印片細(xì)胞DNA定量分析聯(lián)合冰凍切片在術(shù)中快速診斷中的應(yīng)用

徐 姍，黃 燕，盛以蕓，淦柳根，梅金紅

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,南昌 330006；2.撫州市臨川區(qū)人民醫(yī)院病理科,江西 撫州 344000)

術(shù)中快速病理診斷是臨床病理工作的難點(diǎn)之一。病理醫(yī)師需快速確定病變的性質(zhì)，從而指導(dǎo)手術(shù)方案的制定。冰凍切片是目前運(yùn)用最廣泛的術(shù)中快速病理診斷方法，受病理醫(yī)師技術(shù)水平、診斷經(jīng)驗(yàn)等因素的限制，許多醫(yī)院尤其是基層醫(yī)院仍無法開展術(shù)中冰凍切片或開展不順利；細(xì)胞印片操作簡單，但只能觀察細(xì)胞形態(tài)，局限性大。DNA定量分析是一種通過定量檢測細(xì)胞核內(nèi)DNA含量的變化來判斷細(xì)胞的生理狀態(tài)或病理改變的技術(shù)，其受細(xì)胞形態(tài)、玻片背景(如血液、炎癥等)、病理醫(yī)師技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)等因素影響較小，檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性高。本研究應(yīng)用印片細(xì)胞DNA定量分析聯(lián)合冰凍切片對術(shù)中標(biāo)本的病變性質(zhì)進(jìn)行判斷，探討二者聯(lián)合檢測在術(shù)中快速診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2013年3月至2015年3月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院術(shù)中送檢標(biāo)本237例，患者年齡19～92歲，平均47歲；其中頭頸部病變90例(包括甲狀腺結(jié)節(jié)56例、口腔及涎腺病變34例)、乳腺包塊61例、子宮及附件病變59例、肺部結(jié)節(jié)5例、腦部病變6例、腎及膀胱病變3例、胃腸及膽囊病變13例。術(shù)中均做印片細(xì)胞DNA定量分析及冰凍切片，以常規(guī)石蠟切片病理診斷結(jié)果為對照標(biāo)準(zhǔn)。本研究已通過南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 印片細(xì)胞DNA定量分析

新鮮標(biāo)本充分暴露，選取不同的病變部位，用濾紙或無菌紗布吸干表面的組織液，用干凈的玻片稍用力壓；對質(zhì)地堅(jiān)韌的間葉源性腫瘤，用刀在切面上刮數(shù)次或切取微小組織，將組織顆粒涂于玻片上。印片范圍近玻片的2/3。采用經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)改良后的Feulgen染色法，細(xì)胞印片微熱風(fēng)干，迅速放入5 N鹽酸中，50 ℃孵育箱酸解5 min，水洗數(shù)秒后加入Feulgen液顯色，50 ℃孵育箱染色7 min，水洗數(shù)秒，梯度酒精快速脫水，風(fēng)干，封片。Feulgen染色后用全自動DNA倍體細(xì)胞定量分析檢測儀(麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司)對全片進(jìn)行掃描，經(jīng)專門的分析和診斷軟件處理，對印片不少于200個(gè)細(xì)胞核內(nèi)的DNA含量進(jìn)行定量檢測，打印DNA倍體分析直方圖和細(xì)胞點(diǎn)陣分布圖完成檢測報(bào)告。當(dāng)DNA指數(shù)(DI)>2.5時(shí)，必須在顯微鏡下逐一進(jìn)行核對，以排除系統(tǒng)將雜質(zhì)或重疊的細(xì)胞核誤認(rèn)為腫瘤細(xì)胞或異常細(xì)胞。陽性標(biāo)準(zhǔn)：1)可見DNA倍體異常細(xì)胞(DI≥2.5)；2)出現(xiàn)異倍體峰。

1.2.2 冰凍切片制作及病理診斷

冰凍切片HE染色，由兩位病理醫(yī)師(至少一位為副主任醫(yī)師)進(jìn)行術(shù)中快速診斷。

1.2.3 常規(guī)石蠟切片制作及病理診斷

標(biāo)本經(jīng)充分取材、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后由兩位主治以上職稱的病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行病理診斷，必要時(shí)行免疫組織化學(xué)、特殊染色及分子檢測輔助診斷。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以常規(guī)石蠟切片病理診斷為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算敏感度、特異度及誤診度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同診斷方法敏感度和特異度的比較

237例標(biāo)本中經(jīng)常規(guī)石蠟切片診斷確診為惡性腫瘤者69例，良性病變168例。69例惡性腫瘤中冰凍切片診斷敏感度和特異度分別為95.65%、89.29%；印片細(xì)胞DNA定量分析敏感度和特異度分別為73.91%、92.86%。1例乳腺癌患者印片DNA定量分析發(fā)現(xiàn)538個(gè)異倍體細(xì)胞、冰凍切片及常規(guī)石蠟切片均見大量腫瘤細(xì)胞核大、不規(guī)則，染色質(zhì)粗，呈浸潤性生長。見封三圖1。去除冰凍切片診斷中12例可疑惡性病例，54例惡性標(biāo)本進(jìn)行聯(lián)合檢測分析，敏感度和特異度分別為73.91%、76.79%。DNA定量分析及冰凍切片的敏感度與聯(lián)合檢測比較，其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；聯(lián)合檢測與DNA定量分析診斷的特異度比較，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.69，P>0.05)，但與冰凍切片診斷的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=59.784，P<0.001)。見表1。

A：印片細(xì)胞DNA定量分析見538個(gè)異倍體細(xì)胞；B：冰凍切片病理診斷為浸潤性癌(HE，×200)；C:石蠟切片病理診斷為浸潤性癌，非特殊類型(HE，×200)。

表1 不同診斷方法敏感度、特異度和誤診度的比較 例

2.2 不同診斷方法誤診度的比較

168例良性病變中，印片細(xì)胞DNA定量分析、冰凍切片及聯(lián)合檢測的誤診度分別為7.14%、10.71%、1.79%。聯(lián)合檢測的誤診度明顯低于冰凍切片診斷和DNA定量分析(χ2=10.10，P<0.01；χ2=5.17，P<0.05)。見表1。

2.3 不同診斷方法在頭頸部病變診斷中的比較

90例口腔及甲狀腺病變中，惡性腫瘤30例，良性病變60例。惡性腫瘤中，印片細(xì)胞DNA定量分析的敏感度、特異度及誤診度分別為40.0%、85.0%、15.0%；冰凍切片的敏感度、特異度及誤診度分別為90.0%、85.0%、15.0%。惡性腫瘤中未檢出異倍體細(xì)胞18例，包括12例甲狀腺乳頭狀癌、2例甲狀腺結(jié)外邊緣區(qū)黏膜相關(guān)淋巴組織B細(xì)胞淋巴瘤、3例舌的高分化鱗狀細(xì)胞癌、1例腮腺的肌上皮癌；良性病變檢出異倍體細(xì)胞9例，包括2例腮腺多形性腺瘤、1例腮腺淋巴上皮病變、6例橋本甲狀腺炎。聯(lián)合檢測的敏感度與冰凍切片相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.05，P>0.05)；聯(lián)合檢測的敏感度比DNA定量分析高(χ2=8.58，P<0.01)。3種診斷方式的特異度和誤診度相同。見表2。

表2 不同診斷方法在頭頸部病變中的比較 例

3 討論

為幫助基層醫(yī)院基于術(shù)中快速病理診斷開展更多手術(shù)，近年江西省衛(wèi)生和計(jì)劃委員會在部分基層醫(yī)院投放了冰凍切片機(jī)，但預(yù)期效果不佳。冰凍切片診斷結(jié)果雖是手術(shù)方案制定的重要依據(jù)，但其診斷基于形態(tài)學(xué)檢查，對病理醫(yī)生和技師的資質(zhì)、經(jīng)驗(yàn)、能力等均有較高的要求。因此，尋找新的技術(shù)輔助冰凍切片診斷將有助于基層醫(yī)院更好地開展術(shù)中快速病理診斷。

腫瘤病理學(xué)研究[1-2]表明，當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)DNA的結(jié)構(gòu)和含量均發(fā)生異常改變，表現(xiàn)為DNA含量增多、DNA倍體異常，故腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA的含量可作為判斷惡性腫瘤的指標(biāo)之一。DNA定量分析法已廣泛應(yīng)用于宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查，亦有部分應(yīng)用于胸腹水惡性細(xì)胞及尿液脫落細(xì)胞的診斷[3-7]。另有報(bào)道[8-9]顯示DNA定量分析法可應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌的診斷及肺腺癌胸腔積液中EGFR基因突變的判斷。但是，DNA定量分析法應(yīng)用于術(shù)中快速病理診斷的報(bào)道較少，其原因是傳統(tǒng)的DNA定量分析法時(shí)間較長(染色200 min、DNA掃描8 min)，無法達(dá)到術(shù)中快速診斷的要求?；诖?，本研究對傳統(tǒng)染色方法進(jìn)行改良，使染色時(shí)間縮短至12 min，而且改良前后的染色效果無明顯差異，對DNA定量分析結(jié)果亦無影響。類似的染色改良法也被應(yīng)用于宮頸脫落細(xì)胞的研究中[10]。

本研究以常規(guī)石蠟切片診斷結(jié)果為對照標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測的誤診度比DNA定量分析及冰凍切片均低，這提示聯(lián)合檢測可以提高術(shù)中快速診斷的準(zhǔn)確性。特別在冰凍切片制片不佳或疑難病例診斷時(shí)，DNA定量分析可輔助冰凍切片診斷。

本研究顯示，未檢出異倍體細(xì)胞的誤診病例均為頭頸部惡性腫瘤，且以甲狀腺乳頭狀癌的誤診病例最多，其原因可能是：1)腫瘤的惡性程度低；2)腫瘤的增殖指數(shù)Ki67表達(dá)低，DNA增殖不如其他惡性腫瘤活躍；3)腫瘤部分為微小癌，印片取材較困難，致使異倍體細(xì)胞不容易檢出。但有學(xué)者[11]檢測1284例甲狀腺冰凍標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)DNA定量分析的準(zhǔn)確性達(dá)95.3%，這與本研究結(jié)果不一致。本研究中，良性病變檢出異倍體細(xì)胞的誤診病例12例，其中頭頸部病變9例，大部分與淋巴細(xì)胞增生相關(guān)；另外，乳腺普通型導(dǎo)管上皮增生2例，外陰乳頭狀瘤伴HPV16/18感染1例；DNA定量分析均檢出DI值2.0～2.5的異倍體細(xì)胞，推測這可能與細(xì)胞增殖較快或病毒感染導(dǎo)致四倍體細(xì)胞增多有關(guān)。因此，本研究提示，在頭頸部病變中冰凍切片診斷具有更高的敏感度和更低的誤診度；DNA定量分析在頭頸部病變診斷中的作用需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究顯示，在頭頸部病變中無論冰凍切片還是DNA定量分析，其診斷結(jié)果與常規(guī)石蠟切片無顯著差異，提示聯(lián)合檢測在頭頸部病變診斷中作用有限。

綜上，DNA定量分析聯(lián)合冰凍切片可提高術(shù)中快速診斷的準(zhǔn)確性，在臨床特別是基層醫(yī)院具有一定的應(yīng)用價(jià)值，但對于頭頸部病變診斷作用有限。