血小板對單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展

張上上，張媛莉（.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江 52400；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東湛江 52400）

血小板是參與止血、維持血管壁完整性的無核細(xì)胞碎片。目前，研究者們已清楚認(rèn)識到血小板的非止血作用，如直接與細(xì)菌結(jié)合形成免疫性血栓，限制細(xì)菌在血流中播散；招募和刺激多種免疫細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞，增強(qiáng)其清除病原體、炎癥細(xì)胞因子釋放。因此，血小板具有免疫調(diào)節(jié)功能已形成共識。單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）是主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞系統(tǒng)，由單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞及樹突細(xì)胞(DCs)組成，具有抗感染、參與免疫應(yīng)答、維持穩(wěn)態(tài)等作用[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)血小板可通過膜表面受體及分泌細(xì)胞外囊泡調(diào)控MPS 功能，因此血小板具有用于判斷疾病進(jìn)展和病情轉(zhuǎn)歸標(biāo)志物的潛質(zhì)。為總結(jié)血小板調(diào)控MPS的機(jī)制，本文綜述如下。

1 血小板非直接接觸調(diào)節(jié)MPS功能

1.1 血小板分泌胞外囊泡（PEVs）調(diào)節(jié)MPS

PEVs來源于內(nèi)小體系統(tǒng)或從胞膜出芽的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)單位，前者生成的EVs 被稱為外泌體，后者被稱為微?；蛭⒛遗荩瑑烧咧睆?、內(nèi)含物有所差異，研究表明幾乎所有細(xì)胞均可分泌EVs，因其具有病理情況下數(shù)量增加、直接參與多種病理生理過程如凝血酶形成、攜帶信息影響靶細(xì)胞功能等特性而受到研究者們的關(guān)注[2]。PEVs 內(nèi)含物的種類與其受到的活化信號相關(guān)，包括多種蛋白、脂肪酸、non-coding RNA、mRNA[3]。

1.1.1 miRNA-126-3p miRNA 是 約19～24 個核苷酸組成長度的非編碼RNA，miRNA 具有特異性轉(zhuǎn)錄后調(diào)控效應(yīng)。既往研究發(fā)現(xiàn)，PEV 可將核酸、轉(zhuǎn)錄因子及線粒體轉(zhuǎn)至中性粒細(xì)胞并影響其基因表達(dá)[4]。受此啟發(fā)，Laffont 等[5]發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞包裹miRNA-126-3p 的PEV 后，4 個預(yù)測靶基因ATF3、ATP1B1、ATP9A、RAI14 的mRNA 表達(dá)量下降，除此之外TNFα、CCL4（C-C motif chemokine ligand 4）、CSF-1表達(dá)下調(diào)，吞噬功能增強(qiáng)，向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-126-3p sponge 可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)，值得注意的是，研究者認(rèn)為吞噬能力的顯著增加與miRNA-126-3p無直接相關(guān)，這是因為與吞噬功能相關(guān)的基因不受到miRNA-126-3p 直接調(diào)控，miRNA-126-3p 可能通過影響某種基因的表達(dá)間接影響吞噬功能。

1.1.2 CLEC5A 急性病毒感染可激活血小板和白細(xì)胞，引起以細(xì)胞因子風(fēng)暴為特征的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，因此血小板在某些病毒發(fā)病過程中起重要作用。登革病毒主要通過伊蚊傳播，可引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征。研究發(fā)現(xiàn)，登革病毒既活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子[6]，亦激活血小板分泌大量EVs[7]，對其致炎機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，CLEC5A 是登革病毒的模式識別受體，作為1 種表達(dá)在髓系細(xì)胞膜表面的C 型凝集素，其活化伴隨NALP3 炎癥小體的產(chǎn)生、大量促炎因子TNF-α、IL-6的分泌[8-9]，然而阻斷CLEC5A對感染致死量病毒的小鼠僅有部分保護(hù)作用，這證明存在其他因素參與登革病毒的發(fā)病機(jī)制[8]。Sung等[10]研究發(fā)現(xiàn)，登革病毒通過激活血小板膜CLEC2引起EVs 釋放，這部分EVs 通過CLEC5A/TLR2 活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6，同時阻斷CLEC5A/TLR2不但能減輕炎癥，還可以減輕病毒感染引起的血管通透性增加、增加實驗小鼠的存活率，該研究確定了CLEC2 與CLEC5A/TLR2 可作為登革病毒感染治療的潛在靶點，同時進(jìn)一步證實了血小板與巨噬細(xì)胞之間存在由胞外囊泡介導(dǎo)的緊密聯(lián)系。

1.1.3 CD40L 血小板活化或凋亡時釋放的EVs 含有CD40L、P-selectin、GPIb、GPⅡb-Ⅲa，這一特性使得PEVs 帶有與血小板相似的促炎、促凝功能[11]。Bei等[12]發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5（SSL5）激活血小板釋放PEVs 與單核細(xì)胞形成聚集，SSL5-PEVs 以劑量和時間依賴的方式刺激單核細(xì)胞表達(dá)和釋放炎癥介質(zhì)，包括IL-1β、TNF-α、MCP-1 及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9），SSL5-PEVs增強(qiáng)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移，阻斷CD40L顯著減少SSL5-PEVs 誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)釋放和遷移，此外，SSL5-PEVs與中間型單核細(xì)胞結(jié)合更多，該現(xiàn)象的具體機(jī)制需要更為深入的研究加以闡明。

1.2 血小板分泌趨化因子調(diào)節(jié)MPS

1.2.1 CCL5 趨化因子CCL5 又稱RANTES，是趨化性細(xì)胞因子CC亞族成員，該蛋白來源廣泛，多數(shù)組織在炎性因子IL-1β或TNF-α的刺激下可釋放CCL5。CCL5 主要由血小板、CD8+T、嗜酸性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分泌[13]，引導(dǎo)白細(xì)胞以多種方式遷移到炎癥病灶中，對多種病理過程起調(diào)節(jié)作用[14]。血小板CCL5 主要儲存在α-顆粒，活化分泌時至細(xì)胞外[15]。Hwaiz等[16]發(fā)現(xiàn)血小板源性CCL5 作用肺泡巨噬細(xì)胞，促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞分泌CXCL2有效地誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集，導(dǎo)致膿毒癥肺損傷。Alard 等[17]發(fā)現(xiàn)，血小板CCL5 與中性粒細(xì)胞HNP1 形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)異構(gòu)體，干擾該異構(gòu)體可以抑制單核細(xì)胞的粘附作用，該研究為治療單核細(xì)胞參與的急慢性炎癥提供了潛在的標(biāo)靶。除了在炎癥初始階段發(fā)揮作用，CCL5 在炎癥后期亦發(fā)揮重要作用。Aswad等[18]發(fā)現(xiàn)CCL5在炎癥消退期可與巨噬細(xì)胞非典型趨化因子受體D6 結(jié)合，激活D6+/+巨噬細(xì)胞JNK 和MAPK 通路，使其炎癥表達(dá)重編程，主要表現(xiàn)為減少LPS 刺激的TNF-α 和IL-12釋放。

1.2.2 CXCL4 趨化因子CXCL4 別稱血小板因子4（PF4），與CXCR3 結(jié)合激活多種分子內(nèi)通路，在動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)揮重要作用[19-20]。Sachais 等[21]發(fā)現(xiàn)PF4 基因敲除(PF4-/-)小鼠動脈粥樣硬化減少。Gleissner 等[22]研究提示PF4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化，導(dǎo)致動脈粥樣硬化保護(hù)受體CD163 下調(diào)，表達(dá)血紅素氧合酶-1 能力下降。此外，有研究表明，腦血管疾病患者血小板來源外泌體PF4 較健康對照組明顯升高[23]。值得注意的是，CXCL4 包含1 個在c 端的3 種氨基酸的結(jié)構(gòu)上有所不同的亞型，被稱為CXCL4L1[24]。CXCL4L1 在誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化方面有所差異[25]。除此以外，CXCL4 通過與CCL5 形成異構(gòu)體，增加CCL5 招募單核細(xì)胞的能力，注射CXCL4-CCL5 血凝劑的抑制劑MKEY 后中風(fēng)后腦梗死區(qū)域減小，巨噬細(xì)胞浸潤減少[26]。

1.3 血小板裂解物調(diào)節(jié)MPS

目前獲取治療目的樹突狀細(xì)胞最廣泛的方法之一是從外周血單核細(xì)胞分化成為樹突狀細(xì)胞，該方法依賴于GM-CSF 和IL-4[27]。自20 世紀(jì)90 年代中期以來，這種單核細(xì)胞衍生的DC 越來越多地被用于癌癥的免疫治療，且被證實可以提高患者的生存時間和抗腫瘤免疫功能[28-29]。此外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，DCs在免疫耐受誘導(dǎo)中的作用，使用耐受性DCs(TolDCs)作為免疫抑制細(xì)胞的趨勢正在上升，這種TolDCs 可用于移植、自身免疫性和慢性炎癥性疾病[30-31]。但目前生產(chǎn)用于臨床的DCs 必須符合GMP 標(biāo)準(zhǔn)（Good Manufacturing Practice），即要求在生產(chǎn)過程中避免在培養(yǎng)基中使用動物血清如胎牛血清，一方面是基于倫理學(xué)保障幼體動物權(quán)益的要求，另一方面胎牛血清與人血清相比具有潛在的非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，胎牛血清中存在的大量蛋白質(zhì)可作為1 個重要的異源抗原，被DC吸取并影響抗原提呈功能[32]。因此，建立適合DCs 生長的培養(yǎng)基成為迫切的需要。曾有研究將過期的血小板制品反復(fù)凍融使血小板裂解釋放生長因子，所提取的裂解物能替代胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的地位，并被廣泛利用于間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)[33-35]。受此啟發(fā)，?vajger等[36]對血小板裂解物影響單核細(xì)胞分化為DCs潛力的效果進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)血小板裂解物可以激活與DCs分化和成熟相關(guān)的關(guān)鍵信號蛋白，所生成的DCs表現(xiàn)出形態(tài)正常，生存能力和內(nèi)吞細(xì)胞的能力正常。為進(jìn)一步評估血小板裂解物在培養(yǎng)成熟DCs方面的價值，Te?i?等[37]將其與傳統(tǒng)的無血清培養(yǎng)法進(jìn)行比較，這部分DCs形態(tài)、表型及內(nèi)吞能力相近，與淋巴結(jié)歸巢能力相關(guān)的CCR7 表達(dá)量更高，然而刺激T 細(xì)胞向CD4+T 細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞分化的能力遠(yuǎn)不如傳統(tǒng)無血清培養(yǎng)法，而且刺激Th1 極化型T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化的能力亦有所缺陷，因此應(yīng)用血小板裂解物培養(yǎng)DCs 用于抗腫瘤細(xì)胞免疫疫苗仍有待評估，未來亦需要進(jìn)一步完善實驗方案。

2 血小板直接接觸調(diào)節(jié)MPS

血小板膜表面存在大量功能受體，這些受體在血小板活化時可發(fā)生結(jié)構(gòu)及數(shù)目的改變，從而調(diào)節(jié)白細(xì)胞的功能。

2.1 GPIb-Ⅸ

血小板GPIb-Ⅸ是介導(dǎo)血小板與vWF 聯(lián)結(jié)的特征性粘附受體，有助于止血和血栓形成。除此之外，還能與白細(xì)胞膜表面整合素Mac-1 相結(jié)合。Corken等[38]發(fā)現(xiàn)GPIb-Ⅸ缺陷小鼠的血小板-單核細(xì)胞復(fù)合體數(shù)目較野生型小鼠明顯減少，盲腸結(jié)扎穿刺法誘導(dǎo)膿毒癥24 h 后其血清TNF-α 及來源于單核細(xì)胞的炎癥因子如巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β（MIP-1β）、MCP-1 較野生型升高，因此血小板可能通過膜GPIb-Ⅸ抑制單核細(xì)胞炎癥表達(dá)。

然而，Carestia 等[39]研究呈現(xiàn)相反的結(jié)果，血小板使單核細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞分化傾斜，這部分巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及吞噬細(xì)菌能力增強(qiáng)，在感染后短時間內(nèi)輸注血小板可提高膿毒癥血小板減少組小鼠細(xì)菌清除率和存活率，阻斷GPIb-Ⅸ-Mac-1 軸可消除上述效應(yīng)，研究者認(rèn)為血小板能通過GPIb-Ⅸ向單核細(xì)胞傳遞信息使其向促炎型巨噬細(xì)胞進(jìn)行分化，這種生物學(xué)行為有助于在機(jī)體感染時清除細(xì)菌，需要特別注意的是，血小板與單核細(xì)胞進(jìn)行體外共培育時，可以吸收單核細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 及抗炎細(xì)胞因子IL-10，這可能解釋了膿毒癥血小板減少小鼠血清TNF-α 和IL-6 水平升高這一現(xiàn)象[40]。綜上所述，GPIb-Ⅸ是血小板調(diào)節(jié)MPS 的重要結(jié)構(gòu)，但該雙向效應(yīng)的具體機(jī)制仍有待探究。

2.2 GPIIb-IIIa

血小板聚集及血栓形成需要膜GPIIb/IIIa受體與纖維蛋白原結(jié)合，GPIIb 和GPIIIa 需以Ca2+依賴性二聚體形式結(jié)合才能發(fā)揮其功能。Kastrup 等[41]發(fā)現(xiàn)炭疽桿菌可引起模擬血流模型的血小板聚集，研究人員將其解釋為血小板聚集可能為炭疽桿菌提供免受免疫細(xì)胞吞噬或者限制血流細(xì)菌擴(kuò)散。據(jù)此，研究者們推測血小板在血管中巡邏、以某種特定的方式感知并定位至血流中的細(xì)菌，而這種生物學(xué)行為可能通過KCs實現(xiàn)，因為肝竇每分鐘可過濾體內(nèi)1/3血流，而肝竇內(nèi)存在大量KCs，這一結(jié)構(gòu)可形成有效攔截血流細(xì)菌的天然屏障。后來Jenne 等[42]發(fā)現(xiàn)用LPS 刺激小鼠4 h后，肝臟內(nèi)血小板與KCs粘附顯著增加，后續(xù)研究用激光共聚焦顯微鏡觀察到，在正常情況下，肝血竇內(nèi)的血小板通過GP I bα 與KCs 膜表面vWF 形成“touch-and-go”，該結(jié)構(gòu)使血小板與KCs 短暫的對接，形成肝血竇獨有的血小板巡邏現(xiàn)象，vWF 為循環(huán)中的血小板創(chuàng)造了理想的“著陸墊”，蠟狀芽孢桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌入侵時可被KCs捕獲，并觸發(fā)血小板從“touch-and-go”粘附轉(zhuǎn)換由GPIIb-IIIa 介導(dǎo)的緊密粘附結(jié)構(gòu)，從而包裹細(xì)菌，限制細(xì)菌從KCs中逃逸，該研究展示了血小板在血流中協(xié)同KCs捕獲細(xì)菌的機(jī)制[43]。值得注意的是，研究者后續(xù)并沒有對KCs 的吞噬、炎癥介質(zhì)釋放等功能的變化展開探究，因此仍有必要設(shè)置科學(xué)的實驗完善該學(xué)說。

2.3 P-selectin（CD62P）

P-selectin 是屬于1 型跨膜糖蛋白，靜息狀態(tài)下主要儲存于血小板α-顆粒，血小板活化后P-selectin 從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞膜，因此將其視為血小板活化程度的1種標(biāo)志物。研究表明，炎癥狀態(tài)下活化血小板P-selectin 可以與中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞膜表面P 選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1）相接觸，通過ERK1/2 MAPK通路引起其細(xì)胞膜整合素構(gòu)象改變，最終介導(dǎo)其穿過血管到達(dá)間質(zhì)[44]。

有研究顯示，血小板可激活外周血單核細(xì)胞的抗原交叉呈遞功能，并促使單核細(xì)胞分化為成熟的生理性樹突細(xì)胞，該過程伴隨P-selectin-PSGL-1“黏附突觸”的形成、細(xì)胞內(nèi)鈣流動、NFkB 的核定位及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化[45]。血液中自然產(chǎn)生的樹突細(xì)胞占循環(huán)白細(xì)胞比例少于1%，現(xiàn)階段為滿足研究和臨床治療需要，通常使用超過生理濃度的細(xì)胞因子培養(yǎng)7 d以產(chǎn)生足量樹突細(xì)胞，然而，這種體外細(xì)胞因子刺激產(chǎn)生的樹突狀細(xì)胞生物學(xué)完整性缺失，用于免疫治療的效果較差。該研究證實血小板參與樹突細(xì)胞的非細(xì)胞因子依賴性成熟路徑，未來需要對這種樹突細(xì)胞的功能進(jìn)一步評估。除此之外，Ivano 等[46]研究顯示活化血小板可通過P-selectin 促使單核細(xì)胞快速釋放組織因子（TF），該過程不依賴新TF 蛋白的合成，即使去除血小板激活劑，已被激活的血小板也能觸發(fā)TF釋放，而且血小板激動劑、釋放物均不能單獨觸發(fā)單核細(xì)胞釋放TF，因此作者認(rèn)為P-selectin-PSGL-1對于這一效應(yīng)是必要的。

2.4 CD40L

CD40L 是在活化血小板膜上高表達(dá)的跨膜蛋白，血小板CD40L 與其他細(xì)胞膜表面CD40 結(jié)合可啟動廣泛的生物效應(yīng)，包括炎癥和淋巴細(xì)胞的成熟[47]。Nishat 等[48]研究結(jié)果顯示，凝血酶活化的血小板釋放CD40L 增強(qiáng)骨髓來源樹突細(xì)胞對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的吞噬能力，促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟標(biāo)志物CD80上調(diào)，炎癥因子TNF-α、IL-12、IL-6表達(dá)升高，吞噬功能被Cytochalasin D 阻斷，表明吞噬能力的增強(qiáng)與細(xì)胞骨架的重排有關(guān)。相反，Singh 等[49]研究發(fā)現(xiàn)，與血小板體外共培育的單核細(xì)胞分化為功能缺陷型樹突細(xì)胞，即表現(xiàn)為膜表面CD206、CD80、CD86、CCR7、樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間粘附分子-3-抓取非整合素表達(dá)下降，抗原攝取能力降低，活化幼稚CD4+和CD8+T細(xì)胞以及分泌IL-12p70的能力也降低，這導(dǎo)致樹突細(xì)胞對HIV 抗原的1 型免疫應(yīng)答能力降低，研究者認(rèn)為用氯吡格雷、普拉格雷等抗血小板藥物可阻斷生成功能缺陷樹突細(xì)胞，以達(dá)到增強(qiáng)對HIV免疫控制的目的。

2.5 actin

髓系細(xì)胞觸發(fā)受體（TREM）家族主要表達(dá)于中心粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞膜表面，由TREM-1、TREM-2、TREM-3 組成，是模式識別受體中的一大類。過去20 年間，TREM-1 的促炎效應(yīng)受到廣泛關(guān)注，并被證實為膿毒癥治療的1 個新靶點[50]。Yang等[51]研究結(jié)果顯示，血小板可增強(qiáng)LPS 引起的巨噬細(xì)胞IL-1β 表達(dá)，而競爭性抑制TREM-1 可阻斷該效應(yīng)，因此可以確定血小板上分布著1種天然的TREM-1配體，但具體是何種物質(zhì)尚未明了。據(jù)此，F(xiàn)u 等[52]進(jìn)行了深入研究，結(jié)果顯示血小板膜肌動蛋白（actin）可與TREM-1 相互結(jié)合，激光共聚焦顯微鏡觀察到膿毒癥小鼠血小板actin 與巨噬細(xì)胞TREM-1 共定位；此外，重組肌動蛋白不能增強(qiáng)trem1-/-小鼠的炎癥應(yīng)答，對野生型小鼠的炎癥增強(qiáng)作用可被TREM-1 抑制劑LP17抑制，且呈劑量依賴關(guān)系，膿毒癥小鼠肺部組織切片亦提示actin-TREM-1 共定位的存在。該研究確定了血小板actin是TREM-1的新配體，當(dāng)發(fā)生感染時血小板可通過該途徑擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。

3 結(jié)語

臨床上多種疾病的轉(zhuǎn)歸與血小板有關(guān)，如感染導(dǎo)致的膿毒癥血小板減少患者死亡風(fēng)險增加，這部分患者體內(nèi)面臨嚴(yán)重的免疫狀態(tài)失調(diào)[53]。MPS 作為主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞系統(tǒng)，血小板對其功能強(qiáng)有力的調(diào)控顯得尤為重要。

事實上，盡管大量細(xì)胞及動物研究已經(jīng)證明活化的血小板通過招募和激活單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，影響其功能表達(dá)，但鑒于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，在臨床上確定兩者相互作用與疾病進(jìn)展和結(jié)局的相關(guān)性仍具有挑戰(zhàn)性。循環(huán)系統(tǒng)中的miRNA 以單鏈的形式存在，容易被核酸酶降解，但其特有的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控效應(yīng)深受研究者青睞，因此篩選合適的miRNA 并利用血小板胞外囊泡作為穩(wěn)定載體，靶向調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞將會是極有前景的研究方向。