)作為一種多功能的神經(jīng)元黏附分子,與長時程的突觸可塑性密切相關(guān)[20]。

    選取miR-148a-3p 的186 個候選靶基因進行GO功能和Pathway 分析。分析結(jié)果提示熱性驚厥與神經(jīng)免疫炎癥關(guān)系密切,為研究免疫炎癥在熱性驚厥中的作用提供了重要線索。例如,顯著GO 功能包括神經(jīng)元分化、大腦發(fā)育、突觸發(fā)生等。在差異顯著Pathway 中,F(xiàn)oxO信號通路存在顯著差異。在癲癇狀態(tài)下,通過激活FoxO信號通路可引起驚厥誘導的神經(jīng)元的死亡[21]。同時,F(xiàn)oxO信號通路家族可以參與多種病理條件下的細胞死亡[22]。FoxO1和FoxO2在免疫細胞的發(fā)育、分化中起重要作用。FoxO1和FoxO3可以促進調(diào)節(jié)性T 細胞的形成,抑制Th1 和Th17 細胞的形成[23]。

    最新研究表明,miRNA 與神經(jīng)系統(tǒng)疾病中海馬神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)[24-25]。miR-223 表達上調(diào)可以抑制驚厥大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡和大腦損傷[26]。miR-421 可以通過TLR 受體信號通路進而抑制癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡[27]。沉默miR-134 可以減輕癲癇大鼠的海馬神經(jīng)元損傷及自發(fā)驚厥頻率[28]。另有研究表明,miR-148a-3p 與細胞凋亡關(guān)系密切。miR-148a-3p 與DNMT1 形成調(diào)控路徑,促進腫瘤的增生[29]。另有研究表明,在急性胰腺炎疾病中,miR-148a-3p 可以通過靶向PTEN 來抑制細胞壞死[30]。上調(diào)miR-210-3p 可以抑制缺氧誘導的海馬神經(jīng)元凋亡[31]。miR-34a 抑制劑可以通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元細胞凋亡[32]。在前面的研究中,課題組采用miRNA 表達譜芯片及qRT-PCR證實大鼠發(fā)育期反復驚厥后海馬miR-148a-3p 顯著上調(diào),提示miR-148a-3p 可能參與驚厥的發(fā)生、發(fā)展。其可能通過分析結(jié)果中預(yù)測的某個靶基因或者信號通路參與驚厥的發(fā)生、發(fā)展過程。

    綜上所述,本研究通過對反復驚厥大鼠海馬miRNA 表達譜基因芯片進行分析,獲得一系列的差異表達miRNA 和候選預(yù)測靶基因的GO 及Pathway等相關(guān)信息。這些豐富的數(shù)據(jù)對于后期研究熱性驚厥的發(fā)病機制起重要的提示作用,為發(fā)現(xiàn)新的熱性驚厥臨床分子靶標提供有利的證據(jù)。

    猜你喜歡
    基因芯片熱性海馬
    海馬
    出生時即可預(yù)判發(fā)育潛力 基因芯片精準篩選肉牛良種
    關(guān)于兒童熱性驚厥的20個疑問
    海馬
    關(guān)于兒童熱性驚厥的20個疑問
    “海馬”自述
    雙管單色熒光PCR法與基因芯片法檢測CYP2C19基因多態(tài)性的比較研究
    應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測四種結(jié)核藥物敏感試驗的研究
    海馬
    熱性驚厥首次復發(fā)的相關(guān)因素探討
    美女国产高潮福利片在线看| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲人成77777在线视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 黄色视频不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产三级黄色录像| 久久中文字幕人妻熟女| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久性视频一级片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲成人免费电影在线观看| 黄色女人牲交| 国产精华一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| www日本在线高清视频| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲,欧美精品.| 国产精品av久久久久免费| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 麻豆成人av在线观看| 久久狼人影院| 又大又爽又粗| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲专区国产一区二区| 午夜福利,免费看| 久久久久国内视频| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产片内射在线| 天堂影院成人在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 黄色成人免费大全| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美在线黄色| 91精品三级在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产三级黄色录像| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲av五月六月丁香网| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品久久电影中文字幕| 久9热在线精品视频| 免费高清在线观看日韩| 天堂√8在线中文| 在线天堂中文资源库| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一a级毛片在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日韩有码中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲,欧美精品.| 午夜福利一区二区在线看| 国产成人系列免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成人精品在线电影| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品久久视频播放| 后天国语完整版免费观看| 日本vs欧美在线观看视频| 中出人妻视频一区二区| 伦理电影免费视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 美国免费a级毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜免费鲁丝| 日日爽夜夜爽网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品美女久久av网站| avwww免费| 精品久久久久久,| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品一区二区在线不卡| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品久久电影中文字幕| 91九色精品人成在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 久久久久亚洲av毛片大全| a级片在线免费高清观看视频| 久久久国产精品麻豆| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 视频区图区小说| 亚洲国产中文字幕在线视频| 热re99久久国产66热| 亚洲熟女毛片儿| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 一二三四在线观看免费中文在| 日本一区二区免费在线视频| 精品人妻在线不人妻| 无遮挡黄片免费观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 99re在线观看精品视频| 国产真人三级小视频在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 91成年电影在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 在线观看免费日韩欧美大片| 午夜久久久在线观看| 午夜日韩欧美国产| 日韩欧美一区视频在线观看| 久99久视频精品免费| 亚洲av片天天在线观看| 日本欧美视频一区| 在线观看午夜福利视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 后天国语完整版免费观看| 亚洲色图综合在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 黄片播放在线免费| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲av第一区精品v没综合| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线永久观看黄色视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产成人精品无人区| 99热国产这里只有精品6| 怎么达到女性高潮| 亚洲中文字幕日韩| 天天影视国产精品| 久久天堂一区二区三区四区| 十八禁网站免费在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美成狂野欧美在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品久久久精品久久久| 曰老女人黄片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品美女久久av网站| 母亲3免费完整高清在线观看| www国产在线视频色| 久久青草综合色| 新久久久久国产一级毛片| 夜夜爽天天搞| netflix在线观看网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲一区二区三区不卡视频| 两个人免费观看高清视频| 国产黄色免费在线视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 天堂动漫精品| 国产亚洲欧美精品永久| 男人舔女人的私密视频| 中国美女看黄片| 可以在线观看毛片的网站| 波多野结衣av一区二区av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费在线观看日本一区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美精品一区二区免费开放| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品1区2区在线观看.| 天堂√8在线中文| 操美女的视频在线观看| 妹子高潮喷水视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产在线精品亚洲第一网站| 一级a爱片免费观看的视频| 大香蕉久久成人网| 欧美日韩瑟瑟在线播放| videosex国产| 国产精品一区二区免费欧美| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 无限看片的www在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 中文字幕色久视频| 999精品在线视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日韩精品青青久久久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久人妻福利社区极品人妻图片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久久久久大精品| 天堂影院成人在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 成年人免费黄色播放视频| 午夜老司机福利片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费高清在线观看日韩| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜福利一区二区在线看| 黄色片一级片一级黄色片| 水蜜桃什么品种好| 午夜亚洲福利在线播放| 免费一级毛片在线播放高清视频 | a级毛片在线看网站| 国产精品野战在线观看 | 欧美最黄视频在线播放免费 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品福利观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产成人免费无遮挡视频| 搡老岳熟女国产| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 91av网站免费观看| 91精品国产国语对白视频| 日本 av在线| 黄色片一级片一级黄色片| 久热爱精品视频在线9| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 黄色a级毛片大全视频| 乱人伦中国视频| 久久精品成人免费网站| a级毛片黄视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜成年电影在线免费观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费在线观看黄色视频的| 曰老女人黄片| 亚洲,欧美精品.| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜视频精品福利| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 天堂动漫精品| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久国产精品影院| 午夜免费观看网址| 久久性视频一级片| 可以在线观看毛片的网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 很黄的视频免费| 香蕉久久夜色| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲一码二码三码区别大吗| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 九色亚洲精品在线播放| 欧美日本中文国产一区发布| 极品人妻少妇av视频| 美女国产高潮福利片在线看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美性长视频在线观看| 欧美日韩黄片免| 69精品国产乱码久久久| 亚洲色图综合在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 成人三级黄色视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 久久婷婷成人综合色麻豆| 黄色女人牲交| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲色图综合在线观看| av免费在线观看网站| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜影院日韩av| 免费搜索国产男女视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲成人久久性| 极品教师在线免费播放| 欧美中文日本在线观看视频| 老司机亚洲免费影院| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美日韩视频精品一区| 午夜福利影视在线免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 后天国语完整版免费观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲七黄色美女视频| 女人被狂操c到高潮| 一级毛片高清免费大全| 亚洲欧美日韩无卡精品| 麻豆av在线久日| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美在线二视频| 久久精品91蜜桃| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产一区二区激情短视频| 大码成人一级视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美久久黑人一区二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲五月天丁香| 99精品在免费线老司机午夜| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲,欧美精品.| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲精品一二三| 成人黄色视频免费在线看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | www.自偷自拍.com| 国产精品av久久久久免费| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 香蕉丝袜av| av天堂久久9| 99国产极品粉嫩在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美成人免费av一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 91大片在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 色综合站精品国产| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲一区中文字幕在线| www.999成人在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 免费在线观看日本一区| 国产不卡一卡二| 最近最新中文字幕大全免费视频| 正在播放国产对白刺激| 成人三级黄色视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 大陆偷拍与自拍| 淫妇啪啪啪对白视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品高清国产在线一区| 国产一区在线观看成人免费| 免费看十八禁软件| 国产激情欧美一区二区| 午夜影院日韩av| 丝袜人妻中文字幕| netflix在线观看网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 香蕉国产在线看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 另类亚洲欧美激情| bbb黄色大片| 又黄又爽又免费观看的视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 操出白浆在线播放| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 宅男免费午夜| 性少妇av在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 88av欧美| 91麻豆av在线| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 男女之事视频高清在线观看| 成人精品一区二区免费| 天堂动漫精品| 国产精品 欧美亚洲| 韩国精品一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 在线天堂中文资源库| 黄色丝袜av网址大全| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲一区二区三区不卡视频| 1024香蕉在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 超碰成人久久| 乱人伦中国视频| 在线观看免费视频日本深夜| 国产黄a三级三级三级人| 欧美中文综合在线视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久亚洲真实| 亚洲精品久久午夜乱码| 三上悠亚av全集在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 身体一侧抽搐| 亚洲av电影在线进入| 久久伊人香网站| 国产深夜福利视频在线观看| a在线观看视频网站| 香蕉久久夜色| 99热只有精品国产| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| cao死你这个sao货| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久国产成人精品二区 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品影院久久| 久久中文字幕一级| 最新美女视频免费是黄的| 国产野战对白在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲五月天丁香| 一本综合久久免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 制服人妻中文乱码| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| av网站在线播放免费| 精品电影一区二区在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲五月色婷婷综合| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美人与性动交α欧美软件| 精品一区二区三卡| 精品久久久久久电影网| 天堂俺去俺来也www色官网| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | netflix在线观看网站| av有码第一页| 国产精品久久久久成人av| 日韩av在线大香蕉| 老司机在亚洲福利影院| 久久午夜亚洲精品久久| 新久久久久国产一级毛片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 99热只有精品国产| 美女福利国产在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 在线观看免费午夜福利视频| 美女大奶头视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 一二三四社区在线视频社区8| 怎么达到女性高潮| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲一区中文字幕在线| 大型av网站在线播放| 女同久久另类99精品国产91| 操出白浆在线播放| 99re在线观看精品视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久香蕉国产精品| www日本在线高清视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 久久性视频一级片| 日本五十路高清| 免费在线观看亚洲国产| 自线自在国产av| 视频区图区小说| 操出白浆在线播放| 在线观看免费视频日本深夜| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 韩国av一区二区三区四区| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日本欧美视频一区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 色在线成人网| 麻豆国产av国片精品| 精品国产亚洲在线| 最近最新免费中文字幕在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 国产免费男女视频| 香蕉丝袜av| 香蕉久久夜色| av在线天堂中文字幕 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 午夜久久久在线观看| www.999成人在线观看| 香蕉久久夜色| 黄片大片在线免费观看| 亚洲精品一区av在线观看| 日本三级黄在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| www日本在线高清视频| 国产精品偷伦视频观看了| 神马国产精品三级电影在线观看 | 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 成人特级黄色片久久久久久久| 热99re8久久精品国产| avwww免费| 看免费av毛片| 亚洲av熟女| 不卡一级毛片| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩欧美三级三区| 欧美乱色亚洲激情| 欧美乱妇无乱码| 自线自在国产av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 9热在线视频观看99| 制服诱惑二区| 国产又爽黄色视频| 国产精品电影一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 身体一侧抽搐| av网站在线播放免费| 成年人免费黄色播放视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 成人黄色视频免费在线看| 天天影视国产精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 麻豆久久精品国产亚洲av | 深夜精品福利| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久午夜亚洲精品久久| 国产xxxxx性猛交| 亚洲 欧美一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| ponron亚洲| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 91成年电影在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品久久久人人做人人爽| 午夜日韩欧美国产| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美性长视频在线观看| 久9热在线精品视频| 在线观看一区二区三区| 99国产精品99久久久久| 在线观看午夜福利视频| 亚洲成人免费av在线播放| 91老司机精品| 国产成人精品久久二区二区91| ponron亚洲| 国产精品永久免费网站| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲中文字幕日韩| 精品欧美一区二区三区在线| 国产黄a三级三级三级人| 欧美精品亚洲一区二区| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜福利,免费看| 老司机深夜福利视频在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| avwww免费| 亚洲国产欧美网| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲自拍偷在线| 看免费av毛片| 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜免费成人在线视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品国产精品久久久不卡| netflix在线观看网站| 长腿黑丝高跟| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美精品亚洲一区二区| 一区二区三区精品91| 日韩免费av在线播放| 性少妇av在线| 精品一品国产午夜福利视频| 国产高清videossex| 免费高清视频大片| 91九色精品人成在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲三区欧美一区| 欧美日韩一级在线毛片| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费 | cao死你这个sao货| 999精品在线视频| a级片在线免费高清观看视频| 一级片'在线观看视频| 国产精品二区激情视频| 欧美人与性动交α欧美软件| av网站免费在线观看视频| 身体一侧抽搐| 狂野欧美激情性xxxx| 午夜福利,免费看| av电影中文网址| 1024视频免费在线观看| 嫩草影视91久久| 国产亚洲欧美精品永久| 男女床上黄色一级片免费看|