血清標志物對抗病毒下HBV相關肝癌預測及診斷的研究進展

朱倩鈺 馬紅

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第四大癌癥致死病因，慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是亞洲人群發(fā)生HCC的重要原因。且有數(shù)據(jù)表明在我國HCC患者中，有86%為HBV感染所致[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，抗病毒治療能夠明顯降低肝癌的發(fā)生率，但仍不能徹底消除發(fā)生HCC的風險[2]。目前歐肝指南推薦抗病毒期間至少每6個月監(jiān)測腹部超聲，而亞洲國家指南多推薦血清學標志物+腹部超聲聯(lián)合模式[3-4]，強調(diào)了血清學標志物對尚未形成影像學改變的HCC的監(jiān)測的重要意義。

一、抗乙型肝炎病毒治療可降低但不能消除肝癌的發(fā)生

乙型肝炎抗病毒藥物包括核苷酸類似物(Nucleotide analogues,NAs)及干擾素(Interferon,IFN)，其作用為抑制HBV復制, 減輕肝細胞炎性壞死及纖維化, 從而減少肝硬化失代償、HCC和其他并發(fā)癥的發(fā)生[5]。然而，國外一項系統(tǒng)性回顧研究[6]表明僅有中等質(zhì)量級別的證據(jù)支持處于免疫活動期的慢性乙型肝炎患者接受抗病毒治療可減少發(fā)生HCC的風險。我國臺灣地區(qū)也有長期大樣本的[7]回顧性研究顯示抗病毒治療組7年HCC累計發(fā)生率為7.3%，而對照組為22.7%。這證實了慢性乙型肝炎患者長期接受抗病毒治療有助于降低肝癌發(fā)生風險, 但是無法徹底消除發(fā)生HCC的風險。

二、抗病毒治療下發(fā)生肝癌的危險因素及預測模型

(一)抗病毒治療下發(fā)生肝癌的危險因素 既往研究證實年齡、性別、HCC家族史等患者特征與慢性乙型肝炎患者發(fā)生HCC相關。而目前隨著生活質(zhì)量的提高，中國人群代謝綜合征的發(fā)生率日漸增加，有學者[8]研究了代謝綜合征對中國大陸慢性乙型肝炎患者肝細胞癌風險的影響，結果表明代謝綜合征對肝癌風險增加2倍。中心性肥胖和2型糖尿病與肝細胞癌風險顯著增加有關。對于合并脂肪肝的乙型肝炎患者，HCC風險增加的主要原因可能為脂肪肝引起抗病毒藥物療效下降進而影響病毒轉(zhuǎn)陰率。

在乙型肝炎抗病毒治療過程中，病毒學指標及肝臟炎癥指標是兩大重點關注指標。在長期隨訪過程中部分患者HBV DNA始終輕度升高或反復間斷異常，或可增加HCC發(fā)生風險。國外一項長期回顧性隊列研究[9]分析低水平病毒血癥(HBV DNA<2 000 IU/mL)對肝細胞癌風險的影響，結果發(fā)現(xiàn)低水平病毒血癥患者與持續(xù)病毒學應答(HBV DNA<12 IU/mL)患者發(fā)生肝細胞癌的風險比為1.98(P=0.002)。此外，我國香港的一項回顧性研究[10]發(fā)現(xiàn)，當HBV DNA為陰性時(<20 IU/mL)，達到乙型肝炎表面抗原血清學轉(zhuǎn)換可進一步降低患肝癌的風險。近年來，有學者關注乙型肝炎核心相關抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)在HCC的預測作用[11]，該研究包括76例HBV DNA陰性的肝癌患者和152例對照，以上患者均接受NAs治療，結果顯示當以HBcrAg≥7.8 kU/mL為cutoff值時，HCC發(fā)生的AUROC為0.61，可為HBV DNA陰性時HCC的發(fā)生提供有效預測。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)是反應肝臟炎癥的最重要指標，ALT復常有利于改善組織學病變進展。ALT的升高倍數(shù)和復常時間的長短或可為抗病毒下HCC發(fā)生的危險因素。我國香港的一項隊列研究[12]納入21 182例接受NAs治療的慢性乙型肝炎患者，根據(jù)AASLD指南標準評估抗病毒治療12個月時的ALT情況與遠期肝細胞癌風險。結果表明HCC累積發(fā)生率在治療12個月時ALT正常組、ALT(1～2×ULN)組及ALT(≥2×ULN)組呈升高趨勢，且三組之間存在統(tǒng)計學差異。

近年研究者們發(fā)現(xiàn)，大部分長期規(guī)律服用抗病毒藥物且定期隨訪的患者均可達到轉(zhuǎn)氨酶復常及HBV DNA陰性，甚至部分腫瘤標記物正常的患者卻仍進展為HCC。故開始有研究關注到腫瘤標記物的逐漸升高趨勢(即使在正常范圍內(nèi))也是HCC發(fā)生的危險因素。國外一項研究[13]顯示在抗病毒治療下甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)超過7 ng/ml可以預測1年內(nèi)HCC的發(fā)生。Choi J[14]等研究也發(fā)現(xiàn)HCC患者異常凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin ，DCP)水平從確診HCC前半年開始升高，甲胎蛋白異質(zhì)體(lectin-reactive AFP，AFP-L3)則從確診前1年開始升高?；谏鲜鑫ｋU因素，研究者提出了很多關于HBV患者發(fā)生HCC的預測模型。

(二)乙型肝炎肝癌預測模型 在過去十年來，國內(nèi)外已有多種預測模型。“GAG-HCC”[15]評分包含因素為年齡、性別、HBV DNA、核心啟動子突變與肝硬化，HCC 5年預測的AUC值為0.88，10年AUC值為0.89，但因突變這一因素在臨床實踐中的局限性，目前并不是很實用。為解決這一問題，Wong VW等[16]提出了包含年齡、白蛋白、膽紅素、HBV DNA和肝硬化五個因素的CU-HCC模型，該模型5年預測的AUC值為0.76，10年AUC值為0.78。2011年，有研究者等[17]提出包含年齡、性別、ALT、HBeAg狀況、HBV DNA水平的“REACH-B”評分，5年AUC值為0.759，有同等預測價值。肝臟彈性測定在臨床中普遍應用之后，Wong GL等[18]建立了基于肝臟硬度值(liver stiffness measurement，LSM)的LSM-HCC預測模型，5年AUC值為0.83，預測價值更佳。

在目前抗病毒時代，病毒復制被很好抑制，上述基于HBV DNA的模型可能不再實用，Jung KS等[19]在2015年提出mREACH-B評分模型，將LSM替換HBV DNA，并驗證了上述四種模型，結果發(fā)現(xiàn)mREACH-B評分模型對HCC預測的AUC值最高。此外，國外一項基于高加索人群[20]的研究建立了PAGE-B評分，該評分系統(tǒng)僅包括年齡、性別及血小板，當PAGE-B評分≥10時，預測前5年HCC發(fā)展的敏感度100%，特異度41.2%，陽性預測值9.8%，陰性預測值100%。如今開始有研究關注腫瘤標記物單獨或聯(lián)合其他指標對HCC的預測作用。劉夢曉[21]研究發(fā)現(xiàn)，AFP聯(lián)合LSM、FIB-4指數(shù)可顯著提高預測慢性乙型病毒性肝炎肝硬化患者發(fā)生HCC的診斷效能，AUC值為0.973。但目前關于將腫瘤標志物納入HCC預測模型的研究并不多，有待進一步探索。

三、血清學標志物在HCC診斷中的應用

HCC的監(jiān)測主要分為血清學上及影像學上的監(jiān)測，對于尚未形成影像學改變的HCC患者，其血清學指標的變化往往更能及早的做出預警。目前常用的HCC相關血清標志物包括AFP、AFP-L3、DCP等經(jīng)典標志物以及新型標志物如微小RNA(miRNA)、熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，Hsp)等，不同標志物聯(lián)合檢測更有效提高了HCC診斷的準確率。

(一)HCC經(jīng)典腫瘤標志物 即便歐肝和美肝指南未強烈推薦應用AFP作為HCC篩查，但在以HBV感染為主的亞洲地區(qū)，AFP仍是HCC監(jiān)測中最常用的血清學標志物。我國最新版原發(fā)性肝癌診療規(guī)范中(2019版)[22]仍規(guī)定，AFP對肝癌的診斷界值為400 μg/L。但以此作為抗病毒治療下HCC診斷界值時，其靈敏度不免會偏低。國外一項研究[23]得出，在ETV抗病毒治療下AFP最佳診斷界值為13 ng/mL，此時敏感度為50.0%，特異度為98.8%，陽性預測值為77.8%，陰性預測值為96.1%。近年有研究將AFP的界值制定的更低(5～12 ng/mL)[14,24-25]，上述研究成果均提示在應用血清AFP診斷HCC時，對于接受抗病毒治療的患者應適當降低診斷界值。

近年來DCP也是一種常用于肝癌診斷的標志物，目前已應用于臨床，由于DCP和AFP產(chǎn)生的途徑及機制的不同，因此兩者在血清中含量是相對獨立的，無相關性，聯(lián)合檢測有助于提高肝癌檢出的效能。國外一項研究[26]以DCP cut off值為42 mAU/mL，AFP cut off值為5.5 ng/mL，得出單項檢測時DCP的敏感度明顯高于AFP(77% vs 61%)，當兩項指標聯(lián)合檢測時AUC可達0.826。

AFP-L3由惡性腫瘤細胞產(chǎn)生, 也是公認的預測肝癌的有效指標，與DCP一同可為AFP陰性的HCC患者進行早期診斷。Lim TS[27]等研究表明三者聯(lián)合檢測(cut off值:AFP 20 ng/mL，DCP 40 mAU/mL，AFP-L3 5%)較單一指標可提高早期肝癌和小肝癌的診斷率。Choi J等[14]研究也證明AFP和AFP-L3聯(lián)合應用(cut off值分別為5 ng/mL和4%)顯著提高了早期HCC檢測的敏感性。但需指出的一點是，以上對于DCP及AFP-L3的研究所納入的HCC患者不僅僅是乙型肝炎患者，且未明確是否經(jīng)治，目前在抗病毒治療的背景下，三聯(lián)檢對乙型肝炎肝癌預警作用的報道尚不多，需要更多的研究探索。

(二)HCC診斷的新型標志物 miRNA是在動物、植物以及一些病毒中發(fā)現(xiàn)的約22個核苷酸的短鏈非編碼RNA分子, 參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前miRNA在肝癌診斷及預后方面也體現(xiàn)出了潛在價值，也被我國最新版原發(fā)性肝癌診療規(guī)范中所提及。Ning SF等[28]研究表明，miR-155、miR-96、miR-99a可以作為肝癌診斷的生物標志物，三者及三者結合診斷的曲線下面積分別為0.84、0.824、0.799和0.931，且三種miRNAs聯(lián)合AFP對肝癌的診斷準確率更高(AUC為0.979；敏感性為90.0%；特異性為100.0%)。

熱休克蛋白(HSP)是在從細菌到哺乳動物中廣泛存在一類熱應激蛋白質(zhì)，按照蛋白的大小共分為五類，分別為HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子熱休克蛋白(small Heat Shock Proteins,sHSPs)。有研究[29]發(fā)現(xiàn)Hsp70在肝癌組中的表達水平明顯高于肝硬化組(P=0.003)，肝癌診斷靈敏度為98.9%,特異度為77.8%，且在低分化組和中分化組的表達水平高于高分化組(P<0.05)，表明Hsp70對肝癌的診斷具有重要的臨床和病理意義。Fu等[30]研究也發(fā)現(xiàn)Hsp90α診斷AFP陰性肝癌患者的靈敏度為93.9%, 特異度為91.3%；同時對于早期肝癌及小肝癌(≤3 cm)也有一定的診斷能力。由此可見，HSP目前在肝癌的診斷方面也顯示出良好的前景。

已研究過的其他HCC血清標志物還有循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、鱗狀細胞癌抗原(SCCA)等[31]，聯(lián)合檢測敏感度及特異度高，可用于早期診斷，但目前上述血清標志物尚未推薦用于HCC臨床監(jiān)測，更需進一步探索研究。

(三)HCC診斷模型 2013年有研究者建立了以性別、年齡、AFP、AFP-L3及DCP 5個變量構成的GALAD肝癌診斷模型，且有后續(xù)研究證明該模型的診斷效能優(yōu)于AFP/DCP/AFP-L3三聯(lián)檢或任意單檢[32]。近年，有研究[33]驗證了此模型在中國患者中的效能，并探索出一套新的更適合中國患者的剔除AFP-L3后的ASAP診斷模型。經(jīng)分析，ASAP模型的診斷效能優(yōu)于GALAD評分(P=0.006)。紀冬教授團隊[34]研究出基于年齡、LSM和AFP的ALA早期無創(chuàng)預警模型(ALA=0.103×Age+0.116×LSM+0.026×AFP；cut off值：age 51歲，LSM 27 kPa，AFP 38 ng/mL)，建模組ALA的AUROC為0.91，使用ALA分值9.61作為截斷值，驗模組診斷HCC的準確度為84.3%，有著良好的預警效能，并且簡單易行、經(jīng)濟無創(chuàng)、可重復性高。此項研究的研究對象均為乙型肝炎患者，但同樣上述模型的建立均未明確是否行抗病毒治療，或許在抗病毒的基礎上，以上變量的界值會有所降低，可進一步研究。

四、總結

抗病毒治療雖然能夠降低肝癌的發(fā)生率，但仍不能徹底消除發(fā)生HCC的風險。即使在抗病毒下，也仍存在發(fā)生HCC的危險因素，故應加強對高?；颊哌M行定期的監(jiān)測及早診斷。目前,，學者們開始關注血清學標志物對于如今抗病毒環(huán)境下HCC發(fā)生的預測及診斷的價值。但目前指南仍尚未明確血清標志物在抗病毒治療下的診斷界值，因此，血清標志物單獨或聯(lián)合檢測在抗病毒治療下對HCC的預測及診斷價值仍有待進一步研究。