馬氏珠母貝PfAQP4 免疫功能初探

潘肖蘭 , 劉惠茹 , 許濛 , 許瀚之 , 張華 何毛賢

1. 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所, 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院, 廣東 廣州 510301;

2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

水通道蛋白4 (Aquaporin 4, AQP4)是一類(lèi)參與水運(yùn)輸?shù)哪まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 通常以四聚體形式存在, 在滲透壓調(diào)節(jié)中起重要作用(Ho et al, 2009; Pannicke et al, 2010)。AQP4 與多種人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān), 如腦水腫(Papadopoulos et al, 2007)。血腦屏障(Blood-brain Barrier, BBB)破壞后AQP4 大量表達(dá)可致腦水腫形成和發(fā)展, 該過(guò)程伴隨著氧化應(yīng)激水平的增加(Yang et al, 2014)。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白分解酶(Matrix Metalloproteinase, MMP)可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)增加毛細(xì)血管通透性從而促進(jìn)BBB 的破壞(武檸子 等, 2016), MMP 與AQP4 的表達(dá)關(guān)系密切, 某些藥物可以通過(guò)抑制MMP 的表達(dá)從而抑制AQP4 的表達(dá)來(lái)減輕BBB 的破壞, 在小鼠中MMP敲除可直接引起AQP4 表達(dá)量下調(diào), AQP4 敲除會(huì)導(dǎo)致MMP 表達(dá)異常(Zhou et al, 2010; Cao et al, 2016; Pérez-Hernández et al, 2017)。提高超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活力和下調(diào)AQP4 的表達(dá)可減輕腦水腫癥狀(Belayev et al, 2012; 王晶 等, 2018)。此外, 在人自身免疫性視神經(jīng)脊髓炎(NMO)患者的血清中 AQP4 抗體(AQP4-IgG)顯著升高, AQP4 肽的刺激可使NMO 患者的T 細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素17 (Interleukin, IL-17)等細(xì)胞因子(Nelson et al, 2010; Ulusoy et al, 2012; Wang et al, 2012)。AQP4 基因缺失可抑制或激活重要免疫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子核因子κB (Nuclear factor kappa B, NF-κB)信號(hào)通路, 從而抑制或促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放(Sun et al, 2016; Dai et al, 2018; Wang et al, 2019; Hua et al, 2020); 若抑制NF-κB 信號(hào)通路, 則會(huì)導(dǎo)致AQP4 基因的表達(dá)受到抑制(Sun et al, 2019)。這些研究表明AQP4 影響多種免疫相關(guān)因子的合成和分泌。目前已證實(shí)AQP4參與水產(chǎn)動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)(高沿, 2016), 但關(guān)于其免疫功能還沒(méi)有報(bào)道。

馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)是人工培育海水珍珠的主要母貝, 除了在自然狀態(tài)下可能會(huì)受到病原菌的入侵之外, 用其進(jìn)行人工育珠的過(guò)程中, 經(jīng)常會(huì)觀察到插核手術(shù)貝因病原菌入侵傷口而死亡的現(xiàn)象, 機(jī)體免疫顯著影響插核手術(shù)貝的成活率(Adzigbli et al, 2019, 2020)。我們前期克隆了馬氏珠母貝AQP4 (PfAQP4)并研究了其 在滲透壓調(diào)節(jié)中的功能(潘肖蘭 等, 2020), 本文擬探究 PfAQP4 是否具有免疫調(diào)節(jié)功能, 以期為馬氏珠母貝的抗性育種及病害防治等提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用約1 齡的馬氏珠母貝, 養(yǎng)殖于深圳大鵬澳海區(qū)。將試驗(yàn)貝暫養(yǎng)于室內(nèi)水池中, 水溫和鹽度等條件與海區(qū)一樣, 24h 充氣, 每天8:00 投喂餌料(亞心形扁藻) 1 次, 14:00 換水1 次。

1.2 免疫刺激試驗(yàn)

根據(jù)注射物不同分為脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)組、聚肌胞[Polyinosinic-polycytidylic acid, Poly (I:C)]組和磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)組(陰性對(duì)照) 3 個(gè)組, 每組60 只貝。將3 種注射物按試劑說(shuō)明書(shū)分別配置成質(zhì)量濃度為1μg·μL–1溶液后進(jìn)行注射, 每只貝注射劑量為100μL。分別于注射后12h、24h、36h、48h 和72h, 從每個(gè)組別中隨機(jī)取9 只貝, 取消化腺和外套膜組織立即置于液氮中保存。每3 只貝的同一組織混合作為1 個(gè)生物學(xué)重復(fù), 共3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 RNA 干擾試驗(yàn)

用美國(guó)Promega 公司的T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Production System 試劑盒進(jìn)行PfAQP4 dsRNA 的合成, 合成引物見(jiàn)表1。將15 只馬氏珠母貝隨機(jī)分成3 組, 分別是AQP 組、綠色熒光蛋白(GFP)組和PBS-r 組。其中AQP 組為試驗(yàn)組, 注射濃度為4μg·μL–1的PfAQP4 dsRNA 溶液40μL; GFP 是水母特有的一類(lèi)發(fā)光蛋白, 在其他生物體內(nèi)不存在, 因此不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果, 故將GFP 組作為陽(yáng)性對(duì)照組, 注射質(zhì)量濃度為4μg·μL–1的GFP dsRNA 溶液40μL; PBS-r 組作為陰性對(duì)照組, 注射40μL 1×PBS。7d 后分別對(duì)每只貝的外套膜組織進(jìn)行固定, 用于RNA 提取。

1.4 總RNA 提取、cDNA 模板合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用Magen 公司通用RNA 提取試劑盒提取組織的總RNA, 用UV-Vis Spectrophotometer Q5000 (QUAWELL)測(cè)定RNA 濃度, 1.5%瓊脂糖凝膠電泳 檢驗(yàn)RNA 質(zhì)量。用帶有去除基因組功能的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix With gDNA Remover (Toyobo)進(jìn)行cDNA 第一鏈合成, 用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo)和Light Cycler 480 (Roche, Switzerland), 18S rRNA 為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析, 每個(gè)樣品3 個(gè)技術(shù)重復(fù), 所檢測(cè)基因的實(shí)時(shí)熒光定量引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為: SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 5μL, 雙蒸餾水3.4μL, cDNA 模板1μL, 上下游引物各0.3μL, 共10μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性10min; 95℃ 10s, 56℃ 15s, 72℃ 15s, 45 個(gè)循環(huán)。2–Ct△法計(jì)算相對(duì)mRNA 表達(dá)量。用SPSS19.0 軟件的單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析, Tukey 法進(jìn)行進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析, 置信區(qū)間為95%。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示, 在p<0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用SPSSAU-在線SPSS 分析軟件(https://spssau.com/front/spssau/index.html)進(jìn)行 Pearson相關(guān)性分析。

表1 本研究所用的引物序列 Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 免疫刺激后PfAQP4 在外套膜和消化腺組織的表達(dá)情況

免疫刺激后PfAQP4 在外套膜中的相對(duì)表達(dá)情況如圖1a。在注射LPS 后12h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組(PBS 組)間無(wú)顯著性差異; 注射LPS 后24h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量為0.0103, 與PBS 組相比顯著升高(p<0.05), 是PBS 組的2.2倍; 注射后36h, PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量降至PBS 組水平。注射Poly(I:C)后12h 和24h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與相應(yīng)時(shí)刻PBS 組相比均無(wú)顯著性差異; 注射后36h 和48h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.0063 和0.0093, 與相應(yīng)時(shí)刻PBS 組相比均顯著升高(p<0.05), 分別是PBS 組的2.2 和1.5 倍; 注射后72h, PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量已降至PBS 組水平。

免疫刺激后PfAQP4 在消化腺中的相對(duì)表達(dá)情況如圖1b。注射LPS 后12h, PfAQP4 mRNA 的相對(duì) 表達(dá)量為0.0009, 與PBS 組相比顯著降低(p<0.05), 為PBS 組的0.5 倍; 注射后24h、36h 和48h, PfAQP4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與相應(yīng)時(shí)刻PBS 組相比均顯著升高(p<0.05), 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量分別為0.0041、0.0021 和0.0028, 分別是PBS 組的2.9、2.3 和2.2 倍; 注射后72h, PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與PBS 組相比已無(wú)顯著性差異。注射Poly(I:C)后12h、24h 和36h, PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量與相應(yīng)時(shí)刻PBS 組相比均無(wú)顯著性差異; 注射后48h, PfAQP4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量為0.0027, 與PBS 組相比顯著上升(p<0.05), 是PBS組的2.1 倍; 注射后72h 時(shí)PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量恢復(fù)至PBS 組水平。

圖1 3 種免疫刺激引起PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量在外套膜(a)和消化腺(b)中的隨時(shí)間變化情況 *表示同一時(shí)刻試驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著差異(p<0.05) Fig. 1 Relative mRNA expression of PfAQP4 in the mantle (a) and digestive gland (b) after immune stimulation. * indicates that the experimental group and control group are significantly different at the same time (p < 0.05)

2.2 RNA 干擾后免疫相關(guān)基因在外套膜的表達(dá)情況

PfAQP4 RNA 干擾效果及干擾后免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況如圖2。AQP 組、PBS-r 組和GFP 組中PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.003、0.011 和0.015, PfAQP4 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量在試驗(yàn)組與兩個(gè)對(duì)照組間均具有顯著性(p<0.05、p<0.01), 基因干擾效率為77%。溶酶體膜相關(guān)糖蛋白LAMP 基因在AQP 組、PBS-r 組和GFP 組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.01、0.04 和0.18, 其中AQP 組LAMP 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與GFP組相比顯著下降(p<0.05), 與PBS-r 組相比無(wú)顯著性差異; 核因子κBNF-κB 基因在AQP 組、PBS-r 組和GFP 組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.01、0.02 和0.04, AQP 組NF-κB 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與GFP 組相比顯著下降(p<0.01), 與PBS-r 組相比無(wú)顯著性差異; 銅鋅超氧化物歧化酶CuZn-SOD 基因在AQP 組、PBS-r組和GFP 組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.02、0.07和0.10, 與兩個(gè)對(duì)照組相比, CuZn-SOD 表達(dá)顯著下降(p<0.05、p<0.001); 基質(zhì)金屬蛋白分解酶MMP和白細(xì)胞介素IL-17 基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量各組間均無(wú)顯著性差異。

圖2 PfAQP4 表達(dá)抑制后5 個(gè)免疫相關(guān)基因在外套膜中的隨時(shí)間變化情況 a. PfAQP4 mRNA; b. LAMP mRNA; c. CuZn-SOD mRNA; d. MMP mRNA; e. NF-κB mRNA; f. IL-17 mRNA。*表示對(duì)照組與AQP 組差異顯著(p<0.05), **表示p<0.01, ***表示p<0.001 Fig. 2 Relative mRNA expression of 5 immune-related genes in the mantle after inhibition of PfAQP4 expression. * Indicates significant difference between the control group and AQP group (p < 0.05), ** indicates p < 0.01, and *** indicates p < 0.001

將AQP 組、PBS-r 組和GFP 組的PfAQP4 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與LAMP、NF-κB、CuZn-SOD、MMP 和IL-17 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 在5 個(gè)免疫相關(guān)基因中, CuZn-SOD、LAMP 和NF-κB 基因與PfAQP4 基因的相關(guān)系數(shù)分別為 0.818 (p<0.001)、0.674 (p<0.01)和 0.655 (p<0.05), 這3 個(gè)基因與PfAQP4 基因表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性; IL-17 基因與PfAQP4 基因的相關(guān)系數(shù)為0.515, 無(wú)顯著相關(guān)性; MMP 基因與PfAQP4 基因的相關(guān)系數(shù)僅為0.356, 兩者也無(wú)顯著相關(guān)性。

表2 RNA 干擾后PfAQP4 與免疫相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的相關(guān)性分析 Tab. 2 Correlation analysis of mRNA expression between PfAQP4 and immune-related genes in the mantle after RNA interference

3 討論

自1994 年AQP4 在人腦中被發(fā)現(xiàn)以來(lái), 其在高等脊椎動(dòng)物中的免疫調(diào)節(jié)功能已被廣泛認(rèn)知, 該基因的表達(dá)變化涉及免疫相關(guān)通路的激活和抑制, 與多種免疫相關(guān)因子的表達(dá)變化有關(guān)。本研究分析了免疫刺激后PfAQP4 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的改變以及PfAQP4 RNA 干擾后免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化, 研究結(jié)果表明PfAQP4 參與馬氏珠母貝免疫應(yīng)答。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分, 通常被用來(lái)模擬細(xì)菌感染, Poly(I:C)是一種人工合成的雙鏈RNA 類(lèi)似物, 通常被用來(lái)模擬病毒感染(孫樂(lè) 等, 2016; Liu et al, 2018)。在馬氏珠母貝中, 消化腺和外套膜都是重要的免疫器官(Zhang et al, 2018)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示注射LPS 和Poly(I:C)后, PfAQP4 基因的表達(dá)在外套膜和消化腺中均出現(xiàn)顯著變化, 說(shuō)明該基因參與馬氏珠母貝因LPS 和Poly(I:C)刺激引起的免疫應(yīng)答。在消化腺中, LPS 注射后24h 開(kāi)始出現(xiàn)PfAQP4 mRNA 表達(dá)量的顯著上調(diào), 而Poly(I:C)注射后出現(xiàn)PfAQP4 mRNA 表達(dá)量顯著上調(diào)的時(shí)間為48h, 說(shuō)明在消化腺中PfAQP4 響應(yīng)LPS 刺激比響應(yīng)Poly(I:C)刺激早。同樣, 在外套膜中, LPS 注射后24h 開(kāi)始出現(xiàn)PfAQP4 mRNA 表達(dá)量的顯著上調(diào), 而Poly(I:C)注射后PfAQP4 mRNA 表達(dá)量的顯著上調(diào)在36h 才觀察到, 也說(shuō)明了PfAQP4 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更為敏感。在本試驗(yàn)中, PfAQP4 在消化腺中的表達(dá)在LPS 刺激后12h 顯著下降, 該現(xiàn)象在外套膜中沒(méi)有觀察到, 這可能是由于不同組織的功能特異性, 對(duì)免疫刺激信號(hào)做出的響應(yīng)存在差異。消化腺是海洋軟體動(dòng)物的主要免疫組織已得到了廣泛的認(rèn)知。最近研究報(bào)道, 外套膜也作為重要的免疫器官參與馬氏珠母貝的免疫防御(Zhang et al, 2018)。馬氏珠母貝作為海水珍珠培育的主要母貝, 在進(jìn)行插核手術(shù)后外套膜小片增生形成珍珠囊, 此過(guò)程歷經(jīng)免疫識(shí)別、珍珠囊細(xì)胞分泌珍珠質(zhì)包裹珠核形成珍珠。因此, 對(duì)于馬氏珠母貝來(lái)說(shuō), 外套膜免疫顯得尤為重要(Zhao et al, 2012)。本試驗(yàn)分析了PfAQP4 RNA 干擾后外套膜免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化, 以此來(lái)說(shuō)明PfAQP4 與免疫相關(guān)基因之間的關(guān)系。PfAQP4 RNA 抑制后外套膜免疫相關(guān)基因(LAMP、CuZn-SOD、NF-κB、MMP 和IL-17)中除CuZn-SOD 基因在PfAQP4 注射組出現(xiàn)顯著下降外, 其他4 個(gè)基因(MMP、NF-κB、IL-17、LAMP)與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化, 說(shuō)明在馬氏珠母貝中, PfAQP4對(duì)這4 個(gè)免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用較小。Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)PfAQP4 和CuZn-SOD 相關(guān)系數(shù)為0.818 (p<0.001), 抑制PfAQP4 的表達(dá)可顯著抑制CuZn-SOD 的表達(dá), 說(shuō)明PfAQP4 和CuZn-SOD 位于同一條信號(hào)通路中。鑒于CuZn-SOD 最主要的功能是參與機(jī)體氧化應(yīng)激, 是重要的免疫相關(guān)基因(袁牧 等, 2016), 說(shuō)明PfAQP4 可能與CuZn-SOD 共同在免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。在水產(chǎn)動(dòng)物中, CuZn-SOD 在文蛤(Meretrix meretrix)(朱丹 等, 2010)、菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)(Li et al, 2010)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)(Lin et al, 2008)、皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus discus)(Kim et al, 2007)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(Ni et al, 2007)、海灣扇貝(Argopecten irradians)(Bao et al, 2009)等中均被發(fā)現(xiàn)與所研究物種的免疫應(yīng)答有關(guān), 該基因可在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng), 是一種急性期蛋白。本研究結(jié)果表明, 在馬氏珠母貝中PfAQP4 可調(diào)節(jié)CuZn-SOD 參與免疫應(yīng)答。

本研究首次發(fā)現(xiàn) PfAQP4 基因響應(yīng) LPS 和Poly(I:C)的免疫刺激。干擾PfAQP4 基因表達(dá)可導(dǎo)致CuZn-SOD 基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著下降, 兩者具有較高的正相關(guān)性, 說(shuō)明PfAQP4 可調(diào)節(jié)CuZn-SOD 基因的表達(dá)。鑒于CuZn-SOD 是一個(gè)公認(rèn)的免疫調(diào)節(jié)因子, 故推測(cè)PfAQP4 可能通過(guò)調(diào)節(jié)CuZn-SOD 從而參與馬氏珠母貝的免疫應(yīng)答。但 PfAQP4 如何調(diào)節(jié)CuZn-SOD 還需更深入的試驗(yàn)研究。