芪參益氣滴丸聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌梗死小鼠血管新生及心功能的影響研究

何貴新，肖 婷，秦偉彬，林 琳，莫霄云，張清偉，吳成強(qiáng)，申永艷，玉黎燕，馮雨菲

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科二區(qū)，廣西 南寧530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530299）

近年來，隨著當(dāng)代社會(huì)人口老齡化加劇，以及現(xiàn)代生活水平的提高造成飲食習(xí)慣、工作壓力等改變，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的發(fā)病率也不斷攀升，據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示［1］，中國(guó)每年AMI 新發(fā)病例至少為50 萬例，已嚴(yán)重威脅到人類生命健康，加重家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心肌組織再生能力弱，一旦細(xì)胞凋亡、壞死等發(fā)生受損，心肌組織將被纖維瘢痕組織所取代，導(dǎo)致心室順應(yīng)性下降，最終影響心臟功能。近年來，通過胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、骨骼干細(xì)胞、內(nèi)源性心臟干細(xì)胞等多種類型的干細(xì)胞移植的細(xì)胞治療方法，以修復(fù)壞死心肌，減緩心臟重塑，改善心臟收縮和舒張功能，防治心功能不全，是近年來的熱點(diǎn)研究方向［2，3］。目前臨床上多采用藥物溶栓、手術(shù)介入以解決血管堵塞的問題，該治療方法具有恢復(fù)心肌缺血再灌注的作用，但無法很好地修復(fù)或逆轉(zhuǎn)已受損的心肌細(xì)胞，因此無法從根本上改善心臟功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchy-mal stem cells，BMSCs）在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要角色，目前研究學(xué)者也趨向進(jìn)行受損心肌的干細(xì)胞移植研究，認(rèn)為是另外一種較有前景的心肌梗死治療方法［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［5，6］，中藥復(fù)方芪參益氣滴丸在減少炎癥反應(yīng)、改善心肌代謝、保護(hù)受損心肌等方面，具有明顯的積極意義。另外，盡管目前有較多關(guān)于BMSCs 治療心肌梗死的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前研究，但迄今未見BMSCs 聯(lián)合應(yīng)用芪參益氣滴丸干預(yù)心肌梗死小鼠的治療研究。因此，本研究采用體外細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，旨在觀察芪參益氣滴丸聯(lián)合BMSCs 移植對(duì)心肌梗死小鼠血管再生及心功能的影響，以期為心肌梗死與心梗后缺血再灌注損傷的防治提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J 雄性健康清潔級(jí)小鼠68 只：6～8 周齡，體重25～34 g。其中8 只小鼠提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞備用。全部小鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)，晝夜各半明暗環(huán)境交替。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自廣西大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格遵循美國(guó)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和應(yīng)用指南》，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵守廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物、試劑與主要儀器

芪參益氣滴丸作為實(shí)驗(yàn)藥物，其主要由中藥丹參、黃芪、三七、降香組成，由天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030139，規(guī)格為每袋0.5 g，用蒸餾水將芪參益氣滴丸制備為3.9 mg/mL濃度的藥液，保存?zhèn)溆谩?5% 胎牛血清（Gibco 公司），0.25% 胰蛋白酶消化液（Gibco 公司），明膠（Sunshine 公司），DAPI（Invitrogen 公司），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4（Sigma 公司），一抗Rat anti-mouse CD31、CD105、CD45、CD117、CD90.2（BioLegend公司），熒光二抗APC conjugate Goat anti-Rat IgG二抗（ThermoScientific 公司），流式染色緩沖液（eBioscience 公司），TUNEL 試劑盒（Roche 公司）。細(xì)胞攝像及成像系統(tǒng)及熒光顯微鏡（日本Olympus公司），小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖機(jī)（加拿大VisualSonics Ve?vo 2100）；可拍照光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將60 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為心肌梗死組（MI+PBS 組）、心肌梗死+間充質(zhì)干細(xì)胞移植組（MI+MSCs 組）和心肌梗死+間充質(zhì)干細(xì)胞移植+芪參益氣滴組（MI+MSCs+QSYQ 組），每組20 只。BMSCs 移植組運(yùn)用30 G 進(jìn)樣針抽取20 μL干細(xì)胞懸液，在心肌梗死小鼠模型梗死區(qū)取4 個(gè)點(diǎn)均勻注射5 μL 的BMSCs 細(xì)胞懸液，MI+PBS 組則在相同心肌區(qū)域注入等量的PBS。干細(xì)胞移植術(shù)后，將備置好的3.9 mg/mL 濃度的芪參益氣滴丸藥液按動(dòng)物體表面積給予MI+MSCs+QSYQ 組小鼠相應(yīng)劑量灌胃，另外兩組按等量PBS 灌胃，每天1次，連續(xù)14 d。

1.4 制備小鼠心肌梗死模型

制備MI 模型前，小鼠需禁食12 h，不禁水，稱重，以10% 水合氯醛腹腔注射充分麻醉，小鼠仰臥位固定于恒溫動(dòng)物解剖臺(tái)上，剔除小鼠胸前毛發(fā)，充分消毒后頸正中縱向切開頸部皮膚，分離氣管，行氣管插管后予接入小動(dòng)物呼吸機(jī)（頻率110 bpm，吸呼比1∶1.2，潮氣量1.8 mL），進(jìn)行5%異氟烷氣體麻醉，2%的濃度維持，連接心電監(jiān)護(hù)及心電導(dǎo)聯(lián)進(jìn)行生命征監(jiān)測(cè)。以左第4、5 肋骨為手術(shù)位置，打開胸腔，剪開心包膜，暴露心臟，用無菌6-0 絲線于左心耳下1～2 mm 處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，以Ⅱ?qū)?lián)心電圖J 點(diǎn)呈弓背抬高趨勢(shì)，T 波出現(xiàn)異常，同時(shí)心肌顏色發(fā)紺等表現(xiàn)提示心肌缺血形成，同時(shí)說明MI動(dòng)物模型制備成功。

1.5 BMSCs 的制備、培養(yǎng)和鑒定

采用全骨髓貼壁法聯(lián)合密度梯度離心法進(jìn)行骨髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。將8 只小鼠脫頸處死后，收集脛骨、腓骨中骨髓腔中的細(xì)胞，加入含有15%胎牛血清的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用2 mL 注射器吸取完全培養(yǎng)基，沖洗骨髓腔，收集沖洗液?；旌暇鶆颍M(jìn)行離心，離心后重懸，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶，同時(shí)在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為2.5×107cell/mL。多次反復(fù)換液，第14 天，每瓶細(xì)胞加入0.5 mL 0.25%胰酶進(jìn)行消化，2 min 后加入1.5 mL 完全培養(yǎng)基進(jìn)行中和，收集所有懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞棄去，收集的細(xì)胞再次離心重懸后，進(jìn)行傳代，傳代比例為1∶1，第21 天時(shí)，收集所有懸浮細(xì)胞，獲得BMSCs。接種至24 孔板，37℃、5%CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，24 h 后加入4%多聚甲醛4℃固定15 min，棄去固定液，PBS 清洗3 次，分別在每孔中加入anti-CD90.2、anti-CD45、anti-CD31、anti-CD117、an?ti-Ly6A 一抗（1∶100），室溫、避光孵育30 min，PBS反復(fù)清洗3 次，加入熒光二抗，30 min 后加入DAPI工作液，10 min 后PBS 清洗3 次，用熒光顯微鏡仔細(xì)觀察并拍照。

1.6 心功能檢測(cè)

干細(xì)胞移植21 d 后，分別進(jìn)行麻醉狀態(tài)下彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組小鼠心功能指標(biāo)：左室舒張末內(nèi)徑（LVDd）、左室收縮末內(nèi)徑（LVSd），左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）。采用Vevo2100 小動(dòng)物彩色超聲儀，切面選擇心尖四腔心及二腔心切面、胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面，測(cè)定值取3 個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期平均值為標(biāo)準(zhǔn)，在M 超下測(cè)定以上參數(shù)。

1.7 免疫組化染色和微血管密度的測(cè)定

脫蠟，10 mmol/L pH 6.0 的檸檬酸鹽緩沖液中使玻片維持在95～99 ℃10 min 加熱，進(jìn)行熱抗原修復(fù)，冷切、孵育；每個(gè)切片上加稀釋的一抗（anti-CD31 和anti-Ki67），4℃孵育過夜；滴加二抗，DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色進(jìn)展，一旦切片染色成功，立刻將玻片浸入水中終止顯色、復(fù)染、沖洗、封閉。通過圖像采集儀采集相片，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0（IPP 6.0）圖像分析軟件進(jìn)行對(duì)陽(yáng)性表達(dá)微血管面積所占選擇區(qū)域面積的百分比計(jì)算。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最終實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量統(tǒng)計(jì)

無中途脫落實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，60 只小鼠均可納入實(shí)驗(yàn)結(jié)果并分析。

2.2 心梗小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

在光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)形態(tài)大小不均一的類圓形，見圖1A～D；72 h 后開始可見紡錘樣貼壁細(xì)胞，仍雜有類圓形細(xì)胞，部分細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)；第7 天時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，絕大部分為紡錘樣貼壁細(xì)胞，明顯呈集落生長(zhǎng)，類圓形細(xì)胞極少；第14 天骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)越來越密集，雖然大部分仍呈紡錘樣，但部分干細(xì)胞已呈現(xiàn)不規(guī)則多角形。通過免疫熒光染色，干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物CD90.2 和Ly6A 呈高表達(dá)，CD31 和CD117幾乎不表達(dá)。見圖2A～D。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定（熒光顯微鏡，×200）Fig 1 Morphological observation and identification of bone marrow mesenchymal stem cells（fluorescence microscope，× 200）

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫熒光染色圖（免疫熒光染色，×200）Fig 2 Immunofluorescence staining map of bone marrow mesenchymal stem cells（immunofluorescence staining，× 200）

2.3 各組心臟超聲診斷結(jié)果比較

細(xì)胞移植后第21 天，與MI+PBS 組比較，MI+MSCs 組和MI+MSCs+QSYQ 組的心功能指標(biāo)LVDd、LVSd 均明顯減小，LVEF、LVFS 均明顯 升 高（P＜0.05）；與MI+MSCs 組 比 較，MI+MSCs+QSYQ 組LVEF 値增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖3。

表1 各組BMSCs 移植21 d 心功能指標(biāo)的比較（n=20，±s）Tab 1 Comparison of cardiac function indexes in each group on the 21st day after BMSCs transplantation（n=20，±s）

表1 各組BMSCs 移植21 d 心功能指標(biāo)的比較（n=20，±s）Tab 1 Comparison of cardiac function indexes in each group on the 21st day after BMSCs transplantation（n=20，±s）

注：與MI+PBS 組比較，*P＜0.05；與MI+MSCs 組比較，#P＜0.05。

組別LVFS(%)LVDd(mm)LVSd(mm)LVEF(%)MI+ PBS 組MI+ MSCs 組MI+MSCs+QSYQ 組4.66 ± 0.143.67 ± 0.1943.58 ± 3.4021.66 ± 1.89 4.36 ± 0.11*3.32 ± 0.11*47.92 ± 1.61*23.96 ± 0.96*4.08 ± 0.05*3.03 ± 0.06*52.12 ± 0.75*#26.93 ± 0.59*4.285＜0.05 FP 18.061＜0.05 21.204＜0.05 1.973＜0.05

2.4 各組梗死區(qū)域新生血管形成情況比較

圖3 BMSCs 移植21 d 后檢測(cè)LVDd、LVSd、LVEF、LVFS 表達(dá)的心臟超聲圖像Fig 3 Echocardiographic images of LVDd，LVSd，LVEF and LVFS expression detected 21 days after BMSCs transplantation

采用免疫組織化學(xué)染色，各組梗死區(qū)域微血管顯示黃棕色，見圖4。各組梗死區(qū)域微血管密度定量分析結(jié)果：MI+PBS 組梗死區(qū)的微血管密度為（10.13±0.26）%；MI+MSCs 組為（19.46±0.74）%；MI+MSCs+QSYQ 組 為（23.63±1.11）%。 與MI+PBS 組 相 比，MI+MSCs 組 和MI+MSCs+QSYQ 組微血管密度增加（見紅色箭頭處），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。因此也說明移植MSCs 對(duì)心肌梗死區(qū)域周邊血管的新生具有明顯的促進(jìn)作用。

圖4 各組心肌梗死區(qū)域微血管形成情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）Fig 4 Microangiogenesis in the infarcted area of each group（immunohistochemical staining，× 400）

表2 各組梗死區(qū)域微血管密度定量分析（±s）Tab 2 Quantitative analysis of microvessel density in infarct?ed area in each group（±s）

表2 各組梗死區(qū)域微血管密度定量分析（±s）Tab 2 Quantitative analysis of microvessel density in infarct?ed area in each group（±s）

注：與MI+PBS 組比較，*P＜0.05。

組別MI+ PBS 組MI+MSCs 組MI+ MSCs + QSYQ 組微血管密度（%）10.13±0.26 19.46±0.74*23.63±1.11*15.082＜0.05 FP

3 討論

隨著當(dāng)前社會(huì)急救觀念的加強(qiáng)，各省各院胸痛中心工作的高效運(yùn)轉(zhuǎn)，PCI 手術(shù)治療以及再灌注時(shí)間的充分掌握，急性心梗患者死亡率顯著降低，但心肌梗死后再灌注會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死并引發(fā)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，使心肌中Ⅲ型與I 型膠原的比值增高，相應(yīng)地心肌細(xì)胞彈性出現(xiàn)降低，甚至瘢痕形成，引起心室重構(gòu)、心律失常和心功能下降，是心功能衰竭和惡性心律失常發(fā)生的主要原因，給家庭和社會(huì)帶來巨大的精神壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。Bergmann 等［7］發(fā)現(xiàn)人類左心室包含心肌細(xì)胞大約20～40 億，正常成人心肌細(xì)胞平均每年僅更新1%，這僅能維持水平極低的日常代謝更新的需要，無法在心肌梗死后進(jìn)行補(bǔ)充和修復(fù)，更不可能通過心肌細(xì)胞自身增殖或遷移而使得受損心肌細(xì)胞自愈［8］。所以，干細(xì)胞移植有促進(jìn)心肌細(xì)胞再生作用，使受損或凋亡的心肌細(xì)胞、血管重新增殖分化，對(duì)有功能的心肌細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充，從而恢復(fù)心臟收縮功能，減輕AMI 后的心室結(jié)構(gòu)重建，無疑是將來治療心血管疾病的重要手段。

MSCs 是具有自我增殖、更新和多向分化能力的生物特性，可從臍帶、牙髓、骨髓和脂肪組織等多種孤立的組織中獲得，具有取材方便、易于分離培養(yǎng)、且具有免疫排斥性低等特點(diǎn)［9］，已成為AMI 后再生治療的熱點(diǎn)種子細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，移植的MSCs，通過自分泌［10］和旁分泌［11］作用方式，釋放胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素-6 等各類生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，間接刺激內(nèi)源性心臟祖細(xì)胞的遷移、增殖和分化，從而使基因表達(dá)上調(diào)以抑制心肌細(xì)胞凋亡，具有促炎［12］、組織修復(fù)［13］、促進(jìn)心肌再生［14］和血管新生［15］等多種生物學(xué)作用。但是，在心肌梗死缺血缺氧的微環(huán)境條件下，經(jīng)移植后的MSCs 存活率不樂觀，隨著當(dāng)代對(duì)中醫(yī)藥的不斷深入研究及探索，在干細(xì)胞增殖、分化微環(huán)境中傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有提高存活率、協(xié)同增效的作用，中西并重，共同發(fā)展，這也給干細(xì)胞移植治療心肌梗死提供了新的研究思路。

本研究采用芪參益氣滴丸為主要干預(yù)藥物，為中藥復(fù)方，主要組成是丹參、黃芪、三七、降香，具有人參皂苷Rg1、黃芪甲苷、丹參酮等主要活性化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷具有擴(kuò)冠、改善心肌微循環(huán)、清除氧自由基、改善心功能等作用［16］；人參皂苷Rg1 有降低心肌耗氧、營(yíng)養(yǎng)心肌的功效［17］；丹參酮為丹參的主要成分，其在增強(qiáng)心肌收縮力、改善微循環(huán)等方面具有促進(jìn)作用［18］。本研究團(tuán)隊(duì)在實(shí)驗(yàn)研究中亦發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸可以擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善心肌能量代謝、抗血小板聚集，保護(hù)受損心肌的作用［19，20］。

本實(shí)驗(yàn)為獲得較高純度的BMSCs，采用全骨髓貼壁法聯(lián)合密度梯度離心法進(jìn)行干細(xì)胞對(duì)的分離和培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs 具有強(qiáng)大的自我更新和增殖能力，在干細(xì)胞移植72 h 內(nèi)貼壁并成集落生長(zhǎng)，且與培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)成正相關(guān)。另外，本實(shí)驗(yàn)選擇結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支超急性期進(jìn)行BMSCs 細(xì)胞移植，這一點(diǎn)更符合臨床實(shí)際。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，經(jīng)細(xì)胞移植組的心功能指標(biāo)更優(yōu)于模型對(duì)照組，并且在梗死區(qū)微血管密度定量分析中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在毛細(xì)血管壁結(jié)構(gòu)生成和微血管數(shù)量方面發(fā)揮重要作用，說明移植MSCs 能明顯促進(jìn)心肌梗死預(yù)期的血管新生情況，同時(shí)中藥復(fù)方芪參益氣滴丸能夠很好地保護(hù)心肌，有利于彌補(bǔ)干細(xì)胞移植存活率低的不足。

綜上所述，隨著細(xì)胞治療技術(shù)的發(fā)展，芪參益氣滴丸聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)能使受損心臟組織修復(fù)、提高移植療效，在心肌梗死小鼠血管新生和改善心功能方面起促進(jìn)作用。該研究結(jié)果對(duì)臨床推廣BMSCs 移植治療AMI 應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)佐證，但目前，如何更好地避免外源性細(xì)胞與宿主細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)、BMSCs 轉(zhuǎn)入機(jī)體后保持基因高表達(dá)及基因特異性的安全性、心肌細(xì)胞再生及轉(zhuǎn)化的詳細(xì)機(jī)制等問題，還需進(jìn)一步研究。