Toll 樣受體對急性缺血性腦卒中臨床療效和預(yù)后的預(yù)測價值

王美娥,劉龍江,路永剛

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)是引起死亡及致殘的首要原因,美國每年約有795 萬例新發(fā)或復(fù)發(fā)腦卒中病人[1],我國隨著老齡化社會進程加快,腦卒中發(fā)病率不斷上升,其中AIS 占70%,增加了社會和家庭的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[2]。發(fā)病早期進行靜脈溶栓是挽救缺血半暗帶、降低致殘率和病死率的首選,但是受時間窗限制及病情嚴(yán)重程度不同,臨床療效和預(yù)后不盡相同。探討與療效和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物有助于識別高危人群,更好地指導(dǎo)臨床治療,改善病人預(yù)后。Toll 樣受體(Toll like receptors,TLRs)是一種跨膜蛋白,可以識別外源性病原體相關(guān)分子模式或內(nèi)源性應(yīng)激或損傷相關(guān)分子模式,并啟動炎癥反應(yīng)[3]。在TLRs 樣受體中,TLR2 和TLR4 在腦缺血再灌注損傷的病理過程中起重要作用,其介導(dǎo)的核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)激活參與AIS 后繼發(fā)性腦損傷[3]。TLR3 介導(dǎo)的TRIF(Toll/IL-1 receptor domain containing adaptor inducing IFN-β)信號通路參與了腦缺血預(yù)適應(yīng)后炎癥抑制過程[4]。TLR7、TLR8 是TLRs內(nèi)源性受體,來源于小膠質(zhì)細胞,均參與AIS 發(fā)病[5]。TLRs 是否能為AIS 臨床療效和預(yù)后評估提供有效信息尚待進一步探討,本研究檢測AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平,探討其臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年6 月—2019 年6 月我院神經(jīng)內(nèi)科收治的105 例AIS 病人。納入標(biāo)準(zhǔn):①首次發(fā)病,經(jīng)頭顱CT 或磁共振成像(MRI)證實存在腦缺血灶,符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[6]中AIS 診斷標(biāo)準(zhǔn);②發(fā)病后4 h 內(nèi)入院;③接受靜脈溶栓治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①CT 或MRI 提示出血性病灶;②既往AIS 或腦出血病史、顱內(nèi)巨大腫瘤等疾病;③近3 個月顱腦外傷史、顱內(nèi)手術(shù)史病人。105 例AIS 病人中,男57 例,女48 例;年齡51～69(64.39±3.71)歲;體質(zhì)指數(shù)(body mass index,BMI)23～27(24.01±2.69)kg/m2;發(fā)病至入院時間2～4(2.34±0.31)h;梗死面積:大梗死(直徑＞3.10 cm 并累及2 個腦解剖部位)36例,小梗死(直徑1.15～3.10 cm)51 例,腔隙性梗死(直徑＜1.15 cm)18 例;神經(jīng)功能缺損程度[7]:輕度[美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(National Institute of Health Stoke Scale,NIHSS)評分≤6 分]21 例,中度(NIHSS 7～14 分)57 例,重度(NIHSS 評分≥15分)27 例。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn),病人及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血清TLRs 檢測 所有病人入院24 h 采集空腹靜脈血3～5 mL,置于TDZ4-WS 低速自動平衡離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司),4 ℃3 000 r/min 離心15 min(離心半徑10 cm),取血漿保存于-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Fisher 公司)。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平,儀器為意大利全自動酶免分析儀BIOBASE2000,試劑盒購自美國Epitope Diagnostics 公司。

1.3 治療及療效評估 所有病人入院后均給予吸氧、營養(yǎng)神經(jīng)、改善腦循環(huán)、糾正電解質(zhì)紊亂等基礎(chǔ)治療,以及重組人組織型纖溶酶原激活物(recombinant human tissue plasminogen activator,rt-PA)靜脈溶栓治療。

1.4 預(yù)后評價 治療3 個月后,采用改良Rankin 量表(modified Rankin Scale,mRS)[8]評估病人臨床轉(zhuǎn)歸。無功能受限和遺留癥狀計0 分;有癥狀,無明顯功能障礙計1 分;輕度殘疾,但生活能自理,計2 分;中度殘疾計3 分;中重度殘疾計4 分;重度殘疾計5 分,死亡計6 分。0～2 分為預(yù)后良好,3 分及以上為預(yù)后不良。本組105 例病人治療3 個月預(yù)后良好86 例,預(yù)后不良19 例。

1.5 療效評價標(biāo)準(zhǔn) 治療4 周后評價療效,痊愈:NIHSS 評分減少91%～100%,殘疾程度0 級;顯效:NIHSS 評分減少46%～90%,殘疾程度1～3 級;有效:NIHSS 評分減少18%～45%,臨床癥狀有所好轉(zhuǎn);無效:NIHSS 評分減少＜18%或增加＞18%,甚至死亡[9]。將痊愈+顯效+有效合并為有效。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov 法進行擬合優(yōu)度檢驗,符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間采用單因素方差分析,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。采用Pearson 相關(guān)分析法分析TLRs 與梗死面積、NIHSS 評分、mRS 評分的相關(guān)性。采用受試者工作特征曲線(receiver operator characteristics curve,ROC)分析TLRs 對AIS 病人療效和預(yù)后的預(yù)測價值。所有統(tǒng)計均采用雙側(cè)檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同性別、年齡AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較 不同年齡、性別病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 不同性別、年齡AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較( ±s) 單位:ng/mL

表1 不同性別、年齡AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較( ±s) 單位:ng/mL

項目 例數(shù) TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR8年齡 ≥60 歲 59 7.46±2.35 12.31±3.35 7.01±2.62 1.10±0.13 1.09±0.45＜60 歲 46 7.31±2.31 11.02±3.49 6.95±2.53 1.21±0.18 1.02±0.43性別 男 57 7.45±2.38 11.76±3.59 6.99±2.53 1.13±0.26 1.05±0.43女48 7.32±2.43 11.73±3.61 6.98±2.46 1.17±0.29 1.07±0.41

2.2 不同梗死面積AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較 AIS 大梗死病人血清TLR3、TLR7 水平低于小梗死和腔隙性梗死病人(P＜0.05),TLR2 高于小梗死和腔隙性梗死病人(P＜0.05);小梗死病人血清TLR3、TLR7 水平低于腔隙性梗死病人(P＜0.05),TLR2 高于腔隙性梗死病人(P＜0.05)。不同梗死面積病人TLR4、TLR8 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 不同梗死面積AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較(±s) 單位:ng/mL

表2 不同梗死面積AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較(±s) 單位:ng/mL

與腔隙性梗死比較,①P ＜0.05;與小梗死比較,②P ＜0.05。

梗死面積 例數(shù) TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR8腔隙性梗死 18 4.13±1.53 15.16±4.52 6.71±2.35 2.45±0.43 1.03±0.41小梗死 51 7.32±2.16① 13.05±3.61① 6.94±2.43 1.13±0.34① 1.06±0.43大梗死 36 9.13±2.69①② 8.18±2.03①② 7.18±2.67 0.52±0.25①② 1.07±0.49

2.3 不同神經(jīng)功能缺損程度AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水 平比較 重度病人血清TLR3、TLR7 水平低于中度和輕度病人(P＜0.05),中度病人血清TLR3、TLR7 水平低于輕度病人(P＜0.05);重度病人血清TLR2 水平高于中度和輕度病人(P＜0.05),中度病人血清TLR2 水平高于輕度病人(P＜0.05)。不同神經(jīng)功能缺損程度病人TLR4、TLR8 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 不同神經(jīng)功能缺損程度AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較(±s) 單位:ng/mL

表3 不同神經(jīng)功能缺損程度AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較(±s) 單位:ng/mL

與輕度比較,①P ＜0.05;與中度比較,②P ＜0.05。

神經(jīng)功能缺損程度 例數(shù) TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR8輕度 21 4.05±1.63 15.46±4.36 6.53±2.03 2.22±0.39 1.05±0.34中度 57 7.69±2.71① 13.06±3.47① 6.71±2.35 1.02±0.43① 1.09±0.36重度 27 9.37±3.26①② 6.08±2.06①② 7.91±2.81 0.59±0.26①② 1.00±0.31

2.4 不同療效結(jié)果AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較 105 例AIS 病人治療有效80例,無效25 例。有效病人血清TLR3 水平高于無效病人(P＜0.05),TLR2 水平低于無效病人(P＜0.05)。有效與無效病人TLR4、TLR8、TLR7 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表4。

表4 不同療效結(jié)果AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較(±s) 單位:ng/mL

表4 不同療效結(jié)果AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較(±s) 單位:ng/mL

與無效比較,①P ＜0.05。

療效 例數(shù) TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR8有效 80 6.32±2.03① 13.35±4.13① 6.95±2.31 1.15±0.24 1.06±0.33無效 25 10.83±3.97 6.61±2.34 7.09±2.46 1.14±0.21 1.06±0.31

2.5 不同預(yù)后AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較 預(yù)后良好病人血清TLR3 水平高于預(yù)后不良病人(P＜0.05),TLR2 水平低于預(yù)后不良病人(P＜0.05)。預(yù)后良好與預(yù)后不良病人TLR4、TLR8、TLR7 比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表5。

表5 不同預(yù)后AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較(±s) 單位:ng/mL

表5 不同預(yù)后AIS 病人血清TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 水平比較(±s) 單位:ng/mL

與不良比較,①P ＜0.05。

預(yù)后 例數(shù) TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR8良好 86 6.53±2.11① 13.05±4.65① 6.85±2.16 1.16±0.25 1.03±0.28不良 19 11.32±3.84 5.84±2.31 7.58±2.34 1.09±0.21 1.19±0.35

2.6 TLRs 與AIS 病人梗死面積、NIHSS 評分、mRS評分的相關(guān)性 TLR2 與梗死面積、NIHSS 評分呈正相關(guān)(P＜0.05),與mRS 評分呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05);TLR3 與梗死面積、NIHSS 評分呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05),與mRS 評分呈正相關(guān)(P＜0.05);TLR7 與梗死面積、NIHSS 評分呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05),與mRS 評分無明顯相關(guān)(P＞0.05);TLR4、TLR8 與梗死面積、NIHSS 評分、mRS 評分均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。詳見表6。

表6 AIS 病人與TLRs 梗死面積、NIHSS 評分、mRS 評分的相關(guān)性

2.7 TLR2、TLR3 預(yù)測AIS 的臨床療效分析 ROC 分析結(jié)果顯示,TLR2、TLR3 預(yù)測AIS 臨床治療有效的曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為0.664[95%CI(0.541,0.787),P=0.014]、0.820[95%CI(0.722,0.919),P＜0.001],詳見圖1、圖2。TLR2、TLR3 預(yù)測AIS 臨床治療有效的最佳截斷值(cut-off)、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值詳見表7。

圖1 TLR2 預(yù)測AIS 臨床療效的ROC 曲線圖

圖2 TLR3 預(yù)測AIS 臨床療效的ROC 曲線圖

表7 TLR2、TLR3 預(yù)測AIS 臨床療效的效能

2.8 TLR2、TLR3 預(yù)測AIS 預(yù)后的價值分析 研究結(jié)果顯示,ROC 分析TLR2、TLR3 預(yù)測AIS 預(yù)后的AUC分別為0.788[95%CI(0.680,0.896),P＜0.001]、0.787[95%CI(0.654,0.921),P＜0.001],詳見圖3、圖4。TLR2、TLR3 預(yù)測AIS 預(yù)后的截斷值、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值詳見表8。

圖3 TLR2 預(yù)測AIS 預(yù)后的ROC 曲線圖

圖4 TLR3 預(yù)測AIS 預(yù)后的ROC 曲線圖

表8 TLR2、TLR3 預(yù)測AIS 預(yù)后的效能

3 討 論

腦組織缺血可導(dǎo)致炎性反應(yīng),引起繼發(fā)性腦損傷,先天免疫在腦缺血損傷中起著重要作用,目前TLRs在腦梗死病人中作用的研究相對較少,其臨床應(yīng)用價值尚待開發(fā)。TLRs 可識別外源性病原菌或感染,在免疫反應(yīng)中可被內(nèi)源性損傷信號激活,觸發(fā)炎癥反應(yīng)或細胞凋亡[10]。TLRs 通過髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號傳導(dǎo)途徑激活,介導(dǎo)白介素-1 受體相關(guān)激酶磷酸化,腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 識別,激活NF-κB 信號通路,增加促炎基因轉(zhuǎn)錄、表達,導(dǎo)致腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)等炎性因子釋放,加重炎癥反應(yīng)。AIS 發(fā)生后損傷腦組織或神經(jīng)細胞釋放熱休克蛋白、S100 蛋白等內(nèi)源性分子,被特定TLRs 識別并結(jié)合,進而誘導(dǎo)單核細胞或T 細胞活化,激活炎性反應(yīng),加重腦組織損傷[11]。因此,推測TLRs可能對AIS 臨床病情評估和預(yù)后預(yù)測提供有價值信息。

TLR2 是目前臨床研究相對較多的TLRs 受體,其在膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和內(nèi)皮細胞中均有廣泛的表達,參與機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。腦組織缺血缺氧后,TLR2 與炎癥通路輔助受體結(jié)合,加速促炎因子釋放,加劇腦缺血損傷[12]。TLR2-MyD88 信號通路可激活絲裂原活化蛋白激酶,誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-9 表達上調(diào),加劇腦血管屏障損傷[13]。本研究發(fā)現(xiàn),治療有效的AIS 病人血清TLR2 水平低于無效的AIS 病人,TLR2 與NIHSS 評分呈正相關(guān),可能與治療后梗死區(qū)域腦供血恢復(fù),缺血缺氧狀態(tài)改善,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)降低有關(guān)。小鼠大腦中動脈閉塞模型注射TLR2 抗體可抑制腦缺血后白細胞的聚集以及小膠質(zhì)細胞的遷移,挽救受損神經(jīng)元[14],說明TLR2 過度表達可加重腦缺血再灌注腦損傷。TLR2 與AIS 預(yù)后的關(guān)系尚不明確。本研究結(jié)果顯示,預(yù)后良好病人血清TLR2 水平低于預(yù)后不良病人,相關(guān)性TLR2 與mRS 評分呈負(fù)相關(guān),Brea 等[15]同樣發(fā)現(xiàn)AIS 發(fā)病12 h 內(nèi)全血TLR2 mRNA 表達與不良結(jié)局相關(guān),提示TLR2 表達異常升高是導(dǎo)致AIS 不良結(jié)局的主要原因之一。有研究指出TLR2 在腦梗死發(fā)病機制中發(fā)揮保護作用,TLR2 表達有助于梗死區(qū)域側(cè)支循環(huán)開放以及新生血管生成[16],TLR2 在預(yù)后良好AIS 病人中呈高度表達[17]。但是更多研究顯示抑制TLR2 表達及其信號通路可降低腦卒中后炎癥反應(yīng)和腦組織損傷活性,縮小腦梗死面積,降低急性病死率,減輕腦水腫,維持血-腦屏障功能[18-19]。

TLR3 是唯一通過TLRs-MyD88 途徑介導(dǎo)抗炎作用的模式識別受體,主要在膠質(zhì)細胞中表達,不直接參與TLRs 通路激活導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。短暫性局灶性腦缺血后,小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞TLR3 及其下游細胞因子IL-6 明顯降低,TLR3 激活可能促進缺血后神經(jīng)元的存活[20]。腦梗死后死亡神經(jīng)細胞釋放內(nèi)源性分子,與TLR3 結(jié)合募集調(diào)節(jié)蛋白,激活干擾素調(diào)節(jié)因子3,產(chǎn)生β干擾素、α干擾素等抗炎因子[21],進而抑制顱內(nèi)白細胞浸潤以及外周血B 淋巴細胞增殖,發(fā)揮降低炎性損傷,保護腦神經(jīng)的作用[22-23]。本研究結(jié)果顯示,TLR3 與AIS 病人梗死面積、NIHSS 評分呈負(fù)相關(guān),與mRS 評分呈正相關(guān),提示TLR3 在AIS 發(fā)病機制中發(fā)揮保護作用,TLR3 表達缺失與神經(jīng)缺損加重和不良預(yù)后有關(guān)。鄧玲娜等[24]研究顯示TLR3 表達與腦梗死良好結(jié)局有關(guān),TLR3 在腦缺血損傷中起修復(fù)作用。近期報道顯示TLR3 配體poly-IC 預(yù)處理可減少大鼠局灶性腦缺血后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增殖,促進神經(jīng)功能恢復(fù)[25]。

TLR4 是腦卒中促炎級聯(lián)反應(yīng)起始因子,其下游因子信號通路可介導(dǎo)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致梗死灶面積增加和缺血再灌注損傷[26]。本研究發(fā)現(xiàn),大梗死、重度神經(jīng)功能缺損AIS 病人TLR4 水平較高,但不同梗死面積、神經(jīng)功能缺損AIS 病人TLR4 水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,TLR4 與AIS 臨床療效和預(yù)后亦無明顯相關(guān)性,提示TLR4 可能對AIS 療效和預(yù)后評估尚無臨床價值。TLR7 與梗死面積和NIHSS 評分存在一定關(guān)聯(lián),但與mRS 評分較弱,可能與樣本量小、統(tǒng)計結(jié)果偏倚有關(guān)。

本研究ROC 曲線分析顯示,TLR2、TLR3 對AIS臨床療效和預(yù)后評估均有一定價值,提示TLR2 升高、TLR3 降低預(yù)示著AIS 病人療效、預(yù)后較差,臨床對于此類病人應(yīng)優(yōu)化治療方案,加強病情檢測,以最大限度改善病人預(yù)后。同時提示TLR2、TLR3 可作為AIS 治療的潛在靶點?？傊?TLRs 與AIS 病人臨床療效和預(yù)后有關(guān),血清TLR2、TLR3 水平可作為臨床療效評估和預(yù)后預(yù)測的輔助生物學(xué)指標(biāo)。