牦牛AQP8基因克隆及其在各組織和肝臟不同生長階段中的表達(dá)分析

李 娟，王 利，羅曉林，官久強

(1.西南民族大學(xué)，青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部和四川省重點實驗室，四川 成都 610041；2.四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都 611731)

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)參與細(xì)胞水液平衡的調(diào)節(jié)，在跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運過程中起著重要的作用[1]。目前已發(fā)現(xiàn)13個AQP家族成員AQP0～12[2]，其對水都有通透性，由于基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)和組織分布等不同導(dǎo)致家族成員在機體中起著不同的作用[3]。AQP8對水分子具有高度的選擇性[4]，可作為B細(xì)胞活化過程的信號調(diào)節(jié)劑，在幾種類型的B細(xì)胞相關(guān)疾病中表達(dá)[5-6]，還參與了宮頸癌、直腸癌和急性肝損傷等多類疾病的發(fā)生[7-9]。此外，AQP8在肝臟細(xì)胞內(nèi)對水通透，還對過氧化氫、氨也有通透性[10-11]，其存在于運輸囊泡和管狀質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域和線粒體內(nèi)膜中，是膽汁的合成、分泌和調(diào)節(jié)[12-13]以及參與糖原代謝過程中對細(xì)胞滲透壓的保持和對線粒體體積的維持等功能的基礎(chǔ)[14]。目前，關(guān)于AQP8基因表達(dá)僅在人、鼠、水牛等哺乳動物中有報道[15-17]，在高原動物中未見報道。牦牛作為以我國青藏高原為中心的高原特有珍稀牛種之一，對其生態(tài)環(huán)境具有極強適應(yīng)性[18]，對AQP8基因的研究為探討牦牛極端環(huán)境適應(yīng)性具有重要意義。本研究旨在克隆牦牛AQP8，并對不同年齡段肝臟中該基因的差異表達(dá)進(jìn)行分析，為深入研究牦牛AQP8基因功能提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗動物源于四川省阿壩州紅原縣，隨機選取健康胎兒(1 d)、幼年(15月)、成年(5歲)雌性麥洼牦牛各3頭，屠宰后采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉、瘤胃組織樣品，部分液氮保存，部分4%多聚甲醛進(jìn)行固定。

1.2 主要試劑

4%多聚甲醛固定液購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；AQP8兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；組化二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ酶、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、DL2000 Marker和DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購于寶生物工程 (大連)有限公司；1.1×T3 Super PCR購自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

1.3 RNA提取及cDNA合成

用TRIzol法對牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉、瘤胃8種組織進(jìn)行RNA提取，通過1%瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA質(zhì)量及完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牦牛AQP8基因克隆及測序

根據(jù)GenBank上公布的牛AQP8基因序列(登錄號：NM_001206607．3)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計CDS區(qū)擴增引物，引物序列上游：5′-ATGTTTACAGA

GGCAGCTGTATCCA-3′；下游：5′-TCACCGTCCCTTTA

GGATTAGACGA-3′。PCR擴增反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，上下游引物各2 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 44 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測后按膠回收試劑盒說明書對其進(jìn)行膠回收，并按pMDTM19-T克隆載體試劑盒說明書將目的基因與載體16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)40 min進(jìn)行復(fù)蘇，均勻的涂布到含有Amp+的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性菌液送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.5 牦牛AQP8基因生物信息學(xué)分析

用NCBI中的Blast對獲得的核酸序列進(jìn)行比對，并用ORF Finder獲得其氨基酸序列，用在線軟件ExPASy中的ProtParam進(jìn)行蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析；ProtScal進(jìn)行疏水性分析；用在線軟件TMHMM對蛋白進(jìn)行跨膜分析；SignalP對信號肽進(jìn)行分析；用在線軟件SMART對蛋白的結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行分析；用在線軟件SOPMA、SWISS-MODEL對蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；用MEGA 6.0軟件進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 牦牛AQP8基因組織表達(dá)譜及不同生長階段肝臟中的表達(dá)檢測

以β-actin為內(nèi)參基因，采取qRT-PCR方法檢測AQP8基因在成年麥洼牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉和瘤胃共8種組織中的表達(dá)量。并且檢測1 d、15月、5歲麥洼牦牛肝臟中的AQP8基因表達(dá)量。β-actin引物為上游：5′-CTTCGAGCAG

GAGATGGC-3′；下游：5′-CCGTGTTGGCGTAGAGGT-3′。AQP8引物為上游：5′-CAGCGTCAAGGTGAAGGAG-3′；下游：5′-GAAGATGAACAGAGCAGAGCC-3′。反應(yīng)體系：上下游引物均為0.8 μL，cDNA模板1 μL，TB GreenTMPremix Ex TaqTM5.2 μL，滅菌ddH2O 2.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，59.4 ℃退火10 s，共40個循環(huán)。以牦牛β-actin為內(nèi)參基因?qū)M織進(jìn)行定量結(jié)果分析，得到每個樣品的 Ct 值，每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法分析試驗結(jié)果，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，SPSS 24.0 單因素方差分析其顯著性，P<0.05表示差異性顯著，P>0.05差異性不顯著。

1.7 牦牛AQP8蛋白免疫組織化學(xué)檢測

對4%多聚甲醛固定的1 d、15月、5歲牦牛段肝臟組織進(jìn)行包埋、切片和染色，用枸櫞酸緩沖液(pH值6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)，加入阻斷劑后PBS清洗，滴加100 μL或適量的封閉用正常山羊血清工作液孵育后，滴加一抗(1∶100)，4 ℃過夜孵育后滴加二抗，DAB進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察陽性表達(dá)情況，顯微成像系統(tǒng)拍照記錄，每個樣品選擇3個陽性區(qū)域進(jìn)行拍照，用Image Pro Plus 6.0 軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行光密度分析，SPSS 24.0分析其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛AQP8基因的克隆

以牦牛肝臟cDNA為模板，PCR擴增牦牛AQP8基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得單一的目的條帶，如圖1所示。經(jīng)測序獲得一條長為792 bp的序列，ORF為792 bp，編碼263個氨基酸，序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MT062952。

2.2 牦牛AQP8基因生物信息學(xué)分析

將獲得的麥洼牦牛AQP8基因核酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其與野牦牛的核苷酸序列同源性最高為99.6%，其次與水牛、山羊和綿羊的同源性分別為98.6%，98.2%，98.1%。同時構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)其與野牦牛的親緣關(guān)系最近，與小斑熊蟲的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，并且該基因在物種進(jìn)化過程中有較高的保守性(圖2)。

通過對AQP8蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析所知，該蛋白的分子式為C1271H2001N327O340S15，分子質(zhì)量為27.78 ku，理論等電點為6.50，帶負(fù)電殘基數(shù)(Asp+Glu)17，帶正電殘基數(shù)(Arg+Lys)16，脂肪系數(shù)114.64，半衰期30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為34.04，推測該蛋白為酸性穩(wěn)定蛋白。該蛋白中，亮氨酸的含量最高為13.7%，酪氨酸的含量最低為1.5%。功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白是典型的疏水蛋白，有6個跨膜螺旋區(qū)，在33-247有1個高度保守的MIP結(jié)構(gòu)功能域。該蛋白二級結(jié)構(gòu)有α螺旋、β折疊、無規(guī)卷曲，分別占比為41.8%，6.08%，18.87%，34.22%，其三級結(jié)構(gòu)由26-252位氨基酸構(gòu)成。

2.3 牦牛AQP8基因的組織表達(dá)譜

不同組織提取的RNA經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰完整無降解，利用Nanodrop檢測RNA的純度和濃度，其A260/280nm比值均在1.8～2.2，表明RNA質(zhì)量符合試驗要求，可以進(jìn)行后續(xù)試驗。采用qRT-PCR檢測AQP8基因在成年麥洼牦牛8種組織中的表達(dá)量，以心臟為參照，AQP8基因在成年麥洼牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、肌肉和瘤胃共8種組織中均有表達(dá)，其中在肝臟中的表達(dá)最高，且顯著高于心臟、脾臟和腎臟等其他組織(P<0.05)，其他組織之間表達(dá)不顯著(P>0.05)(圖3)。

2.4 AQP8基因在牦牛不同生長階段肝臟中mRNA表達(dá)

對牦牛胎兒時期(1 d)、幼年時期(15月)和成年時期(5歲)肝臟中AQP8的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，幼年時期的牦牛肝臟中AQP8的表達(dá)量最高，顯著高于胎兒時期和成年時期(P<0.05)，其次為成年時期和胎兒時期，AQP8在胎兒時期和成年時期中表達(dá)差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

2.5 AQP8蛋白在牦牛肝臟組織的定位和表達(dá)

對牦牛不同生長階段的肝臟進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在胎兒時期、幼年時期和成年時期牦牛肝臟組織中，均有AQP8蛋白表達(dá)，AQP8蛋白主要表達(dá)于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞上呈黃色或棕黃色(圖5)。對其平均光密度值分析發(fā)現(xiàn)，AQP8蛋白在幼年(15月)牦牛肝臟中的表達(dá)量最高，成年(5歲)次之，胎兒(1 d)時期最低，且幼年(15月)和成年(5歲)時期的表達(dá)顯著高于胎兒時期(P<0.05)，幼年和成年時期的表達(dá)沒有顯著差異(P>0.05)(圖6)。

3 討論與結(jié)論

水通道蛋白位于細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)水液的平衡，水液平衡的失調(diào)會導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[19-20]，其研究有利于目前對疾病的研究和治療。牦牛作為高原最大哺乳動物，對高原低氧環(huán)境具有適應(yīng)性，對AQP8基因的探究有利于進(jìn)一步了解水通道蛋白家族與牦牛低氧適應(yīng)性之間的關(guān)系。目前已有AQP1[21]、AQP4[22-23]、AQP9[24-25]與低氧環(huán)境相關(guān)的報道。為探討AQPs基因在低氧環(huán)境中的功能，本試驗克隆了牦牛AQP8基因，發(fā)現(xiàn)該基因在進(jìn)化過程中相對保守，其與李勝等[17]克隆到的水牛AQP8基因相差60 bp，這可能是由于物種之間的差異導(dǎo)致的。對AQP8蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白具有一個AQPs特有的穩(wěn)定MIP結(jié)構(gòu)域，是形成膜通道的重要結(jié)構(gòu)，與水牛相比少一個MIP結(jié)構(gòu)域，這可能是由于牦牛生活在高原環(huán)境所導(dǎo)致的。牦牛AQP8蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測為進(jìn)一步探討該蛋白在牦牛上的功能作用提供了參考資料。

本試驗采用qRT-PCR方法檢測到AQP8基因在牦牛肝臟中特異性高表達(dá)，說明AQP8主要存在于肝細(xì)胞中。張霖等[9]報道AQP8是在人肝細(xì)胞中大量表達(dá)且起重要作用的水通道蛋白，人AQP8在肝臟中高表達(dá)與其參與肝臟中的代謝活動相關(guān)，且AQP8的表達(dá)異常會導(dǎo)致肝細(xì)胞通透性改變和水液代謝的失衡[4]。肝臟中水液代謝影響著線粒體的能量代謝[26]，AQP8在肝臟線粒體中高表達(dá)，可促進(jìn)氧化磷酸化和細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及線粒體體積調(diào)控[10，27]。肝臟作為牦牛體內(nèi)的一個重要能量代謝器官，維持和穩(wěn)定機體氧化功能[28]，對適應(yīng)高原極端環(huán)境有重要作用。組織定位發(fā)現(xiàn)，AQP8蛋白主要于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，由此推測AQP8在牦牛肝臟中特異性高表達(dá)可能與其在低氧環(huán)境下參與機體的能量代謝相關(guān)。AQP8蛋白與AQP8基因表達(dá)有一定的差異，可能是由于mRNA降解、蛋白折疊與修飾等因素導(dǎo)致的。在生長發(fā)育的胎兒時期、幼年時期和成年時期，肝臟的代謝功能有一定的差異。賴樹云等[29]報道的不同年齡組小鼠肝細(xì)胞線粒體的差異分析表明幼年組的肝細(xì)胞線粒體密度極顯著高于成年組。幼年時期麥洼牦牛肝臟中AQP8的表達(dá)顯著高于胎兒時期和成年時期，不同年齡段的差異表達(dá)可能與肝細(xì)胞線粒體密度相關(guān)。通過免疫組化檢測到牦牛AQP8蛋白定位在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而可以推測牦牛AQP8可能通過調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中的線粒體參與機體的能量代謝。

本試驗成功克隆了牦牛AQP8基因，發(fā)現(xiàn)該基因在牦牛肝臟中高表達(dá)，幼年時期肝臟中AQP8基因表達(dá)顯著高于胎兒時期和成年時期，且AQP8蛋白主要定位在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在幼年牦牛肝臟中的表達(dá)量最高，這表明牦牛AQP8在肝臟能量代謝過程中發(fā)揮著一定作用，為深入探討牦牛AQP8功能以及牦牛低氧適應(yīng)性機制積累了科學(xué)資料。