高溫對褐藻羊棲菜逆境生理的影響

劉麗杰 , 林立東

1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006;

2. 溫州市洞頭區(qū)海洋與漁業(yè)發(fā)展研究中心, 浙江 溫州 325700

羊棲菜(Sargassum fusiforme / Hizikia fusiformis)隸屬于褐藻門, 墨角藻目, 馬尾藻科馬尾藻屬/羊棲菜屬, 是西北太平洋特有的多年生暖溫帶性海藻(曾呈奎 等, 2000)。羊棲菜廣泛分布于中國、日本和朝鮮沿岸, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)、食療以及海藻工業(yè)方面具有很高的應(yīng)用價值(孫建璋 等, 1996; Zou et al, 2005)。我國的羊棲菜主要分布在遼東半島、山東、浙江、福建和廣東等地沿海, 其中浙江沿海尤其是洞頭生產(chǎn)的羊棲菜產(chǎn)量高、品質(zhì)最好(曾呈奎 等, 2000; 張展 等, 2002)。

羊棲菜具有一定的溫度適應(yīng)性, 在4～25℃時可以正常生長, 最適溫度生長為14～21.6℃ (孫圓圓 等, 2009)。在全球氣候逐漸變暖的大背景下, 浙江地區(qū)每年秋季發(fā)生的高溫回暖天氣給羊棲菜栽培業(yè)的可持續(xù)發(fā)展帶來了不可忽視的影響, 會造成羊棲菜大面積欠收, 給養(yǎng)殖業(yè)造成較大損失。目前關(guān)于溫度對羊棲菜的生長、生理及代謝方面有一定的研究, 趙素芬等(2015)研究發(fā)現(xiàn)溫度與光照強度會聯(lián)合影響羊棲菜幼孢子體的生長率, 溫度影響大于光照影響, 在21.5℃、66.04μmol·m–2·s–1條件下, 羊棲菜幼孢子體的體長和體寬增長率均達(dá)到最大值。當(dāng)羊棲菜生長溫度為22.9℃時, 總光合速率氧氣生成達(dá)到最大值12.55μmol·m–2·s–2(Kokubu et al, 2015); 當(dāng)溫度高于30℃, 羊棲菜的光合速率會迅速下降, 并且高溫會抑制有性生殖(Zou et al, 2018)。溫度和鹽度對羊棲菜的比增長率以及組織碳、氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有顯著影響, 溫度20℃、鹽度30‰時的比增長率達(dá)到最大值(6.04%·d–1); 溫度10℃、鹽度30‰時組織碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值(38.19%±1.01%); 溫度15℃、鹽度 10‰ 時組織氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值(2.78%±0.09%); 溫度15℃、鹽度20‰時葉綠素a和葉綠素 c 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到最大值(Li et al, 2019)。但關(guān)于高溫(高于25℃)對羊棲菜生理代謝的影響報道較少, 因此本研究以羊棲菜為試驗材料, 分別以常溫培養(yǎng)(22℃)和高溫脅迫(27℃和32℃)為對照組和試驗組, 通過研究不同時間水平下(第0、1、3、5、7 天)羊棲菜的生理特征, 探討高溫影響羊棲菜生理代謝的機制, 以期為全面認(rèn)識羊棲菜的抗逆性機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料用5 月份浙江省溫州市洞頭區(qū)海洋與漁業(yè)發(fā)展研究中心博士后工作站培育的羊棲菜的成熟孢子體。

1.2 試驗設(shè)計

從養(yǎng)殖區(qū)取回形態(tài)和株高均勻的羊棲菜樣品, 去除雜質(zhì), 在自然海水中培養(yǎng)24h, 然后將試驗材料放到三角燒瓶中, 燒瓶中放入海水, 培養(yǎng)密度為150g·L–1, 并通入空氣, 在光照培養(yǎng)箱中不同溫度(22℃為對照組, 27℃和32℃為高溫脅迫組)下培養(yǎng)7d。試驗期間每24h 更換一次海水, 試驗時的環(huán)境因素見表1, 光照時間為(6:00—18:00)。在試驗培養(yǎng)期間的第0、1、3、5、7 天收集羊棲菜氣囊, 用蒸餾水洗凈, 擦干, 液氮速凍, 放入–80℃冰箱備用, 每個培養(yǎng)3 個重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測定

相對電導(dǎo)率的測定采用電導(dǎo)法。具體步驟如下: 1) 用去離子水沖洗氣囊, 將氣囊分裝到3 只潔凈的稱量瓶中, 每瓶10 個氣囊。2) 向各瓶加10mL 去離子水, 置真空干燥箱中抽氣10min, 當(dāng)緩緩放入空氣時, 水即滲入細(xì)胞間隙, 葉片變成半透明狀, 沉入水下。3) 室溫放置1h, 將各瓶充分搖勻, 用電導(dǎo)率儀測初始電導(dǎo)率值(γ1)。4) 將各瓶置沸水浴中10min, 殺死植物組織。取出稱量瓶, 自來水冷卻至室溫, 室溫下平衡 10min, 搖勻, 測終電導(dǎo)率值(γ2); 5) 結(jié)果計算: 相對電導(dǎo)率(γ)=γ1×γ2–1(蒼晶 等, 2013)。

表1 試驗期間的環(huán)境條件 Tab. 1 The environment factors during experiments

丙二醛(Malondialdehyde, MDA)質(zhì)量摩爾濃度測定采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid, TBA)比色法。具體步驟如下: 1) 樣品提取: 稱取羊棲菜氣囊1g 放入研缽, 加10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid, TCA) 2mL 和少量石英砂, 研磨至勻漿, 再加8mL 10% TCA 進(jìn)一步研磨, 勻漿于4000r·min–1離心10min, 上清液為樣品提取液。2) 顯色反應(yīng)和測定: 吸取上清液2mL (對照加2mL 蒸餾水), 加入2mL 0.6% TBA 溶液, 混勻, 沸水浴中反應(yīng)15min, 迅速冷卻后離心。取上清液在紫外可見光分光光度計上測定450nm、532nm、600nm 的吸光值。3) 結(jié)果計算: MDA 質(zhì)量摩爾濃度(單位: μmol·g–1)=[6.45×(OD532- OD600) -0.56×OD450]×V×m–1。式中: V 為提取液體積(單位: mL); m 為羊棲菜氣囊鮮質(zhì)量(單位: g); OD532表示在532nm 的吸光值; OD600表示在600nm 的吸光值; OD450表示在450nm 的吸光值(李合生, 2000)。

可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定參考考馬斯亮藍(lán)G250 染色法進(jìn)行。具體步驟如下: 1) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線: 以系列不同質(zhì)量濃度(1～50μg·mL–1)的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液2mL, 分別加入染料試劑2mL, 立即混勻, 用分光光度計測定其620nm 的吸光值, 以蒸餾水2mL 加染料試劑2mL 作為比色空白對照。根據(jù)測定結(jié)果, 繪制出吸光值-蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。2) 樣品提取: 稱取氣囊樣品2g 放入研缽, 加2mL 蒸餾水研成勻漿, 轉(zhuǎn)移到離心管中, 然后用6mL 蒸餾水分次洗滌研缽, 洗滌液全部轉(zhuǎn)移至離心管, 放置1h以充分提取, 然后4000r·min–1離心20min, 棄沉淀, 上清液轉(zhuǎn)入容量瓶, 以蒸餾水定容至10mL, 混勻后待測。3) 比色測定: 用同一標(biāo)準(zhǔn)曲線和同樣的方法, 測定樣品溶液在620nm 處吸光值, 然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度, 并計算出樣品中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(張志良 等, 2015)。

可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定主要參考張治安等(2008)的蒽酮比色法進(jìn)行測定。具體步驟如下: 1) 可溶性糖的提取: 將氣囊在110℃烘箱烘15min, 然后調(diào)至70℃過夜。干樣磨碎后稱取50mg 樣品, 倒入10mL 刻度離心管內(nèi), 加入4mL 80%乙醇重復(fù)提取2次, 合并上清液。在上清液中加10mg 活性炭, 80℃脫色30min, 80%乙醇定容至10mL, 過濾后取濾液測定。2) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線: 取20mL 帶塞試管, 編號, 加入不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(葡萄糖質(zhì)量分別為0、10、20、40、60、80、100μg), 然后在每只試管中加入5mL 蒽酮試劑, 混勻, 蓋上蓋子, 在沸水浴中煮沸 10min, 取出, 立即用水冷卻至室溫, 在625nm 波長下, 分別測量各管的吸光值, 用0 號管調(diào)零。以吸光值為縱坐標(biāo), 葡萄糖含量為橫坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3) 測定: 吸取上述糖提取液1mL, 加入 5mL 蒽酮試劑混合, 用上述同樣的方法, 在625nm 處測得吸光值, 以0 號管調(diào)零。由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得提取液中糖含量, 然后根據(jù)每mL 提取液含有5mg 干樣品中的糖, 再計算樣品中糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定采用茚三酮法進(jìn)行。具體步驟如下: 1) 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線: 用100μg·mL–1脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg·mL–1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液各2mL, 加2mL 3%磺基水楊酸、2mL 冰醋酸和4mL 2.5%酸性茚三酮試劑于具塞試管中, 置沸水浴中顯色1h, 冷卻后加入4mL 甲苯, 蓋好蓋子于漩渦混合儀上震蕩0.5min, 靜置分層, 吸取紅色甲苯相, 于波長520nm 處測定吸光值, 以吸光值為縱坐標(biāo), 脯氨酸質(zhì)量濃度(單位: μg·mL–1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2) 樣品提取: 稱取羊棲菜氣囊0.5g 放入研缽, 加 3%磺基水楊酸溶液5mL, 研磨成勻漿, 轉(zhuǎn)入離心管, 沸水浴浸提10min, 冷卻后以3000r·min–1離心10min, 取上清液待測。3) 測定: 吸取上清液2mL, 加2mL 冰醋酸和4mL 2.5%酸性茚三酮試劑, 然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行甲苯萃取和比色。4) 結(jié)果計算: 脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(單位: μg·g–1) = mp×V×(Va×m)–1。式中: mp為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得提取液中脯氨酸質(zhì)量(單位: μg); V 為提取液總體積(單位: mL); Va為測定時所吸取的體積(單位: mL); m 為羊棲菜氣囊鮮質(zhì)量(單位: g)(李合生, 2000)。

超氧化物歧化酶(Superoxide, SOD)比活性測定參考Spycbaha J P 的方法(Spychalla, 1990)。具體步驟如下: 1) 粗酶液提取: 取氣囊樣品5g, 加入5 倍樣品量的酶提取液, 冰浴中研磨后以紗布過濾, 經(jīng)9075r·min–1離心20min, 上清液即為粗酶提取液。2) 酶活性測定: 測定前在54mL 14.5mmol·L–1甲硫氨酸中分別加入乙二胺四乙酸(EDTA)、氮藍(lán)四唑(NBT)、核黃素溶液各2mL, 混勻, 此為反應(yīng)混合液。在盛有3mL 反應(yīng)混合液的試管中, 加入適量的粗酶液, 混勻后放在透明試管架上, 于光照培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確照光10min, 迅速測定在560nm 的吸光值, 以不加酶液的照光管為對照, 計算反應(yīng)被抑制的百分比。3) 酶活性計算: 以能抑制反應(yīng)50%的酶量為一個SOD 酶單位。SOD 比活性(單位: U·mg–1) = (對照管OD 值-測定管OD 值)/50%加入粗酶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量(單位: mg)。

過氧化物酶(Peroxidase, POD)比活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。具體步驟如下: 1) 稱取羊棲菜氣囊1.0g 放入研缽, 加適量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)研成勻漿。勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管, 4℃、4000r·min–1離心10min, 上清液轉(zhuǎn)入25mL 容量瓶, 沉淀用5mL PBS再提取2 次, 上清液并入容量瓶, 定容至刻度, 低溫下保存?zhèn)溆谩?) 酶活性測定反應(yīng)體系: 2.9mL 0.05mol·L–1PBS, 1mL 2% H2O2, 1mL 0.05mol·L–1愈創(chuàng)木酚和0.1mL 酶液。用加熱煮沸5min 的酶液作為對照。反應(yīng)體系加入酶液后, 立即于37℃水浴中保溫15min, 然后迅速轉(zhuǎn)入水浴, 并加入2mL 20% 三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng), 過濾, 適當(dāng)稀釋, 在紫外可見光分光光度計470nm 波長下測定吸光值。3) 結(jié)果計算: 以1min 內(nèi)吸光值在470nm 處變化0.01 的酶量(△470)為一個酶活單位。POD 的比活性(單位: U·g–1·min–1) = △470×V×(m×Va×t)–1。式中: m 為氣囊鮮質(zhì)重(單位: g); t 表示反應(yīng)時間(單位: min); V 為提取酶液總體積(單位: mL); Va為測定時取用酶液體積(單位: mL)(蒼晶 等, 2013)。

過氧化氫酶(Atalase, CAT)比活性的測定參考過氧化氫還原法(Aebi, 1984)。具體步驟如下: 1) 酶液提取: 取氣囊0.5g 放入研缽, 加2～3mL 4℃預(yù)冷的PBS 和少量石英砂研磨成勻漿, 轉(zhuǎn)入25mL 容量瓶, 用PBS 沖洗研缽數(shù)次, 合并沖洗液, 定容至刻度?；旌暇鶆蚝笾?℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ?0mL 試管3 支, 其中2 支為樣品測定管, 1 支為空白管, 對照管依次加入粗酶液(煮沸) 0.2mL, PBS (pH 7.8) 1.5mL, 蒸餾水1.0mL。2) 酶活性測定: 25℃預(yù)熱后, 逐管加入0.3mL 0.1mol·L–1H2O2, 每加完1 管立即計時, 并迅速倒入石英比色杯中, 測定其240nm 的吸光值, 每隔1min 讀數(shù)1 次, 共測4min。3) 結(jié)果計算: 以1min內(nèi)吸光值在240nm 處減少0.1 的酶量(△240)為一個酶活單位。CAT 比活性(單位: U·g–1·min–1) = △240×V×(0.1×Va×t×m)–1, 式中: V 為粗酶液提取總體積(單位: mL); Va為測定用粗酶液體積(單位: mL); m 為氣囊鮮重(單位: g); t 為從加入H2O2到讀數(shù)的時間(單位: min)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 軟件21.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析, 包括采用One-way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析以及采用Duncan’s 法對平均值進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 高溫脅迫對羊棲菜氣囊細(xì)胞膜損傷的影響

質(zhì)膜透性?？勺鳛槟婢硞Φ囊粋€生理指標(biāo)。當(dāng)質(zhì)膜的選擇透性被破壞時細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲, 表現(xiàn)為電導(dǎo)率增加。如圖1 所示, 高溫脅迫使羊棲菜氣囊的電導(dǎo)率顯著增加(p<0.05), 并且32℃培養(yǎng)比27℃培養(yǎng)增加的幅度更大。在27℃培養(yǎng)時, 培養(yǎng)1、3、5、7d 時, 與對照組相比, 電導(dǎo)率分別增加了30.9%、56.3%、77.7%和97.7%; 在32℃培養(yǎng)時, 培養(yǎng)1、3、5、7d 時, 電導(dǎo)率分別增加了38.3%、93.6%、107%和167.5%。

圖1 高溫環(huán)境對羊棲菜氣囊相對電導(dǎo)率的影響 圖中不同字母代表差異顯著 Fig. 1 Effects of high temperature on the relative electrical conductivity of Sargassum fusiforme

在逆境條件下, 植物細(xì)胞經(jīng)常會發(fā)生不同程度的膜脂過氧化, 丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的分解產(chǎn)物。高溫培養(yǎng)的羊棲菜氣囊中MDA 質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(圖2), 在培養(yǎng)的前5d, MDA 質(zhì)量摩爾濃度始終高于對照, 第7 天時則低于對照組。在培養(yǎng)的前5d, 32℃組高于27℃組, 在第5天時, 27℃組和32℃組都顯著高于對照組(p<0.05), 分別比對照組增加了20.2%和24.8%, 在第7 天時, 27℃組和32℃組都顯著低于對照組(p<0.05), 分別比對照組減少了48.6%和40.2%。

圖2 高溫環(huán)境對羊棲菜氣囊中丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度的影響 圖中不同字母代表差異顯著 Fig. 2 Effects of high temperature on MDA content of Sargassum fusiforme

2.2 高溫脅迫對羊棲菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì), 其增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力, 對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。羊棲菜氣囊在高溫脅迫下的可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化如圖3 所示。隨著培養(yǎng)時間的增加, 27℃組和32℃組可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加, 始終高于對照組, 并且32℃組高于27℃組, 在培養(yǎng)第3 天時27℃組和32℃組可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照相比差異顯著(p<0.05), 在培養(yǎng)3、5 和7d 后, 27℃組蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照組分別增加了36.7%、32.7%和37.4%, 32℃組蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照組分別增加了40.6%、35.8%和57.8%。

圖3 高溫環(huán)境對羊棲菜氣囊中可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 圖中不同字母代表差異顯著 Fig. 3 Effects of high temperature on soluble protein content of Sargassum fusiforme

可溶性糖不僅能提供能量而且具有信號功能, 并且參與滲透調(diào)節(jié), 因此在羊棲菜的生命活動中極為重要。在本研究中高溫脅迫組羊棲菜氣囊的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對照組, 且27℃組可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于32℃組。27℃培養(yǎng)羊棲菜至第3 天和第5 天時氣囊中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對照組(p<0.05), 分別比對照組增加了73.0%和34.1%; 而32℃組僅在第3 天時可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于對照組, 比對照增加了34.1% (p<0.05)。從圖4 可以看出, 隨著高溫脅迫時間的增加, 可溶性糖含量先增加后減少。

脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一, 作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 當(dāng)植物受到逆境脅迫時會積累脯氨酸。在本研究中, 隨著高溫脅迫時間的增加, 羊棲菜氣囊中脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖5)。27℃和32℃高溫脅迫都可以使脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加, 且32℃高溫脅迫使脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加得更多, 在高溫脅迫的第1、3、5、7 天, 27℃組脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加了12.5%、40.6%、44.6%、20.1%, 32℃組脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照組相比分別增加了18.8%、51.7%、63.7%、39.3%。

圖4 高溫環(huán)境對羊棲菜氣囊中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 圖中不同字母代表差異顯著 Fig. 4 Effects of high temperature on soluble sugar content of Sargassum fusiforme

圖5 高溫環(huán)境對羊棲菜氣囊中脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 圖中不同字母代表差異顯著 Fig. 5 Effects of high temperature on proline content of Sargassum fusiforme

2.3 高溫脅迫對羊棲菜氣囊抗氧化酶的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員, 是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶。隨著高溫脅迫時間的增加, 羊棲菜氣囊的SOD 比活性逐漸增強。27℃和32℃組SOD 比活性均高于對照組, 并且32℃組SOD 比活性最強。培養(yǎng)3d 以后27℃和32℃組均顯著高于對照組(p<0.05)。在高溫脅迫的第3、5、7 天, 27℃組SOD 比活性分別增加了73.3%、35.4%、92.2%, 32℃組SOD 比活性分別增加了79.1%、47.9%、132.1% (圖6)。

過氧化物酶(POD)是由植物所產(chǎn)生的一類氧化 還原酶, 能催化很多反應(yīng)。隨著高溫脅迫時間的增加羊棲菜氣囊中POD 比活性先降低后升高, 培養(yǎng)至第3 天時達(dá)到最低值。在高溫脅迫的前5d 高溫培養(yǎng)組的POD 比活性均低于對照組, 并且32℃組低于27℃組。到脅迫第7 天時27℃組和32℃組POD 比活性均高于對照組, 但差異不顯著。27℃組在高溫培養(yǎng)的第1、3、5 天時POD 比活性與對照組相比顯著降低(p<0.05), 分別降低了32.3%、50.6%、24.1%, 32℃組在高溫培養(yǎng)的第1、3、5 天時POD 比活性與對照組相比也顯著降低(p<0.05), 分別降低了37.2%、54.6%、44.4% (圖7)。

圖6 高溫環(huán)境對羊棲菜氣囊中超氧化物歧化酶比活性的影響 圖中不同字母代表差異顯著 Fig. 6 Effects of high temperature on SOD activity of Sargassum fusiforme

圖7 高溫環(huán)境對羊棲菜氣囊中過氧化物酶比活性的影響 圖中不同字母代表差異顯著 Fig. 7 Effects of high temperature on POD activity of Sargassum fusiforme

過氧化氫酶(CAT)是催化過氧化氫分解成氧和水的酶, 存在于細(xì)胞的過氧化物體內(nèi)。在高溫脅迫組和對照組羊棲菜氣囊中CAT 活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 在第1 天時達(dá)到峰值。27℃培養(yǎng)至第1天和第3 天時CAT 比活性顯著高于對照組, 分別增加了25.3%和20.4%, 在第5 天和第7 天時低于對照組, 并且在第7 天時差異達(dá)到顯著水平(p<0.05), 比對照組減少了23.7%; 而32℃組僅在培養(yǎng)第1 天時CAT 比活性高于對照組, 但差異不顯著; 培養(yǎng)后期CAT 比活性均低于對照組, 且在處第5 天和第7 天時差異顯著(p<0.05), 分別降低了 29.5%和 16.9% (圖8)。

圖8 高溫環(huán)境對羊棲菜氣囊中過氧化氫酶比活性的影響 圖中不同字母代表差異顯著 Fig. 8 Effects of high temperature on CAT activity of Sargassum fusiforme

3 討論

正常情況下植物體內(nèi)各項生理代謝過程都是比較穩(wěn)定而協(xié)調(diào)的。當(dāng)植物遇到逆境脅迫時, 其體內(nèi)的各種代謝活動會受到影響而失調(diào), 使植物對逆境作出反應(yīng)(趙昕 等, 2001)。當(dāng)植物受到高溫脅迫后, 細(xì)胞膜系統(tǒng)會受到一定的損傷, 使膜的孔隙變大, 造成細(xì)胞內(nèi)的離子外滲, 最終導(dǎo)致細(xì)胞的相對電導(dǎo)率增加(祿鑫, 2012)。羊棲菜的正常生長溫度為4～25℃, 在本研究中, 27℃和32℃高溫培養(yǎng)使羊棲菜氣囊的電導(dǎo)率顯著增加, 并且32℃培養(yǎng)顯著高于27℃培養(yǎng), 說明高溫脅迫使羊棲菜氣囊的膜系統(tǒng)受到了傷害, 導(dǎo)致其體內(nèi)的離子外滲, 并且溫度越高, 傷害越大, 離子外滲越多。MDA 是細(xì)胞膜脂過氧化程度的體現(xiàn), MDA 質(zhì)量摩爾濃度的多少可以反應(yīng)逆境下植物受傷害的程度, MDA 的質(zhì)量摩爾濃度越高, 表明植物細(xì)胞膜受到的傷害越嚴(yán)重(Tartoura et al, 2011)。有研究表明, 植物受到高溫脅迫時, MDA 質(zhì)量摩爾濃度隨溫度升高而增加(Liu et al, 2000; Xu et al, 2006)。本研究中, 高溫培養(yǎng)前5d, MDA 質(zhì)量摩爾濃度高于對照, 在脅迫的第5 天達(dá)到最高值, 顯著高于對照, 與前人的研究結(jié)果基本一致, 并且32℃培養(yǎng)高于27℃培養(yǎng), 表明此時羊棲菜氣囊的細(xì)胞膜脂已經(jīng)發(fā)生了過氧化, 膜系統(tǒng)受到了損傷; 但到了脅迫第7 天時, 高溫培養(yǎng)組卻顯著低于對照, 推測可能在高溫脅迫培養(yǎng)7d 時, 羊棲菜已經(jīng)達(dá)到了生存的極限, 其體內(nèi)代謝已經(jīng)紊亂, 并且部分藻體已經(jīng)死亡, 也可能是試驗時存在一定的誤差, 最終導(dǎo)致MDA 質(zhì)量摩爾濃度下降。

高溫脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)會積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細(xì)胞膨壓對一些生理功能的調(diào)控(Bajguz, 2000), 這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的高低可以反映植物對逆境脅迫的適應(yīng)程度。本研究發(fā)現(xiàn), 高溫促進(jìn)了可溶性蛋白的積累, 溫度越高, 培養(yǎng)時間越長, 積累的可溶性蛋白越多, 這與趙勇竣等(2019)的研究結(jié)果一致, 他們發(fā)現(xiàn)番茄在高溫脅迫時可溶性蛋白積累增加。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)馬尾藻和龍須菜在高溫脅迫后可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降(賀亮, 2017; 付峰 等, 2017), 可見不同植物在高溫逆境下積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)并不一致, 推測可溶性蛋白可能起到了滲透調(diào)節(jié)和防止細(xì)胞質(zhì)過度脫水的作用(楊華庚 等, 2011)。高溫也使羊棲菜氣囊的脯氨酸和可溶性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加, 溫度越高, 脯氨酸和可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高, 可溶性糖含量在高溫脅迫培養(yǎng)第3 天達(dá)到峰值, 脯氨酸在高溫脅迫第5 天達(dá)到峰值, 這與番茄在高溫脅迫后可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后降低的趨勢一致(趙勇竣 等, 2019), 與龍須菜在高溫脅迫時脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后降低的趨勢一致(孫雪 等, 2013)。說明脯氨酸能提高原生質(zhì)的親水性, 有利于保護(hù)細(xì)胞; 可溶性糖是植物在逆境條件下不可缺少的能量儲存, 同時也是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 可以減少逆境脅迫對植物造成的傷害(趙勇竣 等, 2019)。到高溫脅迫第5 天后由于羊棲菜藻體部分死亡, 所以可溶性糖和脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均下降。

當(dāng)植物遭受高溫脅迫時, 細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積累, 使其代謝失衡, 最終造成細(xì)胞膜系統(tǒng)發(fā)生嚴(yán)重的氧化損傷(Mallick et al, 2000; Gill et al, 2010)。高溫脅迫會使植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)活性增強, 從而防止細(xì)胞內(nèi)過量積累的活性氧對植物造成的氧化傷害。SOD 能將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫, 成為植物細(xì)胞的第一道抗氧化防線。在本研究中, 高溫培養(yǎng)后SOD 活性增加; 溫度越高, 培養(yǎng)時間越長, SOD 活性越高, 說明羊棲菜氣囊在受到高溫脅迫時, 能將過多的超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2, 通過抗氧化酶SOD 活性增強來降低高溫脅迫對羊棲菜帶來的傷害。POD 和 CAT 能夠?qū)⑦^氧化氫(H2O2)分解, 從而緩解由于活性氧積累對細(xì)胞帶來的傷害, 但在本研究中POD 活性在高溫脅迫時并沒有顯著增加, 說明沒有更多的POD 參與到H2O2分解, 而CAT 活性也僅在27℃培養(yǎng)前3d 時高于對照, 說明溫度過高時, 超過羊棲菜所能承受的極限時, CAT 活性也因活性中心被破壞而下降。研究者可通過高溫脅迫下抗氧化酶活性來判斷植物的耐熱性強弱, 不同植物的抗氧化酶活性在高溫逆境時變化趨勢并不相同(王凱紅 等, 2011; 朱靜 等, 2012), 耐熱強的植物其抗氧化酶活性都明顯升高(李榮華 等, 2012)。

4 結(jié)論

羊棲菜對溫度的變化比較敏感, 特別是高溫對羊棲菜氣囊的生理代謝影響更大。高溫脅迫導(dǎo)致羊棲菜氣囊的膜系統(tǒng)受到了損傷, 造成了體內(nèi)的離子外滲, 細(xì)胞膜脂發(fā)生了過氧化現(xiàn)象; 細(xì)胞內(nèi)積累了可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì); 并且通過抗氧化酶SOD 比活性增強來降低高溫脅迫對羊棲菜帶來的傷害。溫度越高, 處理時間越長, 羊棲菜受到的傷害越大。