白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫調(diào)節(jié)作用的影響

張林超

(河南省中醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450002）

白花蛇舌草Hedyotis diffusaWilld 屬茜草科耳草屬植物,別名尖刀草、白花十字草、二葉葎等,始載于《廣西中藥志》,具有利尿除濕、消痛散結(jié)及清熱解毒之功效。現(xiàn)代藥學研究［1］發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗感染及免疫調(diào)節(jié)等作用,其活性成分包括黃酮類、蒽醌類、揮發(fā)油類、烷烴類、甾體類、萜類及多糖類。白花蛇舌草多糖為白花蛇舌草的活性成分之一,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等多種生物活性［2］。白花蛇舌草多糖對肝癌、宮頸癌、非小細胞肺癌及胃癌等的增殖均有抑制作用,對腎癌的研究報道較少［3-5］。同時,鑒于白花蛇舌草多糖具有較好的增強免疫能力［6］,而腎癌又被公認為免疫原性腫瘤,對免疫治療較敏感［7］。因此,本研究通過皮下接種Renca 細胞建立腎癌荷瘤小鼠模型,主要探討白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長及免疫調(diào)節(jié)作用的影響,為其進一步的臨床應用奠定基礎。

1 材料

1.1 動物與細胞株 昆明種小鼠,雄性,SPF 級,體質(zhì)量(20±2) g,購于斯貝福實驗動物公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK (京) 2016-0002。小鼠腎癌Renca 細胞,購于中科院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑 白花蛇舌草多糖(純度＞80%),批號20180216,西安天瑞生物技術有限公司；黃芪多糖(純度＞85%),批號20181125,陜西昂盛生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)液及胎牛血清,美國Hyclone 公司；刀豆蛋白A (ConA) 及噻唑藍(MTT) 檢測試劑盒,美國Sigma 公司；CD4、CD8 抗體,上海瑞齊生物技術有限公司；干擾素-γ (IFN-γ) 和白細胞介素-2 (IL-2) 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測試劑盒,上海迪奧生物技術公司。

1.3 儀器 MCO-20AIC 型CO2培養(yǎng)箱,日本三洋公司；Fh1004N 電子天平,上海民橋精密儀器公司；TDZ6B-WS離心機,上海盧湘儀器公司；RT-6000 酶標儀,深圳雷杜生物科學公司；FV1000 顯微鏡,日本Olympus 公司；Facscalibur 流式細胞儀,美國BD 公司。

2 方法

2.1 腎癌荷瘤小鼠模型建立 小鼠腎癌Renca 細胞用RPMI1640 (10%胎牛血清+100 U/mL 青霉素+100 U/mL 鏈霉素) 培養(yǎng)液,于5% CO2、37 ℃條件下在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期時,收獲細胞,加適量磷酸鹽緩沖液(PBS) 調(diào)整細胞濃度為1×107/mL。于小鼠右后肢外側(cè)皮下處接種250 μL,每日觀察小鼠腫瘤生長情況,7 d 后注射處見約5 mm 的腫瘤結(jié)節(jié)視為腎癌荷瘤小鼠模型建立成功。

2.2 分組及給藥 將荷瘤小鼠隨機分為荷瘤模型組、黃芪多糖組及白花蛇舌草多糖高、低劑量組,每組12 只；另隨機選取未造模小鼠12 只作為正常組。正常組及荷瘤模型組小鼠灌胃等體積的蒸餾水,黃芪多糖組及白花蛇舌草多糖高、低劑量組分別灌胃100 mg/kg 黃芪多糖和200、100 mg/kg白花蛇舌草多糖,1 次/d,持續(xù)給藥14 d。

2.3 瘤質(zhì)量、抑瘤率及免疫器官指數(shù)測定 末次給藥結(jié)束后24 h,頸椎脫臼法處死小鼠,剝離瘤體后,分別稱瘤質(zhì)量及體質(zhì)量,經(jīng)75%乙醇消毒后,取免疫器官(脾臟及胸腺),稱重。抑瘤率=［(荷瘤模型組平均瘤質(zhì)量-藥物處理組平均瘤質(zhì)量)/荷瘤模型組平均瘤質(zhì)量］×100%,免疫器官指數(shù)=免疫器官(脾臟或胸腺) 質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.4 淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL 殺傷活性測定 將無菌分離的小鼠脾臟置于200 目尼龍網(wǎng)上,輕輕碾壓擠碎,制備單個脾細胞懸液,加入Tris-NH4Cl 溶液(0.01%) 使紅細胞溶解,PBS 漂洗后,調(diào)整細胞濃度為5×106/mL。取100 μL脾細胞懸液置于96 孔細胞培養(yǎng)板中,加入終濃度5 μg/mL的ConA,常規(guī)條件培養(yǎng)72 h 后,采用MTT 法測570 nm 處光密度(OD)。小鼠脾細胞懸液(5×106/mL) 為效應細胞,取對數(shù)生長期小鼠腎癌Renca 細胞(1×105/mL) 為靶細胞,等比例混合后常規(guī)條件培養(yǎng)24 h,采用MTT 法測490 nm 處OD,計算CTL 殺傷活性。CTL 殺傷活性=［1-(OD實驗孔-OD效應細胞對照孔)/OD靶細胞對照孔］ ×100%

2.5 外周血T 淋巴CD4+和CD8+細胞亞群測定 小鼠在處死前摘眼球取血,取100 μL 放于EP 管中,分別加入抗CD4+及CD48+抗體各10 μL,冰水浴上避光放置30 min。加入100 μL 紅細胞裂解液,完全混勻,繼續(xù)避光放置10 min裂解紅細胞,離心(1 000 r/min) 5 min,棄掉上清液,沉淀用500 μL PBS 溶液重懸后,于流式細胞儀中檢測。

2.6 血清IFN-γ 和IL-2 水平測定 剩余小鼠眼球血加肝素鈉抗凝后,離心(3 000 r/min) 5 min,分裝上層血清于-20 ℃冰箱中備用。采用ELISA 法,按照對應試劑盒說明書中的操作步驟測定血清IFN-γ 和IL-2 水平。

2.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS18.0 軟件進行處理,符合正態(tài)分布的計量資料以() 表示,各組小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL 殺傷活性、CD4+和CD8+細胞亞群比例,血清IFN-γ 和IL-2 水平對比采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤生長的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠體質(zhì)量下降(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠體質(zhì)量均有不同程度的增加,其中黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高劑量組體質(zhì)量增加(P＜0.05)。此外,與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠瘤質(zhì)量均下降(P＜0.05),各組的抑瘤率分別為35.61%、31.81%、21.97%。以上結(jié)果提示,白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用。見表1。

表1 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤生長的影響（， n=12）

表1 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤生長的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

3.2 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均降低(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均增加(P＜0.05)。以上結(jié)果提示,白花蛇舌草多糖可以改善荷瘤小鼠免疫能力。見表2。

表2 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響（， n=12）

表2 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

3.3 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL殺傷活性的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度及CTL 殺傷活性均降低(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度及CTL 殺傷活性均升高(P＜0.05)。以上結(jié)果提示,白花蛇舌草多糖可以通過提高小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度及增強小鼠CTL 殺傷活性來促進荷瘤小鼠免疫功能的提高。見表3。

表3 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL 殺傷活性的影響（， n=12）

表3 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化及CTL 殺傷活性的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

3.4 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠外周血T 淋巴CD4+和CD8+細胞亞群的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠外周血T 淋巴CD4+細胞百分比及CD4+/CD8+比值降低,而CD8+細胞百分比增加(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠外周血T 淋巴CD4+細胞百分比及CD4+/CD8+比值增加,而CD8+細胞百分比降低(P＜0.05)。見表4、圖1。

表4 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠外周血T 淋巴CD4+和CD8+細胞亞群的影響（， n=12）

表4 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠外周血T 淋巴CD4+和CD8+細胞亞群的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

圖1 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠外周血T 淋巴CD4+和CD8+細胞亞群的影響

3.5 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平的影響 與正常組比較,荷瘤模型組小鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平均降低(P＜0.05)；與荷瘤模型組比較,黃芪多糖及白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠血清IFN-γ 和IL-2水平均增加(P＜0.05)。以上結(jié)果提示,提高荷瘤小鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平可能是白花蛇舌草多糖抑制腫瘤生長的潛在機制。見表5。

4 討論

白花舌草多糖對多種腫瘤均有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn),其可以抑制人肺腺癌A549 細胞的轉(zhuǎn)移［8］,該作用與下調(diào)組織金屬蛋白酶表達及阻斷EGFR/Akt/ERK 信號通路有關。Wu 等［9］證實,白花舌草多糖對人喉鱗癌Hep2 細胞的增殖具有時間和劑量依賴性的抑制作用。體內(nèi)抑瘤實驗也發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草多糖對肝癌H22 和骨肉瘤S180 荷瘤小鼠的腫瘤生長均有抑制作用［10］。本研究通過皮下接種Renca細胞建立腎癌荷瘤小鼠模型,給予模型小鼠高、低劑量的白花蛇舌草多糖14 d 后,發(fā)現(xiàn)不同劑量的白花蛇舌草多糖均可以降低模型小鼠的瘤質(zhì)量,抑瘤率分別為31.81% 和21.97%,表明HDP 對腎癌荷瘤小鼠的腫瘤生長同樣具有抑制作用。

表5 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠血清IFN-γ 和IL-2水平的影響（， n=12）

表5 白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠血清IFN-γ 和IL-2水平的影響（， n=12）

注:與正常組比較,*P＜0.05；與荷瘤模型組比較,＃P＜0.05。

免疫器官是機體內(nèi)發(fā)生免疫應答的重要場所,免疫器官指數(shù)可以客觀的反映免疫器官的免疫水平和發(fā)育功能［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與荷瘤模型組比較,白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均明顯增加。淋巴細胞體外轉(zhuǎn)化是評價淋巴細胞功能強弱的重要指標,檢測小鼠淋巴細胞體外轉(zhuǎn)化可以有效反映小鼠細胞免疫能力的高低［12］。細胞介導免疫反應的主要效應細胞為CTL 細胞,測定CTL 殺傷活性是評價機體細胞免疫功能的重要手段,同時也是評價藥物對免疫系統(tǒng)影響的重要方法［13］。瞿俊勇等人研究發(fā)現(xiàn)［14］,白花蛇舌草多糖可以調(diào)節(jié)免疫抑制小鼠的免疫功能。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn),與荷瘤模型組比較,白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度及CTL 殺傷活性均顯著升高。以上結(jié)果表明,白花蛇舌草多糖可以通過增加免疫器官重量、提高小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度及增強小鼠CTL 殺傷活性來促進荷瘤小鼠免疫功能的提高。

在機體抗腫瘤免疫反應過程中,T 細胞亞群發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［15］。在生理條件下,機體內(nèi)各T 淋巴細胞亞群之間相互作用,保持動態(tài)的平衡以維持機體正常免疫功能；當動態(tài)平衡被打破,不同淋巴細胞亞群功能和數(shù)量發(fā)生異常時,可引起免疫功能下降并導致病理性改變［16］。在成熟T 淋巴細胞表面,CD4、CD8 不能同時表達,因而成熟的T淋巴細胞分為CD4+T 淋巴細胞亞群和CD8+T 淋巴細胞亞群。T 淋巴細胞亞群的檢測對惡性腫瘤的診斷、治療及預后均有重要意義,其中CD4+T 淋巴細胞數(shù)目增加會提升免疫能力,CD8+T 淋巴細胞數(shù)目減少會抑制腫瘤生長,CD4+/CD8+比值降低被公認為是腫瘤細胞免疫功能處于抑制狀態(tài)的表現(xiàn)［17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與荷瘤模型組比較,HDP 高、低劑量組小鼠外周血T 淋巴CD4+細胞百分比及CD4+/CD8+比值增加,而CD8+細胞百分比降低,表明白花蛇舌草多糖可以通過調(diào)節(jié)T 細胞亞群比例發(fā)揮抑制腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長的作用。

IFN-γ 和IL-2 等細胞因子與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后存在著緊密聯(lián)系,在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用［18］。IFN-γ 也稱調(diào)節(jié)免疫型干擾素,可通過免疫調(diào)節(jié)作用、抑制腫瘤細胞增殖、影響腫瘤細胞周期、抗血管生成等發(fā)揮抗腫瘤作用［19］。研究發(fā)現(xiàn),在惡性腫瘤患者體內(nèi)IL-2 表達明顯降低,其含量高低與腫瘤的發(fā)生及進展密切相關；IL-2 含量的提高,可以促進T 細胞對腫瘤抗原的敏感性,增強機體抗腫瘤免疫作用［20］。陳培豐等［21］發(fā)現(xiàn),龍葵提取物可以抑制Lewis 肺癌移植瘤的生長,該作用與升高荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2 水平有關。本研究同樣發(fā)現(xiàn),與荷瘤模型組比較,白花蛇舌草多糖高、低劑量組小鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平均顯著增加,表明提高荷瘤小鼠血清細胞因子水平可能是白花蛇舌草多糖抑制腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長的潛在機制。

綜上所述,白花蛇舌草多糖對腎癌荷瘤小鼠腫瘤生長具有抑制作用,該作用與免疫調(diào)節(jié)作用有關。