廣泛性焦慮對心肌梗死大鼠心房及外周血心房利鈉肽水平的影響

陳雅麗,侯季秋,王 威,靳會會,安 瑩,王 超,唐卓然,黃樂曦,賈靜蕓,趙海濱

焦慮是人類面臨壓力、應(yīng)激時出現(xiàn)的一種正常情緒反應(yīng)狀態(tài),由于社會及生活的巨大壓力,人類精神、情緒長久受抑,最終發(fā)展為焦慮、抑郁癥。自精神疾病備受關(guān)注以來,其發(fā)病率高、患病人群廣[1-2]、合并癥多[3-4]、工作障礙[5-6]的形勢,已經(jīng)廣泛影響人們的身心健康及生活。近年流行病學(xué)研究顯示,20%～42%心血管人群合并焦慮,焦慮作為心血管疾病的獨(dú)立危險因素,36%的冠心病心血管不良事件與焦慮有關(guān)[7-9]。焦慮能影響冠心病的預(yù)后,但焦慮對冠心病的影響尚處于探索階段。心房利鈉肽(ANP)在心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都發(fā)揮著作用[10],但心肌梗死與焦慮的聯(lián)系尚未明確。目前,關(guān)于ANP 在心肌梗死合并焦慮方面缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究,本研究旨在初步探索焦慮對心肌梗死大鼠外周血及ANP 的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級6 周齡健康雄性SD 大鼠22只,體重180～200 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證編號:SCXK(京)2012-0001。本實(shí)驗(yàn)取得北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SFP 級動物房,喂常規(guī)大鼠飼料及飲用水。

1.2 主要試劑及儀器 大鼠ANP 酶聯(lián)免疫試劑盒(目錄號:E02A0493,BlueGene);兔多抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)檢測抗體(AB-P-R 001);兔多抗ANP(27426-1-AP);兔多抗鈉尿肽受體A(NPRA,27426-1-AP);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗(BA1054)。

小動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司),小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics 公司),標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀(Thermo Scientific 公司,型號:Multiskan MK3),自動洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限公司,型號:DEM-3),離心機(jī)(美國 Sigma,型號:3K18)。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 依據(jù)前期造模研究基礎(chǔ)[11],采用不確定空瓶刺激法結(jié)合冠狀動脈左前降支結(jié)扎建立心肌梗死合并焦慮模型。

1.3.1.1 廣泛性焦慮模型 參照文獻(xiàn)及前期研究[11-12],采用不確定空瓶刺激法。造模周期21 d,造模期間大鼠自由攝食。前7 d 采用定時喂水訓(xùn)練,每日08:30～08:40 和晚上20:30～20:40 給予飲水,其他時段禁水讓大鼠處于口渴狀態(tài)。第8 天～第21 天進(jìn)行空瓶應(yīng)激,采用隨機(jī)數(shù)字表每日早晚選取一個飲水時間段給予空瓶,另一時間段喂水。

1.3.1.2 心肌梗死模型 采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎構(gòu)建心肌梗死大鼠模型。術(shù)前準(zhǔn)備,調(diào)整小動物呼吸機(jī)參數(shù),潮氣量為每次0.8 mL,吸呼比為1∶2,通氣頻率為80 次/min。將大鼠稱重后用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。備皮,消毒,固定大鼠,氣管插管,連接小動物呼吸機(jī)。定位在大鼠胸骨旁左側(cè)第3肋與第4 肋間,沿肋間方向切開皮膚,長約1.5 cm,逐層分離皮下組織、肌肉,撕開心包膜暴露心臟。用5.0縫合線,于心耳邊緣下2 mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支,進(jìn)針深度控制在1 mm、寬度1～2 mm,收線打結(jié)。術(shù)中肉眼可見結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌變白,逐層關(guān)閉胸腔。后移除呼吸機(jī),輕捏大鼠胸廓,輔助其恢復(fù)呼吸。術(shù)后腹腔注射0.2 mL 利多卡因防止心律失常,注射4×105U青霉素預(yù)防術(shù)后感染。術(shù)中及術(shù)后的大鼠蘇醒前注意保暖。術(shù)后第2 天行心電圖檢查,導(dǎo)聯(lián)Ⅰ、aVL、V1～V6中有6 個及以上導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)病理性Q 波即為心肌梗死模型成功。假手術(shù)穿線后打松結(jié),余步驟相同。

1.3.1.3 心肌梗死合并焦慮模型[11]在不確定空瓶刺激造模的第15 天對大鼠實(shí)行心肌梗死手術(shù),術(shù)后繼續(xù)予以7 d 的空瓶刺激,至第22 天造模完成。

1.3.2 分組方法 造模成功后對大鼠進(jìn)行超聲心動圖檢查及行為學(xué)試驗(yàn),處死動物,取血、心臟。將造模成功后的大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為心肌梗死組8 只(存活6 只)、假手術(shù)組(6 只)及心肌梗死合并焦慮組8 只(存活6 只)。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 超聲心動圖檢測 將大鼠稱重后用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,固定,左前胸大面積備皮,取左心室短軸切面,探測M 型曲線,每只大鼠取3 個連續(xù)心動周期,取平均值。主要檢測大鼠的左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室短軸縮短率(FS)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.4.2 曠場試驗(yàn)(OFT) 采用體積為100 cm×100 cm×40 cm 的木制黑箱,底板畫有25 個正方形格子,在安靜、弱光的環(huán)境下進(jìn)行。先讓大鼠適應(yīng)性活動5 min,再將大鼠放在箱底中央格,開始計時并攝像,觀察6 min 內(nèi)大鼠的活動情況。記錄大鼠在敞箱內(nèi)水平運(yùn)動格子數(shù)、垂直運(yùn)動次數(shù)以及中央停留區(qū)時間。

1.4.3 高架十字迷宮試驗(yàn)(EPM) 該試驗(yàn)裝置由兩條相對開臂(50 cm×10 cm)和相對閉臂(50 cm×10 cm×40 cm)組成,中央有一開闊區(qū)(10 cm×10 cm),十字迷宮離地面50 cm。先讓大鼠自由活動5 min,再將大鼠面向開放臂放入,開始計時并錄像,觀察5 min 內(nèi)大鼠在開臂和閉臂的活動情況,記錄大鼠的開臂次數(shù)(OE)、開臂停留時間(OT)、閉臂次數(shù)(CE)和閉臂停留時間(CT),計算OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)的比值。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測外周血ANP含量 大鼠麻醉后,打開腹腔,撥開內(nèi)臟暴露腹主動脈,用采血針進(jìn)行腹主動脈采血并置于普通采血管中,室溫靜置2 h,3 000 r/min 離心15 min,取上清液進(jìn)行檢測,根據(jù)ELISA 試劑盒說明書步驟進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.4.5 免疫印跡法(Western Blotting)檢測大鼠心房ANP 及NPRA 表達(dá)情況 經(jīng)腹主動脈采血后,摘取心房組織,迅速投于液氮罐中低溫保存。將心房組織充分裂解,加入配制好比例的AB 混合液,避光孵育,用DG-3022A 酶標(biāo)儀測定OD568,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)的OD 值計算樣品蛋白濃度。將提取的蛋白上清液與5×蛋白上樣緩沖液沸水浴10 min,變性完后冷卻至室溫再放入-20 ℃保存。將制備好的膠固定到電泳槽上,儲液池中倒入電泳液。用微量加樣器將制備好的蛋白樣品和Marker 加入上樣孔,加樣后進(jìn)行電泳1.5 h。取出凝膠根據(jù)Marker 切下目的條帶,剪出與PAGE 凝膠相同大小的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和濾紙,PVDF 膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。依次放好,夾緊板后放入轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)開始轉(zhuǎn)膜,封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗,使PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。用TBST 稀釋相應(yīng)的HRP 標(biāo)記二抗(1∶50 000 稀釋),浸泡于二抗孵育液中孵育2 h。洗去多余二抗,將ECL試劑按比例混勻,滴加工作液于PVDF 膜上反應(yīng),X 光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影,沖洗膠片。晾干膠片并掃描,用BandSca 分析膠片灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,將多組獨(dú)立樣本進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),如方差齊則采用單因素方差分析,必要時采用LSD 檢驗(yàn),方差不齊則采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3 組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較 與假手術(shù)組相比,心肌梗死組及心肌梗死合并焦慮組LVEF 及FS 明顯下降(P＜0.01),LVESD 和LVEDD 明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與心肌梗死組相比,心肌梗死合并焦慮組左室LVEF 及FS 有所下降,LVESD 和LVEDD 有所增加,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),說明焦慮刺激能促進(jìn)心肌梗死大鼠心功能惡化。詳見圖1～圖4。

圖1 3 組大鼠LVEF 比較

圖2 3 組大鼠FS 比較

圖3 3 組大鼠LVESD 比較

圖4 3 組大鼠LVEDD 比較

2.2 3 組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 行為學(xué)指標(biāo)包括曠場試驗(yàn)和高架十字迷宮試驗(yàn)。曠場試驗(yàn)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,心肌梗死合并焦慮組水平運(yùn)動格子數(shù)及垂直運(yùn)動次數(shù)明顯減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與假手術(shù)組相比,心肌梗死組垂直運(yùn)動次數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。高架十字迷宮結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,心肌梗死組與心肌梗死合并焦慮組更傾向于待在閉臂里,OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)均明顯下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),說明心肌梗死大鼠有一定的焦慮傾向。詳見圖5～圖8。

圖5 3 組大鼠水平運(yùn)動格子數(shù)比較

圖6 3 組大鼠垂直運(yùn)動次數(shù)比較

圖7 3 組大鼠OE/(OE+CE)比較

圖8 3 組大鼠OT/(OT+CT)比較

2.3 3 組大鼠外周血ANP 水平比較 與假手術(shù)組相比,心肌梗死組及心肌梗死合并焦慮組大鼠外周血ANP 水平均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。詳見圖9。

圖9 3 組大鼠外周血ANP 水平比較

2.4 各組大鼠心房ANP 及NPRA 表達(dá)情況 心房ANP、NPRA 及內(nèi)參GAPDH 蛋白特異性條帶見圖10A,條帶經(jīng)BandScan 分析膠片灰度值,其表達(dá)含量統(tǒng)計結(jié)果見圖10B、10C。與假手術(shù)組相比,心肌梗死組及心肌梗死合并焦慮組ANP 與NPRA 表達(dá)含量均明顯下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與心肌梗死組比較,心肌梗死合并焦慮組ANP 與NPRA 表達(dá)含量均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

本研究團(tuán)隊前期已成功建立心肌梗死合并焦慮模型,可用于心肌梗死合并焦慮疾病的研究[11]。該實(shí)驗(yàn)研究是在廣泛性焦慮模型的基礎(chǔ)上合并經(jīng)典的冠狀動脈左前降支結(jié)扎建立心肌梗死模型。通過行為學(xué)試驗(yàn)(高架十字迷宮和曠場試驗(yàn))對焦慮行為進(jìn)行評價,本研究結(jié)果證明了心肌梗死后大鼠也有一定的焦慮傾向。ANP 是肽類家族中最早發(fā)現(xiàn)的肽類蛋白,自1981年被發(fā)現(xiàn)后,大量研究已經(jīng)證實(shí)其在人體中的生理功能[13]。利鈉肽家族在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮互補(bǔ)作用,ANP 具有利鈉、利尿、血管舒張、抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、抗肥大和脂解活性、減小心肌缺血面積,在調(diào)節(jié)血容量、血壓和維持心臟結(jié)構(gòu)與功能方面發(fā)揮重要作用[14-17]。有關(guān)體內(nèi)、體外及臨床研究證據(jù)顯示,ANP 及相關(guān)通路是反映心臟代謝疾病的最佳指標(biāo)[18]。在中樞系統(tǒng)方面,ANP 與焦慮、抑郁癥、成癮行為、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙及其他壓力相關(guān)疾病有密切聯(lián)系[10,19-20]。有研究表明針刺的抗焦慮作用可能是通過調(diào)節(jié)ANP 及其受體實(shí)現(xiàn)的[21]。由于ANP 與心臟和心理均有內(nèi)在聯(lián)系,ANP 可能是心血管與心理疾病互為因果的潛在因素。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,心肌梗死大鼠及心肌梗死合并焦慮大鼠血漿ANP 含量升高,與臨床心肌梗死病人血漿ANP 升高結(jié)果一致,可能是心肌梗死后的一種應(yīng)激反應(yīng)。循環(huán)ANP 大部分由心房分泌,外周血ANP 升高,但該研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死動物心房ANP 及其受體表達(dá)明顯減少,與心肌梗死組相比,心肌梗死合并焦慮組心房ANP 及其受體表達(dá)升高,但心功能減退。證明心肌梗死動物合并焦慮刺激會進(jìn)一步惡化心功能,使心房ANP 及其受體應(yīng)激性增高。

綜上所述,焦慮可進(jìn)一步影響心肌梗死動物心功能指標(biāo),增加心肌梗死大鼠心房ANP 及其受體水平,使心房及外周ANP 應(yīng)激性增高。本實(shí)驗(yàn)在心肌梗死亞急性期內(nèi)進(jìn)行的各項(xiàng)指標(biāo)檢測,為進(jìn)一步探明焦慮對心肌梗死的影響,后期可從不同時間段動態(tài)觀察心房及外周血ANP 濃度變化。