全自動在線頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚塘投毒案件水樣中硫丹和硫丹硫酸酯

王 丹，張云峰，董林沛?，姜 紅

(1.中國人民公安大學偵查學院，北京 100038；2.公安部物證鑒定中心，北京 100038)

硫丹于1956年由赫司特公司開發(fā)[1]，是一種廣譜有機氯殺蟲殺螨劑。商品化的硫丹是α-硫丹、β-硫丹兩種立體異構(gòu)體以質(zhì)量比7∶3組成的混合制劑，在環(huán)境中的代謝產(chǎn)物主要為硫丹硫酸酯[2-3]。硫丹和硫丹硫酸酯環(huán)境半衰期長，對生物體具有神經(jīng)、生殖和發(fā)育毒性，自2019年3月起，已在全球范圍內(nèi)禁用[4-5]，但其仍通過多種非法途徑流入市場。

硫丹由于其高毒性常被用于魚塘投毒案件中，造成大量經(jīng)濟損失甚至影響社會穩(wěn)定。在刑事技術(shù)領(lǐng)域，開發(fā)快速、準確的硫丹測定方法已成為長期關(guān)注的焦點之一。在魚塘投毒案件中，魚塘面積大導(dǎo)致目標毒物含量較低，養(yǎng)殖過程中投放各種藥物導(dǎo)致魚塘水基質(zhì)復(fù)雜。相關(guān)測定方法的研究雖然較多，但是每種測定方法都有不同方面的局限性。硫丹可以采用氣相色譜法[6]和氣相色譜-質(zhì)譜法[7]進行測定。氣相色譜法僅依靠保留時間定性，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果；氣相色譜-質(zhì)譜法使用美國國家標準與技術(shù)研究院(NIST)譜庫進行檢索，結(jié)合標準品匹配，定性結(jié)果較為準確，但是其測定的靈敏度比較低。使用上述儀器方法測定水中的硫丹，通常使用液液萃取(LLE)[8]、固相萃取(SPE)[9]等前處理方法對水樣進行濃縮。LLE 需要消耗大量有機溶劑，對環(huán)境和試驗人員具有潛在傷害；SPE 需經(jīng)柱活化、萃取、洗脫、濃縮等步驟，成本高且耗時較長。近幾年，分散液液微萃取(DLLME)[10]、Qu ECh ERS法[11]以及直接浸入式固相微萃取(DI-SPME)[12]等新型前處理方法也被應(yīng)用于水樣中硫丹的測定。DLLME和Qu ECh ERS法操作復(fù)雜，對試驗人員的要求較高；DI-SPME在萃取過程中會受到溶液中的不揮發(fā)性高分子物質(zhì)或者腐殖質(zhì)、蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)污染，從而損耗萃取纖維，大大縮短了萃取纖維的使用壽命。

頂空固相微萃取(HS-SPME)將沸點相對較低的目標物蒸發(fā)至頂空相中，而將難揮發(fā)的雜質(zhì)保留在水相中，在實現(xiàn)了待測物富集的同時，還減少了其他雜質(zhì)的污染，既能保護萃取纖維，又能減少儀器污染、降低儀器的維護頻次[13]。文獻[14]優(yōu)化了頂空固相微萃取的條件，結(jié)合氣相色譜法(電子俘獲檢測器)測定水中有機氯農(nóng)藥的含量，取得了良好的結(jié)果，但電子俘獲檢測器容易造成假陽性結(jié)果，不宜在案件中使用。

綜上所述，測定魚塘水樣中的硫丹需解決3個問題:①優(yōu)化前處理方法以減少魚塘水基質(zhì)對測定的干擾；②提高前處理自動化程度，減少技術(shù)人員的工作時間和強度，同時減少有機溶劑的使用；③使用高靈敏度的測定方法以減少單次分析所需的魚塘水樣用量。針對上述問題，擬通過對HS-SPME和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)條件進行優(yōu)化，建立了魚塘水樣中硫丹(α-硫丹和β-硫丹)和硫丹硫酸酯的全自動在線分析方法，并應(yīng)用于魚塘投毒案件水樣中硫丹的測定。本方法單次測定僅需使用2.0 mL水樣，且整個分析流程幾乎全自動完成，降低了對操作人員的要求，節(jié)約了試驗成本，實現(xiàn)了批量化的在線分析，為魚塘水中毒物的定性、定量分析開辟了新的思路。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8050 NX 型氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；PAL RSI型全自動樣品處理及進樣系統(tǒng)，帶頂空萃取模塊；Milli-Q Direct型水純化系統(tǒng)；100μm 聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取纖維頭。

α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯標準儲備溶液:1.000 g·L－1，分別稱取10.00 mgα-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯標準品(純度不小于98%)，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，于－20 ℃保存。

α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯混合標準溶液:含20.0 mg·L－1α-硫丹、硫丹硫酸酯以及40.0 mg·L－1β-硫丹，分別移取1.000 g·L－1α-硫丹標準儲備溶液1.0 mL、1.000 g·L－1β-硫丹標準儲備溶液2.0 mL 及1.000 g·L－1硫丹硫酸酯標準儲備溶液1.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，于－20 ℃保存。使用時用水逐級稀釋至所需質(zhì)量濃度。

甲醇為色譜純；氯化鈉為分析純；試驗用水為一級水。

1.2 儀器工作條件

1)頂空固相微萃取條件 萃取溫度75 ℃；萃取前平衡時間10 min，萃取時間60 min；振蕩速率250 r·min－1；進樣針插入樣品瓶深度為22 mm，插入進樣口深度為54 mm；進樣口解析溫度260 ℃，解析時間2 min。

2)色譜條件 DB-5 ms毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為高純氦氣(純度為99.999%)，恒流模式，流量1.56 mL·min－1；進樣口溫度260℃；不分流進樣模式。柱升溫程序:初始溫度60 ℃，保持2 min；以10 ℃·min－1速率升溫至280 ℃，保持5 min。

3)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度200 ℃，接口溫度280 ℃；溶劑延遲時間2 min；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，掃描間隔0.1 s；碰撞氣為高純氬氣。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

移取2.0 mL魚塘水樣于20 mL 頂空瓶中，加入0.6 g氯化鈉，旋緊裝有聚四氟乙烯/聚硅氧烷蓋墊的螺紋蓋，放入樣品盤中。使用100μm PDMS萃取纖維頭，按儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按試驗方法對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的混合標準溶液進行測定，其總離子流色譜圖見圖1。

圖1 α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of mixed standard solution ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

2.2 頂空固相微萃取條件的選擇

2.2.1 萃取溫度

頂空固相微萃取包含兩個過程，即目標物從樣品基質(zhì)中揮發(fā)進入頂空氣相的過程，以及萃取纖維對目標物的吸附過程。一方面，升高萃取溫度可以增大擴散系數(shù)，加速目標物的揮發(fā)；另一方面，升高萃取溫度會導(dǎo)致分配系數(shù)降低，影響萃取纖維對目標物的吸附，降低萃取效率。試驗考察了萃取溫度依次為30，45，60，75，90℃時對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 萃取溫度對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

由圖2可知:萃取溫度為30～75 ℃時，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積均隨萃取溫度升高而增大；萃取溫度為75～90 ℃時，α-硫丹和β-硫丹的峰面積均隨萃取溫度升高而減小，硫丹硫酸酯的峰面積隨萃取溫度升高而繼續(xù)增大。試驗選擇萃取溫度為75 ℃。

2.2.2 萃取時間

頂空固相微萃取作為一種平衡萃取技術(shù)，萃取時目標物在樣品基質(zhì)、頂空氣體以及纖維涂層這三相中轉(zhuǎn)移直至平衡。若萃取時間過短，吸附尚未達到平衡狀態(tài)，無法保證方法的靈敏度和精確度，達到平衡狀態(tài)之后繼續(xù)萃取只會增加該方法的時間成本，對于提高方法的靈敏度和精確度無意義。試驗考察了萃取時間依次為30，45，60，75，90 min時對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知:隨著萃取時間的延長，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積逐漸增大；萃取時間為60 min時，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯在纖維涂層中的吸附均達到平衡。試驗選擇萃取時間為60 min。

圖3 萃取時間對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

2.2.3 氯化鈉加入量

在使用頂空固相微萃取過程中常加入大量的鹽來增加溶液的離子強度，使目標物在水溶液中的溶解度下降，分配系數(shù)增大，改善方法靈敏度[15]。試驗選擇最常用的鹽氯化鈉作為離子強度調(diào)節(jié)劑，考察了水樣中不加氯化鈉和加入過量氯化鈉(加入量為0.3 kg·L－1)，即離子強度對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 離子強度對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響Fig.4 Effect of ionic strength on extraction efficiency ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

由圖4可知:加入過量氯化鈉(0.3 kg·L－1)時，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積增加了0.69～4.87倍。這是由于加入過量氯化鈉使樣品達到飽和狀態(tài)后，可將樣品間離子強度的差異降至最低。試驗在水樣中添加過量氯化鈉進行萃取，選擇氯化鈉加入量為0.3 kg·L－1。

2.2.4 樣品體積

在萃取溫度不變的情況下，增大樣品體積，頂空固相微萃取的萃取相中樣品絕對量相應(yīng)增加，因此增大樣品體積可以提高測定方法的靈敏度。試驗在保證萃取纖維不接觸水相的前提下，考察了樣品體積依次為0.5，1.0，2.0 mL 時對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知:隨著樣品體積的增大，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積逐漸增大；樣品體積為2.0 mL時，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰面積最大。試驗結(jié)果表明:樣品體積大于2.0 mL 時，頂空固相微萃取過程的劇烈振蕩會導(dǎo)致萃取頭接觸到液體樣品，從而減小了萃取頭的使用壽命；樣品體積為2.0 mL 時，萃取效果最好。試驗選擇樣品體積為2.0 mL。

2.3 標準曲線、檢出限和測定下限

按試驗方法對含0.05，0.5，5.0，10，25，50，100μg·L－1α-硫丹、硫丹硫酸酯和0.1，1.0，10，20，5 0，100，200μg·L－1β-硫丹的混合標準溶液系列進行測定，以α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

圖5 樣品體積對α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯萃取效果的影響Fig.5 Effect of sample volume on extraction efficiency ofα-endosulfan，β-endosulfan，and endosulfan sulfate

以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結(jié)果見表2。

表2 線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收試驗

按試驗方法對空白水樣分別進行3個濃度水平的加標回收試驗，每個濃度水平平行測定6個樣品，連續(xù)測定3 d，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

由表3可知:回收率為83.6%～117%，日內(nèi)RSD 為2.2%～18%，日間RSD 為4.2%～18%。樣品在加熱模塊中升溫并不斷振蕩進行萃取時，樣品瓶壁可能會吸附部分目標物，尤其是當基質(zhì)中目標物含量較低時，瓶壁的吸附作用會對測定值的RSD 產(chǎn)生較大影響。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

在空白水樣中分別設(shè)置α-硫丹、硫丹硫酸酯的加標質(zhì)量濃度為10μg·L－1，β-硫丹的加標質(zhì)量濃度為20μg·L－1，使用同一萃取頭按試驗方法連續(xù)測定180個樣品，樣品中3個化合物峰面積的變化見圖6。1號樣品和180號樣品的色譜圖見圖7。

圖6 樣品中3個化合物峰面積的變化Fig.6 Variation of peak area of 3 compounds in the samples

圖7 1號樣品和180號樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of sample 1 and sample 180

由圖6、圖7可知:180號樣品中，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的峰形、峰面積以及信噪比未見明顯變化。這表明萃取頭的萃取效率以及儀器靈敏度未受影響，方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 案例應(yīng)用

2019年8月22日，我中心受理河北省盧龍縣送檢的投毒案件樣品，安某某報警稱其自家水庫里養(yǎng)的魚被人投藥，按試驗方法檢驗其送檢的8瓶水樣，均檢出α-硫丹和β-硫丹。2019年9月18日，我中心受理河南省魯山縣送檢的投毒案件樣品，許某某承包魚塘內(nèi)的魚大量死亡，懷疑是硫丹投毒所致，按試驗方法對送檢的魚塘水樣和魚鰓樣品進行分析，魚塘水中檢出α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯，同時將魚鰓的血水稀釋10 倍后進行分析，檢出了α-硫丹和β-硫丹。

頂空固相微萃取對魚塘水中的硫丹類化合物具有良好的萃取效果，結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行分析，檢出限低達0.001μg·L－1。本方法僅需2.0 mL魚塘水樣，無需使用有機溶劑，綠色環(huán)保，測定過程對儀器污染小，連續(xù)進樣180針，目標物的峰形、靈敏度未受明顯影響。萃取步驟為程序設(shè)定的全自動化操作，平行性好，且萃取模塊直接搭載在質(zhì)譜儀上方，樣品處理完畢后直接進樣測定，整個過程僅需1.5 h左右，實現(xiàn)了前處理分析一體化的功能，能夠滿足公安機關(guān)對魚塘投毒案件水樣中硫丹的測定需求。

除硫丹外，有機磷及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥也常見于魚塘投毒案件中，后續(xù)的方法研究可以進一步根據(jù)有機磷和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的性質(zhì)，篩選不同的萃取纖維涂層種類，優(yōu)化萃取條件，建立測定魚塘水中有機磷及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的頂空固相微萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，更加豐富該項技術(shù)在刑事技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用。