長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA/miR-124參與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控研究

張輝

研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（LncRNA）能通過(guò)募集多梳蛋白復(fù)合物并使其定位到HOXD 基因位點(diǎn)，從而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展[1]。HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）是一種反式LncRNA，在乳腺癌組織中處于高表達(dá)狀態(tài)，且與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。microRNA 是一類(lèi)較短的非編碼RNA分子，在直腸癌組織中，miR-124 可通過(guò)抑制信號(hào)傳導(dǎo)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。研究表明，miR-124 在乳腺癌組織中表達(dá)水平較低，可能與患者病情進(jìn)展有關(guān)[3]。本研究擬觀察LncRNA HOTAIR/miR-124 參與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控情況，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018 年2 月至2020 年3 月浙江省溫州市中醫(yī)院收治的行乳腺癌切除術(shù)患者87 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往無(wú)放、化療史，無(wú)免疫及內(nèi)分泌治療史；（2）臨床資料完整；（3）患者及家屬對(duì)本次研究知情，并自愿簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤或血液系統(tǒng)疾病者；（2）孕產(chǎn)婦；（3）HIV 陽(yáng)性者；（4）精神疾病患者。收集患者腫瘤組織及癌旁組織，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌。其中年齡33 ～73 歲，平均（52.3±12.7）歲；TNM 分期[4]為Ⅰ期36 例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期14 例，Ⅳ期9 例。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株與主要試劑 人正常乳腺上皮細(xì)胞 MCF-10A、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231 及T-470（上海鈺博生物科技有限公司）；Trizol 試劑（Thermo Fisher）；山羊抗小鼠IgG（qRTPCR）試劑盒（美國(guó)Ambion 公司）；miR-124 逆轉(zhuǎn)錄引物（上海海方生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒CCK8（吉滿生物科技有限公司）；E-cadherin、Vmentin、Snail、Slug、Zebl、SP1、GAPDH-抗（美國(guó)Abcam公司）；Invasion和Migration試劑盒（美國(guó)Cell Biolabs）。

1.2.2 RT-qPCR測(cè)定 乳腺癌組織及癌旁組織按照試劑說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA 并溶于20 l DEPC 水中，－80℃冷藏備用。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-qPCR 法測(cè)定HOTAIR和miR-124表達(dá)情況。HOTAIR表達(dá)水平測(cè)定：選擇組織和血清中穩(wěn)定表達(dá)的-actin 作為內(nèi)參，HOTAIR 引物及-actin 由Primer5 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST 比對(duì)后進(jìn)行合成。引物序列：actin 上游5’-TCCTCTCCCAAGTCCACACA-3’，下游5’- GCACGAAGGCTCATCATTCA- 3’；HOTAIR 上游5’-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3’，下 游 5’-ACAT-AAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3’。采用2－△△Ct法計(jì)算各組mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移能力的測(cè)定 MDA-MB-231、T-47D 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-124模擬物。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞采用CCK8 試劑盒于24、48、72 及96h，在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。使用Invasion和Migration試劑盒測(cè)定轉(zhuǎn)染后穿透膜的細(xì)胞數(shù)目。將MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行處理，分為穩(wěn)定高表達(dá)HOTAIR 的MCF-7 細(xì)胞株（HOTAIR組）、感染對(duì)照空病毒的MCF-7 細(xì)胞株（感染組）和未處理MCF-7 細(xì)胞株（空白組）。Transwell 小室培養(yǎng)，棄上清，加入多聚甲醛固定細(xì)胞，以0.01%結(jié)晶紫進(jìn)行細(xì)胞染色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算平均值。

1.2.4 pMIR-SP1 的3’UTR熒光報(bào)告載體構(gòu)建及熒光素酶活性檢測(cè) 構(gòu)建pMIR-SP1 的3’UTR 載體。轉(zhuǎn)染后分為4 組：miR-NC 和pMIR-SP1 的3’UTR組，miR-124 模擬物和pMIRSP1 的3’UTR 轉(zhuǎn)染組，miR-NC 和突變型pMIRSP1 的3’UTR 組，miR-124 和突變型pMIR-SP1 的3’UTR組。再與質(zhì)粒pRLTK共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，24 h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)處理裂解細(xì)胞，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Western blot 法 裂解轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231、T-47D細(xì)胞，以12000r/min離心10min，收集上清。miR-124：分別采用SP1 的一抗，GAPDH 的一抗孵育過(guò)夜后，加入山羊抗小鼠IgGHRP標(biāo)記抗體孵育45min。HOTAIR：分別孵育E-cadherin、Vmentin、Snail、Slug、Zebl和GAPDH一抗及二抗。PBS 洗滌后，ECL 顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)；采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行圖像繪制。＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR 在乳腺癌組織中的表達(dá)各期乳腺癌組織中HOTAIR 表達(dá)均高于癌旁組織（均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 HOTAIR 在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 MCF-7 細(xì)胞系侵襲比較 HOTAIR 組穿膜細(xì)胞數(shù)（123±8）個(gè)/視野，顯著高于感染組（33±9）個(gè)/視野，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=69.71＜0.05）；空白組穿膜細(xì)胞數(shù)（32±6）個(gè)/視野，與感染組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.86＞0.05）。

2.3 MCF-7 細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況 HOTAIR 組E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著下降，Vimentin 蛋白和Slug 表達(dá)顯著增加，Snail和Zebl表達(dá)水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖1。

2.4 miR-124 在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平 miR-124 在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（2.1±0.18）、MDA-MB-231（1.0±0.08）及T-470（1.1±0.1）中的表達(dá)水平顯著低于人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A（3.2±0.25），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（≥6.51，均＜0.05）。

2.5 miR-124 過(guò)表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞系的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移 與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染 miR-124 模擬物在 MDAMB-231 和T-47D 中的表達(dá)水平顯著提高（封三彩圖3a、b）。與轉(zhuǎn)染miR-NC 比較，轉(zhuǎn)染miR-124模擬物能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖（封三彩圖3c、d）、侵襲（封三彩圖3e）及遷移能力（封三彩圖3f）。

圖3 a：MDA-MB-231 中表達(dá)水平；b：在T-47D 中表達(dá)水平；c：對(duì)MDA-MB-231 增殖抑制作用；d：對(duì)T-47D 增殖抑制作用；e：乳腺癌細(xì)胞侵襲能力；f：乳腺癌細(xì)胞遷移能力

2.6 miR-124 靶基因SPI鑒定及過(guò)表達(dá)后對(duì)SP1 表達(dá)的抑制 與轉(zhuǎn)染miR-NC和pMIRSP1 的3’UTR 比較，轉(zhuǎn)染miR-124 模擬物和pMIRSP1 的3’UTR的熒光強(qiáng)度顯著降低；與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-124 模擬物后SP1mRNA和SP1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低。

3 討論

HOTAIR 是LncRNA 的重要成員之一，其可通過(guò)與相關(guān)復(fù)合體結(jié)合并使染色體封閉，造成基因沉默[4]。葉柳青等[5]研究表明，在乳腺癌轉(zhuǎn)移性表征中，HOTAIR呈高表達(dá)狀態(tài)，是其他表征的數(shù)百至數(shù)千倍，且高于其在乳腺癌原發(fā)灶的表達(dá)水平。此外，HOTAIR 還可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的放療抵抗，增加疾病的治療難度[6]。Vimentin 蛋白是間質(zhì)性腫瘤和上皮源性腫瘤的鑒別標(biāo)志；Slug、Snail和Zebl是細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)的轉(zhuǎn)錄因子。本研究中，HOTAIR 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平較高，且HOTAIR 組乳腺癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量較多。說(shuō)明HOTAIR 參與了乳腺癌的發(fā)展，并且可以提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。HOTAIR 組E-cadherin蛋白表達(dá)下降，Vimentin 蛋白和Slug 表達(dá)增加。說(shuō)明HOTAIR 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Slug 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行侵襲和轉(zhuǎn)移。

Slug 基因是miR-124 基因靶點(diǎn)之一，并與miR-124 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miR-124在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平低于人正常乳腺上皮細(xì)胞。說(shuō)明乳腺癌的發(fā)展可能與miR-124低表達(dá)有關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-124 模擬物在MDA-MB-231 和T-47D中的表達(dá)水平提高，且轉(zhuǎn)染miR-124 模擬物能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。說(shuō)明miR-124 過(guò)表達(dá)后可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本次研究通過(guò)構(gòu)建pMIR-SP1 的3’UTR 熒光報(bào)告載體，檢測(cè)鑒定miR-124 靶基因SP1，轉(zhuǎn)染miR-124 模擬物后顯示SP1 mRNA 和SP1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低。說(shuō)明miR-124過(guò)表達(dá)可抑制SP1，而miR-124 低表達(dá)可能是乳腺癌發(fā)展重要原因。

圖1 高表達(dá)HOTAIR 可促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化

綜上所述，HOTAIR 在乳腺癌組織中過(guò)表達(dá)，可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移；miR-124在乳腺癌組織中過(guò)表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SP1 抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。