基于SCoT分子標(biāo)記的甘薯及其野生種遺傳多樣性分析

馮俊彥，康 樂，郎 濤，張 聰，李 明，趙 珊，蒲志剛

(1.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637002；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610061；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

甘薯(IpomoeabatatasL.)是繼小麥、水稻、玉米、馬鈴薯、大麥和木薯之后的世界第七大糧食作物，在世界100多個(gè)國家都被廣泛種植[1]。特別在發(fā)展中國家，甘薯在糧食安全中扮演著重要的角色。近年來，甘薯被廣泛用作動(dòng)物飼料、工業(yè)原料，在許多發(fā)達(dá)國家作為保健食品也越來越受到消費(fèi)者的青睞[2]。

甘薯最早是在美洲馴化后[3-4]，再傳播到世界其他地方的。目前甘薯屬已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近700個(gè)物種，其中大部分來自美洲[3]，甘薯是甘薯屬中唯一被作為農(nóng)作物種植的植物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界累計(jì)保存的甘薯屬種質(zhì)資源約26 000份，其中甘薯種質(zhì)資源材料約8 000份[5-6]。甘薯近緣野生種是甘薯遺傳改良的重要基因資源[7]，越來越受到研究者的關(guān)注，但是目前甘薯與野生種的遺傳關(guān)系仍未明確，因此深入研究甘薯及其相關(guān)野生種的遺傳關(guān)系十分重要。

迄今為止，SSR(Simple sequence repeats)、RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA)和AFLP(Amplified fragment length polymorphism)等分子標(biāo)記在甘薯遺傳多樣性分析、遺傳連鎖構(gòu)建和QTL定位研究等方面得到了廣泛應(yīng)用[8-11]，發(fā)揮了重要作用。但與其他主要作物相比，適合甘薯遺傳研究的分子標(biāo)記非常有限。雖然近年來SLAF-seq(Specific-locus amplified fragment sequencing)、RAD-seq(Restriction-site associated DNA sequencing)、GBS-seq(Genotyping by sequencing)等基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的分子標(biāo)記技術(shù)開始在甘薯研究中應(yīng)用[12-15]，但是相比其他傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)，昂貴的成本限制了其廣泛應(yīng)用。2009年，Collard和Mackill[16]根據(jù)植物基因ATG起始密碼子翻譯起始位點(diǎn)的側(cè)翼保守序列設(shè)計(jì)單引物，用來擴(kuò)增偏向候選功能基因區(qū)顯性多態(tài)性標(biāo)記，建立了啟動(dòng)密碼子靶向(Start codon targeted polymorphism，SCoT)標(biāo)記，該技術(shù)在PCR反應(yīng)中使用單條引物，擴(kuò)增產(chǎn)物為顯性標(biāo)記，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，具有操作簡(jiǎn)單、成本低，且基因關(guān)聯(lián)度高等優(yōu)點(diǎn)，已在許多植物研究中得到應(yīng)用[17]，但目前在甘薯研究應(yīng)用的報(bào)道較少。本研究旨在利用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)甘薯及其野生種進(jìn)行掃描，揭示甘薯及其野生種之間的遺傳多樣性，分析甘薯及其野生種之間的遺傳關(guān)系，為SCoT標(biāo)記技術(shù)在甘薯研究中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究共收集到22份甘薯及其野生種種質(zhì)材料，其中包括8個(gè)甘薯種質(zhì)材料，1份甘薯和三淺裂野牽牛(IpomoeatrifidaL.)雜交后代材料，6份三淺裂野牽牛種質(zhì)材料，7份三裂葉薯(IpomoeatrilobaL.)種質(zhì)材料，全部試驗(yàn)材料均由四川省農(nóng)科院生物技術(shù)核技術(shù)研究所收集保存(表1)。

表1 甘薯及其野生種種質(zhì)材料Tab.1 The materials of sweet potato and its wild germplasm

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 2018年22份參試甘薯及其野生種材料種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所成都試驗(yàn)基地。2018年9月，取各材料幼嫩葉片0.3 g，按照CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取全基因組DNA[17-18]。用含有20 ng/μL RNA酶的1×TE緩沖液溶解DNA，除去DNA中的RNA。抽取2 μL加5 μL溴酚藍(lán)，用1%瓊脂糖檢測(cè)DNA質(zhì)量。使用Scandrop(Analyticgena公司)微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度，根據(jù)測(cè)定DNA濃度，將DNA原液稀釋到50 ng/μL，-20 ℃冷凍待用。

1.2.2 PCR反應(yīng)條件及引物合成 本研究所使用的43條SCoT引物信息均來自于Collard和Mackill發(fā)表文章[16]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR反應(yīng)程序及體系均根據(jù)Collard和Mackill、馮俊彥等的方法略有修改[16-17](表2)。

表2 本研究使用的SCoT引物Tab.2 The information of SCoT primer sused in this study

具體PCR反應(yīng)體系：總體系20 μL，包括100 ng參試植物基因組DNA，1×Buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，0.25 μmol/L引物，0.5 UTaq酶。所需試劑購自北京天根生物技術(shù)公司。

SCoT反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55～58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min，慢慢冷卻至12 ℃[16-17]。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) PCR產(chǎn)物中加入5 μL上樣緩沖液(40%蔗糖，0.025%溴酚藍(lán))，用2.0%(m/V)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。再熒光成像儀上檢測(cè)拍照，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

根據(jù)電泳結(jié)果中條帶的有、無，采用二進(jìn)位制進(jìn)行記錄。在相同遷移率處有帶記為“1”，無帶記為“0”。利用Excle 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，并進(jìn)行數(shù)據(jù)相應(yīng)格式轉(zhuǎn)化。利用Ntsys-pc 2.1軟件(http：//www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html)進(jìn)行遺傳多樣性分析，計(jì)算遺傳距離。使用Jacard方法計(jì)算遺傳距離，用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法UPGMA(Unweighted pair grouping method with arithmetic mean)進(jìn)行聚類分析，使用Neighbor-joining 算法繪制遺傳進(jìn)化樹。利用Ntsys-pc 2.1軟件對(duì)遺傳矩陣和相關(guān)矩陣進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。

利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行基于貝葉斯(Bayesian)數(shù)學(xué)模型的遺傳結(jié)構(gòu)分析[19]。推斷種群結(jié)構(gòu)，先設(shè)置K值從2到7，將不作數(shù)迭代(Length of burn-in period)的MCMC(Markov chain monte carlo)值設(shè)為10 000次，將不作數(shù)迭代后的MCMC值設(shè)為100 000，每個(gè)K值運(yùn)行3次，其余參數(shù)均為默認(rèn)值，計(jì)算各參試材料的Q值(參試材料基于SCoT標(biāo)記變異歸于不同群的概率)。將計(jì)算結(jié)果上傳到在http：//taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest網(wǎng)站，計(jì)算ΔK值，確定最優(yōu)K值[20]。利用CLUMPP(Windows.1.1.2b)軟件和Distruct V1.1軟件繪制遺傳結(jié)構(gòu)圖。

利用Popgene V1.32軟件[21]計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)：等位基因位點(diǎn)數(shù)(Number of putative alleles，Na)、有效等位基因位點(diǎn)(Effective allele number，Ne)、Shannon′s信息指數(shù)(Shannon′s information index，I)；Nei′s基因多樣性指數(shù)(Nei′s gene diversity，H)[22]、多態(tài)性信息含量(Polymorphic information content，PIC)、群體遺傳距離及遺傳一致性等數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT標(biāo)記多態(tài)性分析

擴(kuò)增結(jié)果顯示，43條SCoT標(biāo)記在22份甘薯及其近緣野生材料中總共獲得278條穩(wěn)定條帶，多態(tài)性百分率99.65%。片段大小主要分布在100～3 000 bp，平均每條引物可擴(kuò)增6.78條產(chǎn)物(圖 1)。引物SCoT-26擴(kuò)增產(chǎn)物最多，獲得了12條帶。引物SCoT-24擴(kuò)增產(chǎn)物最少，僅有4條帶。擴(kuò)增多態(tài)性豐富的5條引物分別是：SCoT-8、SCoT-20、SCoT-26、SCoT-36、SCoT-35。

以SCoT標(biāo)記掃描結(jié)果為基礎(chǔ)，使用Popgene V1.32軟件對(duì)甘薯、三淺裂野牽牛和三裂葉薯的遺傳多樣性分析表明，甘薯、三淺裂野牽牛和三裂葉薯平均等位基因數(shù)(Na)分別為1.84，1.92，1.52，均值為1.76。Nei′s有效等位變異數(shù)(Ne)分別為1.54，1.65，1.29，均值為1.50；基因多樣性指數(shù)(H)分別為0.32，0.37和0.18，平均為0.29；Shannon′s多樣性指數(shù)(I)分別為0.47，0.54，0.27，平均為0.43；多樣性信息分別為84.38，92.36，52.43，均值為76.39(表3)。從結(jié)果可以看出，三淺裂野牽牛的遺傳多樣性最高，甘薯次之，三裂葉薯多樣性最小。

表3 基于SCoT標(biāo)記的3個(gè)物種間遺傳多樣性比較Tab.3 Comparison of genetic diversity among three species based on SCoT markers

2.2 參試甘薯及其野生種聚類分析

基于22份參試材料的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用Ntsys-pc 2.1軟件計(jì)算不同材料間的Jaccard遺傳距離，使用Neighbor-joining法進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果(圖 2)表明，在遺傳距離為0.003時(shí)，22份參試材料可分為兩大類，其中第一大類群包含8份甘薯材料和1份甘薯與三淺裂野牽牛雜交的后代材料；另一大類群主要包括6份三裂葉薯材料和7份三淺裂野牽牛材料。在遺傳距離0.008處，兩大類群中的第一大類又被劃分為兩小類群。第一小類群中類包括8份甘薯種質(zhì)材料，分別為西成007、徐薯18、CS、524、日本紫薯、徐薯22、日本苕、南紫薯008。其中來自日本的2份甘薯材料日本紫薯和日本苕被聚到一起，其遺傳關(guān)系較近，可能與其來自國外同一生態(tài)區(qū)有關(guān)。種間雜交后代材料shTFBT2017001被單獨(dú)聚到另一小類群中，可能與其既含有甘薯血緣又含有三淺裂野牽牛血緣有關(guān)。在遺傳距離0.059處，2個(gè)大類中的第二大類又被劃分為3個(gè)小類群，分別包含7，2，4份材料。其中2個(gè)小類群中分別包括7份三裂葉薯材料和4份三淺裂野牽牛材料。7份三裂葉薯材料間遺傳關(guān)系較近，4份三淺裂野牽牛材料間的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。其余2份三淺裂野牽牛種質(zhì)材料被單獨(dú)聚到另一小類群中。參試6份三淺裂野牽牛種質(zhì)材料被聚到2個(gè)小類群中，可能與其不同地理來源有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

為了對(duì)遺傳聚類結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用Ntsys-pc 2.1軟件的協(xié)表(Cophenetic correlation)相關(guān)性檢驗(yàn)功能，對(duì)遺傳距離矩陣和相關(guān)矩陣進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖3)，2個(gè)矩陣的相關(guān)系數(shù)為r=0.915 06，說明遺傳聚類結(jié)果較好。

2.3 參試甘薯及其野生種遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于SCoT分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用Structure v2.3.4軟件對(duì)22份甘薯及其近緣屬材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，計(jì)算每份材料的Q值。設(shè)置K值從2到7，分析結(jié)果表明，LnP(D)值隨著K值先增大后逐漸減小，當(dāng)K=3時(shí)，LnP(D)最大為-6 323.9，隨后急劇減小，出現(xiàn)拐點(diǎn)，后期變化趨小，初步確定最佳K值(圖4-A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果的正確性，參照Evanno等[23]的方法，通過計(jì)算ΔK值來確定最佳K值。通過對(duì)ΔK值變化的分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=3時(shí)，ΔK值最大，當(dāng)K=4時(shí)，ΔK值急劇減小，隨后變化逐漸變小，故以K=3作為所有參試材料的最佳分群數(shù)(圖 4-B)。分析LnP(D)值和ΔK值的變化趨勢(shì)，獲得的最佳K值一致，因此，初步確定參試22份材料被劃分到3個(gè)亞群，不同顏色表示不同的類群，分別用S1(綠色)、S2(藍(lán)色)和S3(紅色)表示(圖 5)。S1(綠色)亞群包括7份，分別為shTL2015001～shTL2015007，該亞群材料均屬于三裂葉薯，占參試材料的31.82%。S2(藍(lán)色)亞群包括6份，分別為shTF2015001～shTF2015006，該亞群材料均屬于三淺裂野牽牛，占參試材料的27.27%。S3(紅色)亞群包括9份，分別為西成007、徐薯18、CS、524、日本紫薯、徐薯22、日本苕、南紫薯008、shTFBT2017001，該亞群材料除shTFBT2017001為甘薯和三淺裂野牽牛雜交后代，其余材料均屬于甘薯，占參試材料的40.91%。

以0.6作為區(qū)分亞群和混合群的閾值[24]，分析每份參試材料的Q值分布，當(dāng)Q≥0.6作為遺傳背景單一，Q<0.6視為具有混合來源，遺傳背景復(fù)雜。分析結(jié)果表明，22份材料中，21份參試材料(占95.45%)的Q值大于0.6。其中16份材料的Q值大于0.8，占供試材料總數(shù)的72.73%，說明參試材料間可能由于物種差異，相互之間血緣交流少，遺傳組成比較單一。僅有1份材料(占4.55%)的Q值小于0.6，可能與其遺傳組成中含有甘薯和三淺裂野牽牛血緣有關(guān)(圖 5)。

2.4 參試甘薯及其野生種遺傳關(guān)系分析

利用Popgene V1.32軟件對(duì)參試的22份甘薯及其野生種材料所屬的4種類型進(jìn)行遺傳分析，其中三裂葉薯類型中包括7份材料，三淺裂野牽牛類型中包括6份材料，甘薯類型中包括8份材料，剩余類型僅包括1份甘薯和三淺裂野牽牛雜交材料shTFBT2017001，分析結(jié)果顯示，shTFBT2017001與三裂葉薯、三淺裂野牽牛、甘薯之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，其中與三裂葉薯之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，達(dá)到0.506 7?？赡芘c其僅有一份材料，而且其遺傳組成含有三淺裂野牽牛、甘薯血緣，不含有三裂葉薯血緣有關(guān)。三裂葉薯和三淺裂野牽牛之間的遺傳距離最近，可能與其野生種倍型有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究。甘薯與三淺裂野牽牛之間的遺傳距離比其與三裂葉薯之間的遺傳距離更近，這一結(jié)果與現(xiàn)有研究結(jié)果基本一致(表 4)。在遺傳一致性方面，本研究中4種不同類型材料間的遺傳一致性較低，可能與其來源于不同物種有關(guān)。其中，三裂葉薯和三淺裂野牽牛之間的遺傳一致性最高，達(dá)到0.838 8。shTFBT2017001與甘薯和三淺裂野牽牛的遺傳一致性均高于其與三裂葉薯的遺傳一致性(表 4)。甘薯與三淺裂野牽牛的遺傳一致性高于其與三裂葉薯間的遺傳一致性。

表4 基于SCoT分子標(biāo)記的不同類型甘薯及其野生種間遺傳一致性及遺傳距離分析Tab.4 Genetic identity and genetic distance of four sweet potato and it′s wild species based on SCoT molecular markers

3 討論

3.1 分子標(biāo)記在甘薯遺傳研究中的應(yīng)用

甘薯是六倍體(2n=6 x=90)作物，染色體多，基因組大，在基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建等研究上比其他作物困難。一直以來，甘薯遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記研究主要使用AFLP(Amplified fragment length polymorphism)[10，25]、SSR(Simple sequence repeats)[26-27]、RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA)[28]等分子標(biāo)記技術(shù)。在甘薯重要農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記研究方面，利用這些分子標(biāo)記技術(shù)目前已定位了多個(gè)與抗病[10]、品質(zhì)[25-27]等相關(guān)的遺傳位點(diǎn)。雖然這些分子標(biāo)記技術(shù)在甘薯遺傳圖譜構(gòu)建和農(nóng)藝性狀標(biāo)記方面發(fā)揮了重要作用，但是其各自的不足也顯而易見。隨著甘薯分子標(biāo)記研究的不斷深入，發(fā)掘成本低、多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)便的分子標(biāo)記，對(duì)甘薯遺傳育種研究具有重要作用。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(Start codon targeted polymorphism，SCoT)標(biāo)記是單引物、顯性分子標(biāo)記，擴(kuò)增區(qū)域集中候選基因功能區(qū)[16]，該標(biāo)記技術(shù)操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。而且它在不同物種間通用，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，大大節(jié)約了試驗(yàn)成本。目前，該標(biāo)記技術(shù)已在生物多樣性分析、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建等方面得到了廣泛應(yīng)用。

本研究利用43條SCoT引物對(duì)22份甘薯及其野生種進(jìn)行掃描，結(jié)果證明該標(biāo)記在參試材料中擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性豐富，能夠較好的發(fā)掘甘薯及其野生種基因組遺傳多態(tài)性信息。通過對(duì)22份甘薯及野生種進(jìn)行分子標(biāo)記數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，全部參試材料平均等位基因1.76個(gè)，平均基因多樣性指數(shù)0.29，平均Shannon′s指數(shù)為0.43，平均多樣性信息含量(PIC)為76.39。通過比較參試3個(gè)物種間遺傳多樣性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，三淺裂野牽牛的多樣性指標(biāo)均最高，甘薯次之，三裂葉薯最小，原因可能是三淺裂野牽牛在自然條件下既可以自交也可以異交，遺傳背景比較廣，而甘薯雖然可以異交，但因長期使用少數(shù)親本材料，遺傳背景變窄。三裂葉薯在自然環(huán)境下主要以自交為主，其遺傳多樣性更低。目前，遺傳多樣性降低，遺傳背景變窄已經(jīng)成為甘薯育種中面臨的主要問題，在今后甘薯育種中，開展遠(yuǎn)緣雜交，引入三淺裂野牽牛等野生種血緣，對(duì)提高甘薯遺傳多樣性無疑具有重要作用。

3.2 甘薯及其野生種遺傳關(guān)系分析

早期形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)方面的研究支持三淺裂野牽牛是甘薯的直接祖先之一[29-31]。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳研究方面的優(yōu)勢(shì)逐漸顯現(xiàn)[32-34]，該技術(shù)在甘薯及其野生種中遺傳多樣性研究中的應(yīng)用也進(jìn)一步證實(shí)了甘薯和三淺裂野牽牛之間的密切關(guān)系[35-37]。但是三裂葉薯是否是甘薯起源種，目前仍有爭(zhēng)議[3，29]。本研究中的22份甘薯及野生種種質(zhì)材料分別屬于甘薯、三淺裂野牽牛和三裂葉薯，通過對(duì)全部材料的NJ聚類及遺傳結(jié)構(gòu)分析，可以將22份種質(zhì)材料分為三大類群，分類結(jié)果與各材料所屬物種基本一致，而且在分類結(jié)果顯示甘薯和三淺裂野牽牛的雜交后代材料聚類位置處于甘薯類群和三淺裂野牽牛類群之間，初步說明SCoT分子標(biāo)記可以區(qū)分甘薯及其野生種，證明了該標(biāo)記在甘薯進(jìn)化研究中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)不同甘薯及其野生種群體的遺傳距離和遺傳一致性分析結(jié)果支持甘薯和三淺裂野牽牛之間的遺傳關(guān)系比其與三裂葉薯更近。此外遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果也顯示，在血緣交流方面，甘薯與三淺裂野牽牛的血緣交流較多，而其與三裂葉薯之間的血緣交流極少，也進(jìn)一步說明甘薯與三淺裂野牽牛遺傳關(guān)系較三裂葉薯更近，這一研究結(jié)果與前人研究結(jié)果[38-40]基本一致。但是由于本研究使用材料數(shù)較少，而且SCoT分子標(biāo)記也主要揭示的是基因功能區(qū)的遺傳多樣性，因此，要完全弄清甘薯及野生種的遺傳演化關(guān)系，還需應(yīng)用測(cè)序等技術(shù)在全基因水平上開展深入研究。