油菜黑脛病菌T-DNA插入致病力減弱突變體的篩選及側(cè)翼序列分析

皇甫海燕，史志丹，郝麗芬，燕孟嬌，宋培玲，楊永青，賈曉清，皇甫九茹，郭 晨，李子欽

(內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院 植物保護研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

油菜黑脛病(Blackleg)，是由黑脛病菌(Leptosphaeriabiglobosa)病原真菌引起的一種真菌病害[1]，可危害油菜的葉片、莖稈、角果等組織[2]，導(dǎo)致我國油菜產(chǎn)量損失、品質(zhì)下降[3-4]。目前，我國已經(jīng)開展了油菜Leptosphaeriabiglobosa的生物學特性[5-6]、侵染條件和途徑[7]、遺傳多樣性[8]、致病力分化[9]等方面的研究，但還未見關(guān)于黑脛病菌致病機制研究的報道。

T-DNA插入目的基因的突變體技術(shù)是將T-DNA片段隨機插入病原菌基因組引起某段基因突變，從而造成該基因功能缺失，進而通過表型變化來解析目的基因功能的方法[10]。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)是應(yīng)用最為廣泛的T-DNA突變體技術(shù)，該方法具有插入拷貝數(shù)少、轉(zhuǎn)化效率高[11]、操作簡便并易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子等特點[12]。利用該方法構(gòu)建突變體庫，從中篩選獲得致病力減弱的突變體，通過對病原菌的表型鑒定和分析插入位點的側(cè)翼序列，確定發(fā)生突變的基因，分離和研究病原菌致病相關(guān)基因及其功能[13]。目前T-DNA 插入位點側(cè)翼序列的擴增多采用半隨機引物PCR法，主要包括：熱不對稱交錯PCR法(TAIL-PCR)、高效熱不對稱交錯PCR(Hi TAIL-PCR)、限制位點PCR(Restriction-site PCR，RSPCR)、單寡核苷酸巢式PCR(Single oligonucleotidenested PCR，SON-PCR)，其中前2種方法應(yīng)用較多[14]。因此，本研究從T-DNA插入Leptosphaeriabiglobosa突變體庫中，篩選致病力減弱的突變體，并對其表型特征進行觀察，隨后利用Hi TAIL-PCR擴增其側(cè)翼序列，通過GenBank上Blast比對序列，初步確定了致病力減弱突變體的T-DNA插入位點側(cè)翼序列，為進一步篩選Leptosphaeriabiglobosa致病基因提供研究基礎(chǔ)，并為其致病機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料、菌株及質(zhì)粒 供試甘藍型油菜品種為青雜5號；野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院植物保護研究所保存。Leptosphaeriabiglobosanm-1T-DNA突變體庫由雙元載體pCH-sGFP-GUS作為轉(zhuǎn)化供體所得，其中pCH-sGFP質(zhì)粒由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學趙君教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶PstⅠ，DNA瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒，CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒，購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司；地高辛雜交檢測試劑盒Ⅱ(化學發(fā)光法)，PCR DIG Probe Synthesis Kit，購自Roche公司；HyBond N+正電荷尼龍膜，購自Amersham公司；引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 致病力減弱突變體的篩選 基于前期試驗，構(gòu)建獲得T-DNA突變體庫[15-16]，從中隨機挑取16株單孢分離后的突變體菌株，以野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1為對照，接種于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)12～15 d，刮取分生孢子，制備孢子懸浮液，將濃度調(diào)至0.2×106個/mL后備用。采用穿刺接種法[17]對突變體的致病性進行鑒定，具體是將10 μL的孢子懸浮液接種于油菜子葉上，每個突變體最少接種10片子葉，12 d后調(diào)查油菜的發(fā)病情況及病情指數(shù)，篩選出致病力減弱突變體，重復(fù)3次。

1.2.2 致病力減弱突變體菌落形態(tài)及生長速率測定 調(diào)查不同突變體菌株的致病力，挑選出致病力下降程度大的突變體菌株，以野生型Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對照，將菌餅(Φ=3.5mm)轉(zhuǎn)接在PDA上，25 ℃培養(yǎng)7 d后，觀察其菌落形態(tài)，并拍照記錄，同時測量菌落直徑，計算菌絲生長速率(cm/d)，重復(fù)3次。

1.2.3 致病力減弱突變體菌株產(chǎn)孢量的測定 將以上挑選的致病力減弱突變體，以Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對照，PDA上25 ℃培養(yǎng)14 d后，獲得分生孢子懸浮液后，利用血球計數(shù)板計數(shù)，計算其產(chǎn)孢量，重復(fù)3次。

1.2.4 致病力減弱突變菌株的Southern Blot檢測 CTAB法提取致病力減弱突變體和Leptosphaeriabiglobosanm-1基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切，電泳后轉(zhuǎn)到尼龍膜上，采用紫外交聯(lián)儀將核酸固定。再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的DIG標記探針進行雜交，雜交完成后進行洗膜及信號檢測。

1.2.5 T-DNA插入側(cè)翼序列的克隆、測序和分析 利用高效熱不對稱交錯PCR(Hi TAIL-PCR)擴增T-DNA插入側(cè)翼序列，簡并引物為LAD1～LAD5；特異性嵌套引物為RB1～RB3(表1)，與通用簡并引物LAD和接頭序列AC組合，以野生型菌株和致病力減弱突變體菌株基因組DNA 為模板進行3 輪Hi TAIL-PCR 反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序參照文獻[18]，將第3輪PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收、TA 克隆，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast查詢比對。

表1 Hi TAIL-PCR擴增側(cè)翼序列引物Tab.1 Primers for amplifying flanking sequence by Hi TAIL-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 致病力減弱突變菌株的獲得

測定16株突變體菌株的致病力(圖1)，野生型菌株Leptosphaeriabiglobosanm-1作為對照，其中3株突變體菌株的相對病情指數(shù)顯著高于對照(P>0.05)，分別是T17、T18、T21。12株突變體菌株的相對病情指數(shù)比對照小，分別為T1、T3、T4、T5、T7、T8、T9、T10、T11、T12、T13、T14。其中野生型菌株nm-1病情指數(shù)為48.6，突變體T1的病情指數(shù)為35.5，T3為32.5，T4為31.3，T5為41.3，T7為35.3，T8為42.3，T9為31.0，T10為42.5，T11為25.4，T12為46.3，T13為44.6，T14為37.8，分別降低了27.0%，33.2%，35.8%，15.0%，27.4%，36.2%，13.0%，36.2%，12.6%，47.7%，8.2%，22.2%。與野生型菌株nm-1相比，T1、T3、T4、T5、T7、T9、T11、T14這8株突變體菌株的致病力顯著降低(P<0.05)，為致病力減弱菌株。

2.2 致病力減弱突變體的菌落形態(tài)特征

通過上述試驗，最后篩選出6個致病力減弱突變體(T1、T3、T4、T7、T9、T11、T14)，培養(yǎng)7 d后，對這些突變體的菌落形態(tài)進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體T1、T3、T4、T7與野生型菌株nm-1菌落形態(tài)相比基本沒有差異，而突變體T9、T11菌絲形態(tài)致密，緊致，沒有產(chǎn)生孢子，與野生型菌株nm-1相比，具有較大差異(圖2)。

2.3 致病力減弱突變體的生長速率

培養(yǎng)7 d后，對致病力減弱的6個致病力減弱突變體的生長速率進行測定(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個致病力減弱突變體T1、T3、T4、T7、T9的生長速率較快，分別為0.68，0.69，0.68，0.60，0.67 cm/d。與野生型菌株nm-1(0.59 cm/d)相比，差異不顯著(P>0.05)，只有突變體T11生長速率為0.32 cm/d，與野生型菌株nm-1相比顯著下降(P<0.05)，下降了23.7%。

2.4 致病力減弱突變體的產(chǎn)孢量

培養(yǎng)14 d后，測定6株致病力減弱突變體的產(chǎn)孢量(圖4)，T1、T3、T4、T7、T9、T11的產(chǎn)孢量分別為0.46×106，0.50×106，1.38×106，1.24×106，0.40×106，0.51×106個/mL，與野生型菌株nm-1的產(chǎn)孢量(3.84×106個/mL)相比，都顯著下降(P<0.05)，分別下降了87.9%，87.0%，64.1%，67.8%，89.6%，86.7%。

2.5 致病力減弱突變體Southern Blot 檢測

利用Southern Blot檢測突變體菌株(圖5)，6個突變體的基因組經(jīng)過限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切，與DIG標記探針雜交，均只有1個雜交信號，說明T-DNA以單拷貝形式插入到各突變體的基因組中。

2.6 致病力減弱突變體側(cè)翼序列分析

利用Hi TAIL-PCR技術(shù)對6株致病力減弱突變體插入位點的右翼序列進行PCR擴增，在第3輪PCR結(jié)束之后，得到了清晰的特異性條帶，大小在200～1 000 bp(圖6)，經(jīng)回收、測序后，在GenBank上Blast比對分析，與Leptosphaeriabiglobosa的基因組scaffold 同源性達95.0%以上，獲得了T-DNA 具體的插入位置(表2)，可以看出，T-DNA的插入位點與scaffold 的長度和位置沒有聯(lián)系，說明T-DNA 在基因組上的插入是隨機的。

表2 T-DNA 插入位點序列分析Tab.2 Sequence analysis of T-DNA insertion site

3 討論與結(jié)論

目前，我國對于油菜黑脛病的防治，主要通過化學藥劑進行防治，還沒有黑脛病抗性品種。因此，篩選L.biglobosa致病基因及進一步研究L.biglobosa的致病機制，有助于認識和防治油菜黑脛病的發(fā)生，并為油菜抗黑脛病育種提供一定的理論基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)尚未見有關(guān)L.biglobosa致病機制的研究報道，而獲得大量的突變體、鑒定突變體的表型特征、進行致病力及插入位點側(cè)翼序列的分析是病原菌致病機理研究的最佳方式。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入目的DNA，是篩選突變體的關(guān)鍵技術(shù)[19]，對插入位點側(cè)翼序列的擴增分析，是致病基因克隆及基因功能研究的基礎(chǔ)[20]。本研究從已建立的L.biglobosa突變體庫中篩選致病力減弱的突變體，并對致病力顯著下降的突變體進行菌落形態(tài)觀察、生長速率和產(chǎn)孢量進行測定，發(fā)現(xiàn)這些突變體的菌落、菌絲形態(tài)、生長速率和分生孢子產(chǎn)孢能力出現(xiàn)變化，說明T-DNA插入在一定程度影響著L.biglobosa的生長發(fā)育，有可能影響了它的營養(yǎng)運輸，這也可能與致病力的減弱有關(guān)，也說明T-DNA 的插入破壞了L.biglobosa致病相關(guān)基因的表達。這些突變體將為研究L.biglobosa致病相關(guān)基因克隆提供候選條件。

另外，本研究應(yīng)用Hi TAIL-PCR技術(shù)，經(jīng)過3輪PCR，克隆了6個致病力減弱的右側(cè)翼序列，6個側(cè)翼序列比對到L.biglobosabrassicae的scaffold基因組，這6條序列與L.biglobosabrassicae菌株基因組同源性均在95.0%以上。因為雖然有L.biglobosabrassicae菌株的全基因組測序序列，但由于基因組未進行注釋，比對結(jié)果只能獲得T-DNA 插入位點。下一步工作將采用RACE-PCR，根據(jù)側(cè)翼基因片段，克隆L.biglobosa致病力減弱側(cè)翼基因全長，然后通過基因敲除突變體對其功能及致病機理作進一步研究。本研究初步明確了T-DNA 插入油菜黑脛病菌L.biglobosa位置。為下一步致病基因的克隆和功能研究奠定了基礎(chǔ)，也為致病機理的研究提供參考。