黃河鯉腎臟的顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)觀察

樊明明，宋予震，吳玉臣，呂玉金，張 麗，聶 丹，劉忠虎

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南 鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學，河南 鄭州 450046)

脊椎動物的腎臟是機體維持體液平衡的主要器官，魚類是水生低等脊椎動物，其腎臟起源于中胚層的生腎節(jié)，在發(fā)育過程中經(jīng)歷頭腎和中腎兩個階段，并各自具備相應的輸導管，即前腎管和中腎管[1]。魚類的腎臟不僅是主要的泌尿器官，還是主要的免疫造血器官，尤其是頭腎，在功能上相當于高等脊椎動物的脊髓[2]。目前，一些學者分別對Pleuronectesplatessa[3]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[4]、鱖魚(Sinipercachuatsi)[5]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[6-7]、南方鲇(Silurusmeridionalis)[8]以及黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[9]的頭腎進行了研究，從組織學、細胞學等方面闡述了頭腎的主要結(jié)構(gòu)和功能。Ellis等[10-14]分別對多種魚類的中腎進行了組織和功能的研究，通過這些研究對比發(fā)現(xiàn)，腎臟在不同的魚類中存在些許差異，其發(fā)育過程可能具有一定的進化意義。但是截至目前，關(guān)于鯉魚腎臟的系統(tǒng)研究資料還較少，已知關(guān)海紅[12]對鯉魚(Cyprinuscarpio)的腎臟進行了觀察，其研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬作用下，鯉魚腎臟會發(fā)生腎小球萎縮及局部腎組織壞死，但并未指明頭腎與中腎的差別。因此筆者以黃河鯉(C.carpiohaematopterus)為研究對象，對其頭腎和中腎結(jié)構(gòu)分別進行顯微和亞顯微水平上的觀察，以期為黃河鯉組織學和免疫學研究方面提供參考資料，進而完善硬骨魚類的相關(guān)研究資料，同時也為魚類的進化研究提供可參考的基礎(chǔ)性材料。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗用健康黃河鯉，購自鄭州市水產(chǎn)市場，充氧運回實驗室，置于水溫20 ℃的養(yǎng)殖箱中充氣暫養(yǎng)7 d后用于試驗操作。

1.2 組織切片制作

用MS-222麻醉并解剖魚體取出頭腎和中腎，浸入波恩氏液4 ℃固定24 h后用自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度6 μm，經(jīng)蘇木精—伊紅(H·E)和過碘酸—雪夫(PAS)染色，中性樹膠封片后置于光學顯微鏡(Motic)下觀察并拍照(Motic Images Plus 2.0)。

1.3 透射電鏡樣品制作

取頭腎和中腎組織，修塊后浸入2%多聚甲醛與2.5%戊二醛混合固定液(0.1 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.4)，4 ℃固定過夜，0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液 4 ℃下沖洗3 h，1%鋨酸4 ℃固定1 h，雙蒸水沖洗，經(jīng)梯度丙酮脫水后，Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染，JEOL JEM-1230透射電鏡觀察并照相。

2 結(jié) 果

2.1 腎臟的解剖學結(jié)構(gòu)

鯉魚頭腎(前腎)位于心腹腔隔膜的前背方，新鮮時顏色呈褐紅色，無被膜，由左右對稱形似長橢圓形的兩葉構(gòu)成，直徑約0.5 cm，頭腎與中腎之間有條索樣組織相連，為中腎組織的延伸，邊緣不整齊，與背大動脈平行貼附。中腎也稱體腎，是魚類成體的排泄器官，呈塊狀組織，緊貼體腔背壁，腹面覆有腹膜，中腎分左右兩葉，左側(cè)為近似四邊形，右側(cè)為近似三角形；寬約1.3 cm。沿中腎向下依然有條索狀中腎組織延伸，同時左、右側(cè)中腎各連一條輸尿管；輸尿管眼觀為白色細管狀結(jié)構(gòu)，向尾部延伸，最終匯聚入泄殖腔(圖1a)。

2.2 腎臟的顯微和亞顯微結(jié)構(gòu)

2.2.1 頭腎

光學顯微鏡下：頭腎中無腎單位，未見明顯小梁，有大量的血管分布，其他部分主要為擬淋巴組織。頭腎中的細胞主要有：淋巴細胞(占大部分)、粒細胞、紅細胞、成團或散在分布的黑色素巨噬細胞以及甲狀腺濾泡(圖1b)。

電子顯微鏡下：頭腎中細胞類型較為豐富，淋巴細胞和紅細胞數(shù)量最多，其次電鏡下可見血管內(nèi)皮細胞、嗜酸性粒細胞以及小桿細胞，也有一些未知的細胞類型存在(圖1c)。此外，還可見未知細胞中的低電子密度顆粒(圖1d)及巨噬細胞內(nèi)的線粒體(圖1e)。

2.2.2 中腎

光學顯微鏡下，中腎由腎單位、擬淋巴組織、結(jié)締組織、血管組成。腎單位包括腎小管和腎小體。

腎小體又稱馬氏小體，外被腎小囊又稱鮑曼氏囊。馬氏小體壁薄，壁層由單層扁平上皮構(gòu)成，此上皮組織延伸包圍該小球，在腎小體尿極處與腎小管頸段相連，此外其血管極與球外毛細血管相通，分為出球微動脈和入球微動脈，兩者的管內(nèi)皮均為單層扁平上皮，但出球微動脈的管腔較入球微動脈粗。臟層由足細胞構(gòu)成，足細胞呈星形多突狀，胞體較大，包在每條毛細血管的外面，過碘酸—雪夫染色時毛細血管壁呈陽性(圖2)。

腎小管是由腎小體尿極延伸出的管狀結(jié)構(gòu)，由于其上皮細胞高度、管腔大小、以及刷狀緣有無的不同，可以將腎小管分為以下幾段：

頸段：該段較短，管腔較窄，壁為單層矮立方上皮細胞，界限清晰，細胞核為圓形且占的比例較大，著色深，管腔游離面刷狀緣發(fā)達，管壁上皮細胞高約(10.3±1.3) μm，腔徑約(9.5±1.7) μm，刷狀緣高(2.4±0.9) μm(圖2a)。過碘酸—雪夫染色時，胞質(zhì)不著色，核呈深藍色，刷狀緣呈強陽性(圖2b)。

第一近端小管：該段長且彎曲，管腔的平均直徑較頸段大，壁為單層柱狀上皮，細胞排列緊密，界限不清晰，游離面具有發(fā)達的刷狀緣，柱狀細胞高度約(23.4±3.6) μm，腔徑約(16.8±2.3) μm，刷狀緣高度約(4.1±1.3) μm，有的第一近端小管上皮細胞之間，往往夾雜有大量染色較深的淋巴細胞(圖2c)。過碘酸—雪夫染色時胞質(zhì)著色較淺，刷狀緣呈強陽性(圖2d)。

第二近端小管：上皮細胞為單層高柱狀，細胞核呈橢圓形，位于細胞端位，胞質(zhì)著色較淺，細胞界限不清晰。柱狀細胞高度約(17.3±2.1) μm，管腔直徑約(22.3±1.9) μm，刷狀緣高度約(2.6±0.8) μm。上皮細胞高度下降，刷狀緣的發(fā)達程度也不及第一近端小管(圖2e)，其重吸收功能有所減弱。過碘酸—雪夫染色時胞質(zhì)著色淺，刷狀緣陽性程度較第一近端小管低(圖2f)。

圖2 中腎腎小管、集合管、輸尿管及中腎內(nèi)的其他結(jié)構(gòu)Fig.2 Renal tubules，collection tube,ureter and other structures in mesonephrosa～b.頸段，黑色箭頭示刷狀緣；c～d.第一近曲小管，黑色箭頭示刷狀緣；e～f.第二近曲小管，黑色箭頭示刷狀緣；g～h.間段，黑色箭頭示管腔無刷狀緣；i～j.遠端小管，黑色箭頭示不規(guī)則刷狀緣；k～l.集合管，黑色箭頭示管外基膜；m.集合管；n.輸尿管；o～p.甲狀腺濾泡；q～r.黑色素巨噬細胞；s～t.腎小體，黑色實心箭頭示腎小囊腔，黑色空心箭頭示腎小囊壁層，白色空心箭頭示腎小囊臟層，白色實心箭頭示出球微動脈，空心三角形示入球微動脈；圖a、c、e、g、i、k、o、q、s為蘇木精—伊紅染色；圖b、d、f、h、j、l、p、r、t為過碘酸—雪夫染色；NS.頸段；PⅠ.第一近曲小管；PⅡ.第二近曲小管；IS.間段；D.近端小管；CT.集合管；G.腎小體；MM.黑色素巨噬細胞.a—b.neck segment,brush border (black arrow);c—d.the first proximal convoluted tubule,brush border (black arrow);e—f.the second proximal convoluted tubules,brush border (black arrow);g—h.intermediate segment,no brush border in it (black arrow);i—j.the distal tubule,irregular brush border(black arrow);k—l.the collection tube,basement-membrane (black arrow);m.collection tube;n.ureter;o—p.thyroid follicular;q—r.melanin macrophages,;s—t.renal corpuscle,capsular space (black solid arrow),the parietal layer of renal capsule (black hollow arrow),the visceral layer of renal capsule (white hollow arrow),efferent arteriole (white solid arrow),hollow triangle shows afferent arteriole;figures a,c,e,g,i,k,o,q,and s are stained by H·E;figures b,d,f,h,j,l,p,r,and t are stained by PAS;NS.neck segment;PⅠ.the first proximal convoluted tubule;PⅡ.the second proximal convoluted tubule;IS.intermediate segment;D.proximal tubule;CT.collection tube;G.renal corpuscle;MM.melanin macrophage.

間段：與頸段相似，細胞呈立方狀，高度(10.1±1.5) μm，細胞核圓形，但較頸段細胞核著色淺，細胞質(zhì)著色不均勻，呈放射線狀，上皮細胞間會夾雜淋巴細胞，是連接近端與遠端小管的過渡部分，管腔較窄，腔徑(4.1±0.8) μm，無刷狀緣(圖2g)，過碘酸—雪夫染色時無明顯陽性部位(圖2h)。

遠端小管：管徑明顯較第一、二近端小管小，細胞為單層矮柱狀(近立方)，高度(15.1±2.1) μm，細胞界限清晰，核為圓形，有不規(guī)則刷狀緣，高度(2.0±1.2) μm，有的上皮之間也存在游走淋巴細胞(圖2i)，過碘酸—雪夫染色時刷狀緣呈弱陽性(圖2j)。

集合管：是由腎小管匯集形成，有單個存在(圖2l)，也有集中區(qū)域(圖2k，m)，其管徑大小不一，介于10～40 μm間，上皮外有明顯的基膜層，且上皮間游離淋巴細胞明顯增多，隨著不斷延伸，管外基膜逐漸增厚，最后匯集進入輸尿管。

輸尿管：上皮為復層上皮，管腔內(nèi)有大量黏液，管外有較厚的黏膜肌層，厚約40 μm，主要由環(huán)肌構(gòu)成(圖2n)。

甲狀腺濾泡：蘇木精—伊紅染色時，嗜酸性強，呈粉紅色均質(zhì)狀，過碘酸—雪夫染色時呈強陽性(圖2p)直徑大小不一，小至2～3 μm，大至20～30 μm，呈橢圓形或不規(guī)則形分布。甲狀腺濾泡上皮為單層扁平細胞(圖2o)。

黑色素巨噬細胞：為圓形或橢圓形，直徑1～3 μm不等，蘇木精—伊紅染色時呈褐黃色，團狀或散在分布于腎組織間(圖2q)，過碘酸—雪夫染色時呈陽性(圖2r)。

電子顯微鏡下，除了腎單位之外，中腎中最常見的細胞類型為淋巴細胞和血細胞，也可見內(nèi)皮細胞、小桿細胞、嗜酸性粒細胞以及未知的細胞類型(圖3a)；腎小管上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體及其清晰的核(圖3b)。腎小球濾過膜主要包括3部分，腎小囊臟層、基膜、毛細血管內(nèi)皮。腎小囊臟層主要由足細胞組成，外形不規(guī)則，胞體圍繞毛細血管內(nèi)皮細胞，足細胞胞體伸出形成初級突起，初級突起又形成次級突起，即為足突，緊貼在毛細血管基膜上。小突起之間有許多孔隙——裂孔。毛細血管為有孔型，附著在基膜上(圖3c)。

圖3 中腎超微結(jié)構(gòu)Fig.3 The ultrastructure of mesonephrosa.中腎，白色五角星示淋巴細胞，白色空心箭頭示血管內(nèi)皮細胞，黑色實心箭頭示腎小管上皮細胞，黑色空心箭頭示未知細胞；b.腎小管上皮細胞，黑色箭頭示胞質(zhì)內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；c.腎小球濾過膜，白色實心箭頭示血管內(nèi)皮細胞，黑色空心箭頭示足細胞，白色空心箭頭示足細胞初級突起，大黑色實心箭頭示次級突起，小黑色實心箭頭示血管球基膜;E.嗜酸性粒細胞;N.細胞核;RBC.紅細胞;RC.小桿細胞;R.小桿.a.mesonephros,lymphocytes (white pentagram),vascular endothelial cells (white hollow arrow),the epithelial cells of renal tubular (black solid arrow),and unknown cells (black hollow arrow);b.the epithelial cells of renal tubular,mitochondria and endoplasmic reticulum (black arrow);c.glomerular filtration membrane,vascular endothelial cell (white solid arrow),podocyte (black hollow arrow),primary processes (white hollow arrow),secondary processes (large black solid arrow),glomerular basement membrane (small black solid arrow);E.eosinophils;N.nucleus;RBC.red blood cell;RC.rodlet cell;R.rodlet.

3 討 論

3.1 黃河鯉腎臟組織結(jié)構(gòu)和功能與其他硬骨魚類的比較

根據(jù)外部形態(tài)，硬骨魚類腎臟大致可分為5種類型[2]，黃河鯉腎臟類型屬于其中1種：頭腎較為明顯，但已無腎單位，組織基本上為淋巴樣組織，細胞類型較為豐富，可見有散在的黑色素巨噬細胞和甲狀腺濾泡。

頭腎是魚類胚胎時期的主要泌尿器官，隨著個體發(fā)育逐漸失去泌尿機能，成為具有造血功能的免疫器官[1,15-16]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃河鯉的頭腎內(nèi)沒有腎單位，主要由擬淋巴組織、血竇及一些散在的粒細胞、黑色素巨噬細胞、甲狀腺濾泡和內(nèi)含較多超低電子密度物質(zhì)的未知細胞構(gòu)成。目前除了有學者在成體彈涂魚(Periopthalmuscantonensis)頭腎內(nèi)發(fā)現(xiàn)腎單位之外，其他已報道的硬骨魚類頭腎中均未見腎單位[6,11,17]，沒有腎單位充分說明黃河鯉的頭腎已經(jīng)完全失去泌尿功能。莫桑比克羅非魚[4]的頭腎有門狀區(qū)、淋巴管、被膜下竇和淋巴濾泡等，其與哺乳動物的淋巴結(jié)相似，而黃顙魚[9]和西藏墨頭魚(Garrakempi)[18]的頭腎內(nèi)未發(fā)現(xiàn)甲狀腺濾泡，這種差異是否與魚類的生理狀態(tài)或生活環(huán)境相關(guān)還有待進一步研究確認，但是大量的擬淋巴組織和血竇的存在，學者們均認為頭腎是硬骨魚的兼具造血功能的免疫器官。

黃河鯉的中腎有完整的腎單位，但有些海水魚如海馬、海龍等的腎單位缺腎小球，相比較，淡水魚比海水魚有更大和更多的腎小球。黃河鯉的腎小管由腎小體的尿極開始依次分為頸段、第一近端小管、第二近端小管、間段、遠端小管、集合管，最后匯集進入輸尿管，與其他硬骨魚類相比，不僅分段存在差異，各段的管腔大小以及管壁上皮細胞高度，刷狀緣的有無和高度均存在一定的差異，這也是目前爭議較多的地方，如食蚊魚(Gambusiaaffinis)[11]無頸段但是有間段，貝氏高原鰍(Triplophysableekeri)[13]和西藏墨頭魚[18]均無頸段和間段。Sakai[19]認為硬骨魚類均缺少頸段和間段，而林浩然[20]則認為魚類均有頸段和間段，根據(jù)筆者的觀察結(jié)果，黃河鯉的腎小管有頸段和間段。這說明黃河鯉的中腎是其主要的泌尿器官。同時在中腎中還觀察到了小桿細胞，該細胞僅存在于硬骨魚類中，是一種具有潛在免疫功能的細胞[21-23]，這說明中腎不僅具有泌尿功能，還具有一定的免疫功能。

3.2 不同組織結(jié)構(gòu)與進化地位

頭腎和中腎的腎實質(zhì)中，除了存在血管結(jié)締組織外，還存在有擬淋巴組織，主要包括血竇、淋巴細胞、紅細胞、粒細胞、小桿細胞以及黑色素巨噬細胞和甲狀腺濾泡，擬淋巴組織的多少反映了魚類的進化水平[24-26]，黃河鯉腎臟內(nèi)大部分為擬淋巴組織，同時還存在一些甲狀腺濾泡和黑色素巨噬細胞，說明其在硬骨魚類的進化中處于中等地位[27-28]。此外在黃河鯉中腎內(nèi)偶見多個集合管聚集在一起由基膜包裹的現(xiàn)象，在西藏墨頭魚中腎中未見此現(xiàn)象，在斑鱖(S.scherzeri)[27]腎組織中則有較多集合管聚集存在的現(xiàn)象，因此推測黃河鯉的進化地位處于中等地位[18]。

4 結(jié) 論

黃河鯉頭腎已退化為具有造血功能的免疫器官，中腎為主要的泌尿器官，且在頭腎和中腎組織中均存在一種硬骨魚類特有的具有潛在免疫功能的小桿細胞，進一步說明了黃河鯉腎臟具有一定的免疫功能，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征綜合推測黃河鯉在硬骨魚的進化中處于中等地位，但魚類的進化和演變過程較為復雜，具體的進化地位研究需要更多資料支撐以確定。