草魚腸系膜脂肪組織高質量總RNA提取方法的研究

姜 鵬，駱麗婷，李勝杰，樊佳佳，馬冬梅

(1.中國水產科學研究院 珠江水產研究所，農業(yè)農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380；2.仲愷農業(yè)工程學院 動物科技學院，廣東 廣州 510225)

動物脂肪組織不僅是機體能量貯存庫，也是活躍的內分泌器官，其分泌的多種激素和細胞因子在機體代謝平衡、免疫應答等方面發(fā)揮重要作用[1-3]。在組織功能研究中，分子水平研究必不可少，其中RNA提取純化是常涉及的分子生物學試驗技術。然而，由于脂肪組織含有豐富油脂，RNA豐度低，導致高質量總RNA提取常常存在一定難度，影響到下游試驗的高效開展。

目前，RNA提取廣泛采用經典的酸性酚—異硫氰酸胍—氯仿一步提取法[4]。該方法具有操作便捷，無需復雜設備等優(yōu)點，并配備有成熟的TRIzol等即用型商品化試劑[5-7]。因此，針對脂肪組織RNA含量低、難提取等問題，大多數學者選擇在一步法基礎上進行優(yōu)化改良[8]。如吳江維等[9]發(fā)現，以豬脂肪組織為材料，增加樣品量，延長靜置裂解時間，去除油脂層污染等操作，可改善RNA提取質量。采用類似優(yōu)化步驟，在肉牛、綿羊等動物脂肪組織也獲得了較高質量的RNA樣品[10-11]。

草魚(Ctenopharyngodonidella)是中國養(yǎng)殖產量較高的淡水經濟魚類，養(yǎng)殖過程中通常出現體脂過度沉積現象[12]。試驗發(fā)現，常規(guī)方法下，草魚脂肪組織RNA提取易發(fā)生降解，干擾到后續(xù)分子生物學試驗的有序推進。草魚脂肪組織主要蓄積在腹腔腸道周圍，與哺乳動物脂肪組織相比，質地構造存在明顯差異?，F有的優(yōu)化改良策略是否適用于草魚脂肪組織RNA提取，需進一步驗證及摸索。因此，筆者以草魚腸系膜脂肪組織為試驗對象，基于常規(guī)的TRIzol試劑一步法，擬通過對優(yōu)化操作步驟的比較分析，建立一種高質量總RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗用草魚取自中國水產科學研究院珠江水產研究所生物技術養(yǎng)殖基地。從正常飼養(yǎng)的群體中隨機挑選健康個體，體質量為80～150 g。

1.2 試劑耗材與儀器

TRIzol試劑選用TaKaRa公司RNAiso Plus產品(Code No.9108)，DEPC水購自Beyotime公司，氯仿和異丙醇等試劑為國產分析純，PRO 200型精密勻漿器(配置?7 mm×105 mm不銹鋼平頭轉子)購自PRO Scientific公司(美國)，高速冷凍離心機5417R購自Eppendorf公司(德國)，TGem微量分光光度計(OSE-260)購自天根生化科技(北京)有限公司，Tanon-3500全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。離心管和移液槍頭等均使用RNase-free產品。

1.3 常規(guī)的RNA提取方法

草魚活體使用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽輕微麻醉，剪斷脊柱放血后解剖，快速剪取肝臟、脾臟、腸道(不含腸系膜脂肪)、腸系膜脂肪組織，對應樣品組編號為T1～T4(表1)。采用常規(guī)方法進行組織RNA提取，每組測試3～5尾魚，具體操作步驟如下：

表1 常規(guī)與優(yōu)化的總RNA提取方法比較Tab.1 Comparison between conventional and optimized total RNA extraction methods (n=3～5)

取8～15 mg新鮮組織樣品放入預冷的1.0 mL TRIzol試劑中，迅速均質勻漿約30 s，室溫靜置5 min；加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，小心吸取上層水相轉移至另一新離心管中；加入500 μL的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min后，4 ℃，12 000 r/min離心15 min；棄上清液，得到白色RNA沉淀物，加入1.3 mL DEPC水配制的75%體積分數乙醇溶液，翻轉洗脫，4 ℃，7500 r/min離心5 min；棄上清液，室溫干燥沉淀物約5 min，加入30～50 μL的DEPC處理水溶解RNA。質檢后，-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 優(yōu)化的RNA提取方法

根據預試驗結果，將草魚脂肪組織樣品量增加至約30 mg，每樣品TRIzol試劑量增至1.3 mL，并對常規(guī)RNA提取步驟進行優(yōu)化(表1)，具體優(yōu)化操作如下：

(1)優(yōu)化操作1：取新鮮樣品至TRIzol試劑中機械勻漿30 s后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，吸棄上層油脂約150 μL，重復操作1次，將大部分余液移至新管，其余步驟與常規(guī)方法相同，對應樣品組編號為T5。

(2)優(yōu)化操作2：取新鮮樣品至液氮急速冷凍，研缽內人工充分研磨，然后將粉末狀樣品加入TRIzol試劑中劇烈振蕩30 s裂解，吸棄油脂等步驟與優(yōu)化操作1相同，對應樣品組編號為T6。

(3)優(yōu)化操作3：與優(yōu)化操作1大體相同，只增加樣品機械勻漿時間至約3 min，對應樣品組編號為T7。

(4)優(yōu)化操作4：取新鮮樣品至液氮速凍，再轉移凍樣至TRIzol試劑中機械勻漿約3 min，其余步驟與優(yōu)化操作1相同，對應樣品組編號為T8。

以上每組(T5～T8)各取3～5尾魚測試。

1.5 RNA質量檢測

取2.0 μL RNA樣品，利用微量分光光度計檢測RNA樣品濃度與純度。配制1.5%非變性瓊脂糖凝膠，取1.0～2.0 μL適量RNA，140 V電泳15 min，紫外燈光下觀察RNA條帶情況，評估提取質量。

從提取質量較好的T8組中，隨機取3個樣品送金唯智生物科技有限公司進行高通量測序平臺質檢，主要包括使用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA濃度和質量，以及Agilent 2200 Tapestation系統(tǒng)評估RNA完整性。

2 結 果

2.1 常規(guī)方法提取草魚不同組織RNA的質量比較

采用常規(guī)方法提取的草魚不同組織RNA，質量檢測情況見表2。試驗發(fā)現，與肝臟、脾臟、腸道組織相比，草魚腸系膜脂肪組織總RNA的提取量偏少，表明草魚脂肪組織RNA含量較低。常規(guī)提取方法下，草魚肝臟、脾臟、腸道和腸系膜脂肪組織總RNA的D260/D280比值約為2.0，符合1.9～2.0的標準范圍，表明常規(guī)方法提取的不同組織核酸質量均較高。樣品的D260/D230比值略小于2.0，說明可能有微量胍鹽或有機溶劑等雜質殘留，試驗檢驗其對下游分子試驗影響輕微。

表2 分光光度計檢測的總RNA質量情況Tab.2 Quality of total RNA content measured by spectrophotometer (n=3～5)

樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。T1～T3組肝臟、脾臟、腸道組織樣品的總RNA在凝膠上顯示出清晰的28S和18S rRNA特征性條帶，T4組脂肪組織樣品則出現嚴重拖帶現象，28S rRNA條帶亮度也明顯弱于18S rRNA，說明常規(guī)方法下提取的草魚脂肪組織RNA存在降解現象。以上不同組織間的對比試驗表明，草魚腸系膜脂肪組織RNA不僅含量少，而且易發(fā)生降解。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNAM.DL2000 DNA分子量標準.M.DL2000 DNA marker.

2.2 不同優(yōu)化操作提取草魚脂肪組織RNA的比較

在優(yōu)化操作中，適當增加脂肪組織量(25～35 mg)，有助于RNA提取量提升，可滿足常規(guī)試驗用量需求(T6組RNA質量濃度略低，是因研缽里收集粉末狀樣品時有損耗)。針對草魚脂肪組織RNA頑固性降解難題，探索可行的優(yōu)化操作方法。分光光度計檢測顯示，4種優(yōu)化方法提取的草魚脂肪組織總RNA純度均保持了較高水平。進一步瓊脂糖凝膠電泳(圖1)后發(fā)現，T5組樣品經簡單去除油脂層操作并未有效改善RNA降解問題，而樣品前處理改用液氮速凍研磨方式，T6組樣品顯示RNA降解有所緩解，但仍有一定程度拖帶現象。當T7組樣品僅增加了樣品機械勻漿時間時，RNA降解問題得以顯著改善，尤其是將液氮速凍和增加樣品機械勻漿時間步驟一同使用，提取的T8組脂肪組織RNA展示出較高質量的電泳條帶特征。

試驗結果表明，在TRIzol試劑裂解過程中，增加樣品機械勻漿時間(約3 min)可顯著降低RNA降解程度，而且勻漿前樣品采用液氮速凍處理可減輕取樣操作可能帶來的降解問題。

2.3 草魚脂肪組織優(yōu)化提取RNA的質檢分析

為進一步明確優(yōu)化操作4提取的樣品質量，隨機挑選T8組3個樣品送測序公司進行質檢分析。檢測結果發(fā)現，3個樣品RNA純度較高，關鍵的RIN值為8.7～9.0(表3)，依據公司評級標準，3個樣品均為最佳的A級(A級標準：核酸質量≥2 μg，D260/D280≥2.0，RIN值≥7，28S/18S≥1.0，核酸質量濃度≥100 mg/L，體積≥10 μL，5S峰形正常等)，表明RNA完整性好，質量滿足高通量轉錄組建庫測序要求。此外，由Agilent 2200生物分析儀生成的凝膠圖像及電泳色譜峰圖(圖2)可見，3個RNA樣品的質量水平較高，其峰圖基線較平整，無明顯降解雜峰，28S與18S峰形正常。

表3 改良方法提取草魚腸系膜脂肪組織總RNA的質量情況Tab.3 Quality of total RNA extracted from mesenteric adipose tissues of grass carp C.idella by the improved method

圖2 Agilent 2200生物分析儀評估總RNA完整性Fig.2 Integrity assessment of total RNA by the Agilent 2200 bioanalyzera.采用優(yōu)化操作4提取的總RNA樣品膠樣圖;b～d.分別為T8-1、T8-2和T8-3樣品的電泳圖譜;M.電子化分子量標準;Lower.25 bp分子量.a.gel-like images of total RNA of the samples extracted by the optimized-4 method;b—d.electropherograms of T8-1,T8-2 and T8-3 samples,respectively;M.electronic ladder;Lower:25 bp ladder.

3 討 論

3.1 RNA提取方法及原理

自Chomczynski等[13]提出酸性酚—異硫氰酸胍—氯仿一步提取法，RNA提取才變得簡便易行。該方法操作流程主要包括：樣品均質與裂解，氯仿分離含RNA水相，異丙醇沉淀和乙醇洗滌。在提取過程中，想要獲得高質量RNA需要嚴格防范內源性和外源性RNA酶的破壞。RNA酶是一種專一水解RNA磷酸二酯鍵的蛋白酶，在環(huán)境中廣泛存在，而且可耐受高溫煮沸等嚴苛處理條件[14-15]。因此，為了避免外界環(huán)境中RNA酶的干擾，通常需要使用RNase-free耗材，維持清潔的試驗環(huán)境以及科學規(guī)范的操作。除此之外，為了有效抑制樣品組織細胞所包含的內源性RNA酶，則需要依賴裂解試劑中異硫氰酸胍等強效蛋白變性劑。

在本試驗中，草魚腸系膜脂肪組織RNA降解問題主要是源于常規(guī)提取方法未能有效阻止內源性RNA酶的水解作用。初步分析，RNA降解可能發(fā)生在取樣起始階段，也可能在組織裂解過程中，或是二者兼有。為此，在樣品取樣階段嘗試采用液氮速凍人工研磨方法，期望利用超低溫環(huán)境來抑制組織內RNA酶的活性，并盡可能縮短樣品空氣暴露時間。但多次實操發(fā)現，液氮速凍研磨操作對樣品RNA降解雖有一定緩解，但凝膠電泳仍顯示出不同程度拖帶現象，甚至時常出現嚴重降解個例，說明RNA降解在組織裂解過程中也有發(fā)生。這意味著TRIzol試劑中的異硫氰酸胍等成分未能高效抑制腸系膜脂肪組織中的RNA酶?？紤]到脂肪組織特異性因素，推測脂肪組織所包含的大量油脂很可能影響了蛋白變性劑發(fā)揮效能。

3.2 脂肪組織RNA提取方法的優(yōu)化

如何破除油脂影響，有學者利用液態(tài)油滴比重低的特點，采用簡單離心去除油脂層方法[16]；也有學者通過調整試劑配方來強化脂肪乳化劑分離油脂的效果[17]。以上方法在草魚腸系膜脂肪中驗證效果均不理想?；谏鲜鰧嶋H情況，擬嘗試在裂解過程中加入劇烈振蕩等物理手段。經反復摸索測試后發(fā)現，當樣品采用機械勻漿，并將勻漿時間由原有約30 s延長至約3 min時，RNA降解得以顯著改善，而且批量驗證效果也較為穩(wěn)定。據此推測，長時間機械勻漿所形成的持續(xù)剪切沖擊力或許有助于TRIzol試劑中的異硫氰酸胍等成分突破油滴阻礙而有效抑制內源性RNA酶。

需要特別說明的是，草魚腸系膜脂肪組織中實際包裹有難以分離的胰腺組織，這在石蠟切片和轉錄組測序(數據未展示)中得以證實。通常認為，動物的胰腺組織因富含RNA酶，RNA較難提取[18-19]，這也可能是造成草魚腸系膜脂肪組織RNA易發(fā)生降解的原因之一。有研究表明，小鼠胰腺組織樣品在液氮低溫環(huán)境中研磨處理，能有效避免RNA發(fā)生降解[20]。在本試驗中，或許是由于油脂的復合疊加作用，導致單純采用液氮研磨未能較好抑制富含RNA酶的草魚腸系膜脂肪組織。

4 結 論

筆者建立了一種草魚腸系膜脂肪組織高質量總RNA提取的方法，簡要地說，在常規(guī)方法基礎上，將取樣量增至約30 mg，有助于RNA產量提升以滿足常規(guī)試驗需求；樣品前處理建議采用液氮速凍方式，并直接將凍樣放入TRIzol試劑中機械勻漿，勻漿時間需延長至約3 min，可顯著降低RNA降解發(fā)生，同時保留離心去除油脂層等操作步驟。該改良方法所獲得的總RNA純度和完整性較高，可滿足轉錄組建庫測序等試驗要求。