不同類型Zn脅迫對1株好氧反硝化細菌功能影響的比較研究?

吳春晗, 白 潔，2, 趙陽國，2, 任朝萌, 陳 琳, 孫鵬飛, 李巋然

(1. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100； 2. 中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；3. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

重金屬是常見的一類污染物，進入水環(huán)境后大多會在水體底部聚集[1]。重金屬及其化合物在環(huán)境中難以自然降解，易在環(huán)境中累積，通過食物鏈傳遞最終威脅到人類健康[2]。含有重金屬污染物的工業(yè)廢水被大量排入海洋、湖泊等水環(huán)境中，導(dǎo)致水環(huán)境污染狀況日趨嚴重，對水生生物的生長發(fā)育產(chǎn)生不良影響[1-2]。

Zn是一種常見的重金屬，是生物體生長的一種必需元素，其含量過低或過高都會對生物的生長產(chǎn)生影響[3]。近年來我國近海海域的Zn污染在加劇，如對長江口附近海域的監(jiān)測表明：由于沿江工廠‘三廢’的直接排放，導(dǎo)致水體中受到多種重金屬不同程度的污染，其中Zn和Cu濃度最高[4]。海洋沉積物環(huán)境質(zhì)量對評價水環(huán)境重金屬污染程度具有指示作用[5],而數(shù)據(jù)顯示大連灣沉積物多種重金屬濃度都嚴重超標；2012年監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示渤海灣錦州區(qū)域的底泥中重金屬Zn超標高達150倍以上；膠州灣是受人類生產(chǎn)、生活影響較大的近岸海灣，污染情況較其它遠海海域嚴重[6]，2018年監(jiān)測數(shù)據(jù)表明膠州灣表層沉積物Zn濃度達到了104 mg·kg-1，遠遠高于紅海灣，較1980年增長了1.98倍，由此可見，近海海灣重金屬Zn的污染程度已不容忽視[7-9]。

普通ZnO、ZnO-NPs和ZnSO4這3種Zn化合物作為無機鋅添加劑被廣泛應(yīng)用于生物飼料中，由于殘留率較高、生物利用率較低，只有少部分鋅可以被生物體吸收，其余大部分都會以糞便形式排出體外，最終隨廢水流入近海環(huán)境，對沉積物中的微生物產(chǎn)生影響[10]。目前針對這3種鋅化合物對微生物的毒性研究多集中在單一鋅化合物對不同微生物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)及機制的探究，ZnO-NPs對微生物的毒性受濃度、粒徑、比表面積以及復(fù)合改性等多種因素的影響[11-12]，研究表明ZnO-NPs可顯著降低好氧反硝化細菌及典型厭氧反硝化菌的脫氮效率，促進胞外聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)的產(chǎn)生，抑制反硝化相關(guān)的酶活性，因ZnO-NPs比表面積大可與細菌產(chǎn)生作用，從而造成的微生物表面物理損傷被認為是其主要作用機制[13-15]；ZnSO4毒性效應(yīng)主要是其溶解后釋放游離態(tài)的鋅離子，鋅離子能夠破壞細菌的細胞膜，通過與細胞膜主要成分蛋白質(zhì)上的基團發(fā)生反應(yīng)，進入細胞內(nèi)部，使細菌的電子傳遞系統(tǒng)的相關(guān)酶遭到破壞，從而影響菌體結(jié)構(gòu)和生理活性，最終導(dǎo)致細菌死亡。菌膜破裂后鋅離子還可以繼續(xù)毒害其余細胞，循環(huán)往復(fù)的對細菌產(chǎn)生毒性[16]。Gui等人發(fā)現(xiàn)濃度高于20 mg·L-1的鋅離子可使好氧反硝化菌株P(guān)seudomonasstutzeriPCN-1好氧反硝化活性顯著下降，導(dǎo)致反硝化相關(guān)的nosZ基因和cnoB基因表達延時[17]。也有研究結(jié)果表明，濃度低于10 mg·L-1的鋅離子對微生物厭氧氨氧化過程有一定的促進作用[18]；普通ZnO的抑菌作用主要是由于其對細菌的親和力較強，可通過抑制細菌纖維蛋白形成而減弱其繁殖能力[19]。然而，各無機鋅化合物對同一種微生物作用差異的比較卻少有研究。

高濃度的重金屬Zn會對底泥微生物產(chǎn)生毒害作用，重金屬Zn主要會與微生物酶的活性及非活性中心相結(jié)合，從而抑制其活性，導(dǎo)致微生物功能下降[20]，進而對近海沉積物環(huán)境中的物質(zhì)循環(huán)產(chǎn)生影響。微生物是生態(tài)系統(tǒng)最基本的一環(huán)，對維持近海生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定有重要意義。結(jié)構(gòu)簡單的細菌是良好的染毒實驗?zāi)Ｊ缴颷21]，好氧反硝化細菌更是在海洋氮素循環(huán)中發(fā)揮著不可替代的作用[22]，其數(shù)量占沉積物細菌總量的20%[23]。

本文以1株篩自膠州灣沉積物中的好氧反硝化細菌為研究對象，通過實驗室模擬實驗，比較研究了分別在3種不同類型含Zn化合物脅迫下該菌株生長及脫氮能力的變化。研究結(jié)果可為探討不同類型含Zn化合物對好氧反硝化菌生長和脫氮功能的影響及作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

培養(yǎng)基組成(g·L-1)[24]：KH2PO41.5；Na2HPO47.9；丁二酸鈉 6.79；MgSO4·7H2O 0.01；NH4Cl 0.268 6；NaNO30.426 8；NaCl 35；2 mL微量元素溶液；1 000 mL去離子水。

微量元素溶液包含(g·L-1)：Na2EDTA 63.70；ZnSO42.2；CaCl25.5；MnCl2·4H2O 5.06；CuSO4·5H2O 1.57；FeSO4·7H2O 5.0； CoCl2·6H2O 1.61； Na2MoO4·4H2O 1.1。

1.2 不同類型鋅脅迫實驗

本研究選用普通ZnO、ZnO-NPs和ZnSO43種類型鋅進行實驗，根據(jù)預(yù)實驗菌株的效應(yīng)濃度結(jié)果，每一種設(shè)置5個濃度，分別為0、5、20、50和200 mg·L-1。每個濃度設(shè)置3個脅迫實驗平行樣，其中0 mg·L-1為空白對照，5 mg·L-1為低濃度組，20和50 mg·L-1為中濃度組，200 mg·L-1為高濃度組。

1.3 測定方法

去除率=(1-取樣時被測指標質(zhì)量濃度/被測指標初始質(zhì)量濃度)×100%。

為了減少耐藥菌的產(chǎn)生，并保持ZITHROMAX和其他抗菌藥的有效性，ZITHROMAX應(yīng)僅用于治療經(jīng)證實或高度懷疑由敏感菌引起的感染。當培養(yǎng)并獲得敏感性資料時，應(yīng)考慮選擇或調(diào)整抗菌治療。在缺乏這些數(shù)據(jù)的情況下，當?shù)亓餍胁W(xué)和敏感性模式可能有助于治療的經(jīng)驗性選擇。

實驗所用的納米氧化鋅(ZnO-NPs)購自美國SIGMA公司，粒徑<50 nm，純度>99.7%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值±標準偏差表示，采用SPSS Statistics軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，顯著水平P<0.05，繪圖采用 Origin軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型鋅對菌株生長的影響

2.1.1不同濃度ZnO-NPs對菌株生長的影響 為避免光催化效應(yīng)引起的抑菌效應(yīng)，本研究在避光條件下將菌株暴露于不同濃度的ZnO-NPs，測定細菌生長量(見圖1)。

圖1 不同濃度ZnO-NPs對菌株生長的影響

低、中濃度ZnO-NPs脅迫組與對照組生長趨勢基本一致，在暴露8 h后，OD600都達到了1.2左右，并無顯著差異(P>0.05)；低濃度ZnO-NPs脅迫組對菌株生長還有輕微的促進作用，在16 h時達到OD600的極大值1.37，高于對照組；高濃度ZnO-NPs脅迫組在暴露過程中菌株生長速率始終低于其余各濃度組，在8 h時，菌株OD600值僅為0.978，較其他各濃度組生長速率稍慢；20 mg·L-1脅迫組極大值為1.4，50 mg·L-1脅迫組極大值為1.33，而200 mg·L-1脅迫組OD600的極大值也低于其他各濃度組，僅為1.2；高濃度ZnO-NPs脅迫組的生長平臺期較短，僅在12～14 h之間，隨后很快就進入了衰亡期，其余各濃度組的平臺期都維持在6～8 h，這可能是由于ZnO-NPs造成菌株表面損傷使細胞死亡數(shù)目增多，而OD600值僅反映培養(yǎng)液的濁度，并不代表活細菌數(shù)目。死亡的細菌經(jīng)過一段時間后裂解，造成OD600值快速下降，從而使高濃度脅迫組的平臺期較短。Brayner等的研究也發(fā)現(xiàn)ZnO-NPs通過與大腸桿菌表面作用，會使大腸桿菌細胞壁解體，進而造成細胞裂解死亡[13]。由此可見，隨濃度升高，ZnO-NPs對菌株的生長呈現(xiàn)出一定的抑制趨勢。

2.1.2 不同濃度普通ZnO對菌株生長的影響 不同濃度的普通ZnO對菌株的生長并無顯著影響(P>0.05)(見圖2)，當ZnO脅迫組濃度低于20 mg·L-1時，菌株的生長趨勢與對照組基本一致；當ZnO脅迫組濃度為50 和200 mg·L-1時，在暴露4 h后的生長速率相比于其他各濃度組較低，在8 h差異最為明顯，對照組、5和20 mg·L-1ZnO脅迫組的OD600值分別為1.13、1.22、1.19；50和200 mg·L-1脅迫組的OD600值分別為0.89、0.91，但在暴露16 h后有所恢復(fù)，逐漸與其他各濃度組趨于一致。由此可見濃度低于20 mg·L-1的普通ZnO對菌株生長并無顯著影響(P>0.05)，當濃度升至50 mg·L-1以上時，會使處于對數(shù)生長期的菌株生長速率變慢，平臺期抑制作用減弱生長速率恢復(fù)。

圖2 不同濃度ZnO對菌株生長的影響

2.1.3 不同濃度ZnSO4對菌株生長的影響 Zn2+作為菌株生長必須的微量元素，其濃度過高或低都會對菌株產(chǎn)生一定的影響(見圖3)。在暴露前4 h各ZnSO4脅迫組與對照組菌體的生長量及生長速率幾乎相同，但在6 h時開始出現(xiàn)差異，50和200 mg·L-1脅迫組生長速率較對照組稍慢，隨暴露時間延長，50 mg·L-1ZnSO4脅迫組菌株生長量速率逐漸恢復(fù)，與對照組無顯著差異(P>0.05)，但200 mg·L-1ZnSO4脅迫組的生長速率始終低于其他各組；對照組OD600極大值達到1.57，但200 mg·L-1ZnSO4脅迫組OD600最高僅為1.35，5 mg·L-1ZnSO4脅迫組在暴露整個過程中生長速率始終高于對照組，對菌株生長表現(xiàn)出一定的促進作用。由此可見，不同濃度ZnSO4對菌株Zobellellasp.B307影響不同，低于5 mg·L-1濃度的ZnSO4可一定程度提高菌株生長速率，20和50 mg·L-1ZnSO4脅迫組對菌株生長并無顯著影響(P>0.05)，200 mg·L-1ZnSO4脅迫組在整個暴露過程中減慢了菌株的生長速率，暴露14 h后抑制作用逐漸減弱，這可能是由于隨時間延長，菌株對Zn2+產(chǎn)生了適應(yīng)能力，導(dǎo)致其毒性降低[26]。楊旸等的研究也指出，ZnSO4可抑制變異鏈球菌的生長，但對其并不產(chǎn)生殺滅作用[27]。

圖3 不同濃度ZnSO4對菌株生長的影響

2.2 不同類型鋅對菌株硝態(tài)氮去除率的影響

2.2.1 不同濃度ZnO-NPs對菌株硝態(tài)氮去除率的影響 不同濃度ZnO-NPs對菌株硝態(tài)氮去除率的影響如圖4所示。在避光條件下，低濃度的ZnO-NPs脅迫組一定程度提高了菌株硝態(tài)氮去除率，在16 h時5 mg·L-1脅迫組去除率達到了98.26%，對照組此時為94.94%，這可能是由于低濃度ZnO-NPs促進菌株生長，使細菌密度提高，進而提高了硝態(tài)氮的去除效率；在暴露前8小時中濃度ZnO-NPs脅迫組硝態(tài)氮的去除效率始終低于對照組，8 h時對照組去除率為89.2%，20和50 mg·L-1的ZnO-NPs脅迫組的去除率分別為60.96%和64.88%，較對照組分別降低了31.7%和27.3%，暴露10 h后恢復(fù)至與對照組無顯著差異(P>0.05)，達到90%左右；高濃度ZnO-NPs脅迫組對菌株硝態(tài)氮的去除有顯著抑制作用(P<0.05)，且抑制作用在整個暴露過程中持續(xù)存在，在暴露24 h時，對照組去除率為95.21%，200 mg·L-1的ZnO-NPs脅迫組的去除率僅為53.11%，較對照組下降了44.2%，這可能是由于ZnO-NPs的比表面積大，吸附作用強，極易吸附反硝化酶中心的Fe、Cu等金屬離子，從而降低其酶活性，抑制硝態(tài)氮的去除[28]。

圖4 不同濃度ZnO-NPs對菌株硝態(tài)氮去除率的影響

2.2.2 不同濃度普通ZnO對菌株硝態(tài)氮去除率的影響 不同濃度的普通ZnO對菌株硝態(tài)氮去除能力有不同程度的輕微的抑制作用，但并沒有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。普通ZnO濃度為20 mg·L-1以下時，硝態(tài)氮去除率與對照組并無顯著差異(P>0.05)，在暴露10 h時，體系中90%左右的硝態(tài)氮均已被去除；當濃度上升至50 mg·L-1時，硝態(tài)氮的去除在暴露10 h后開始出現(xiàn)停滯期，50 mg·L-1的普通ZnO脅迫組在10～14 h硝態(tài)氮去除的極其緩慢，200 mg·L-1脅迫組在12～14 h也出現(xiàn)了短暫的停滯，但在暴露16 h時，去除能力又恢復(fù)至與對照組無顯著差異(P>0.05)，去除率都達到了95%以上(見圖5)。由此可見，普通ZnO在濃度為50 mg·L-1及以上時，會使菌株硝態(tài)氮的去除產(chǎn)生短暫的延遲期，但可在短時間內(nèi)恢復(fù)。

圖5 不同濃度ZnO對菌株硝態(tài)氮去除率的影響

圖6 不同濃度ZnSO4對菌株硝態(tài)氮去除率的影響

2.3 不同類型鋅對菌株亞硝態(tài)氮去除率的影響

2.3.1 不同濃度ZnO-NPs對菌株亞硝態(tài)氮去除率的影響 避光條件下ZnO-NPs對體系中亞硝態(tài)氮累積的影響有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，低濃度ZnO-NPs脅迫組變化趨勢與對照組基本一致，在6 h體系中亞硝態(tài)氮的累積量達到峰值，在8 h時基本被去除完全，未產(chǎn)生累積現(xiàn)象；中濃度ZnO-NPs脅迫組的劑量效應(yīng)關(guān)系并不明顯，其較對照組亞硝態(tài)氮累積量的峰值出現(xiàn)時間延遲2 h，可能是由于ZnO-NPs在菌株對數(shù)生長期對菌株生長及硝態(tài)氮去除效率的抑制，導(dǎo)致硝態(tài)氮向亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化的過程有所延遲；高濃度ZnO-NPs脅迫組在整個暴露過程中對亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化和去除均有持續(xù)的抑制作用，對照組與其他各ZnO-NPs脅迫組體系中的亞硝態(tài)氮僅出現(xiàn)了短暫的累積現(xiàn)象(見圖7)。而200 mg·L-1的ZnO-NPs脅迫組在24 h時，體系中的亞硝態(tài)氮含量仍高達52.24 mg·L-1，去除速率緩慢，并產(chǎn)生持續(xù)的累積現(xiàn)象，亞硝態(tài)氮具有一定的生物毒性，會使水生生物產(chǎn)生缺氧現(xiàn)象(見圖7)，甚至死亡，其累積會對近海生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生嚴重危害[30]。

2.3.2 不同濃度普通ZnO對菌株亞硝態(tài)氮去除率的影響 不同濃度的普通ZnO對菌株硝態(tài)氮去除能力有不同程度的輕微的抑制作用，但并沒有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。普通ZnO濃度為20 mg·L-1以下時，硝態(tài)氮去除率與對照組并無顯著差異(P>0.05)，在暴露10 h時，體系中90%左右的硝態(tài)氮均已被去除；當濃度上升至50 mg·L-1時，硝態(tài)氮的去除在暴露10 h后開始出現(xiàn)停滯期，50 mg·L-1的普通ZnO脅迫組在10～14 h硝態(tài)氮去除的極其緩慢，200 mg·L-1脅迫組在12～14 h也出現(xiàn)了短暫的停滯，但在暴露16 h時，去除能力又恢復(fù)至與對照組無顯著差異(P>0.05)，去除率都達到了95%以上(見圖8)。由此可見，普通ZnO在濃度為50 mg·L-1及以上時，會使菌株硝態(tài)氮的去除產(chǎn)生短暫的延遲期，但可在短時間內(nèi)恢復(fù)。

圖8 不同濃度ZnO對菌株亞硝態(tài)氮去除率的影響

圖9 不同濃度ZnSO4對菌株亞硝態(tài)氮去除率的影響

3 討論

很多研究表明，不同結(jié)構(gòu)的鋅對微生物生長的影響具有顯著差異[31-32]。段惺等比較了四針狀ZnO晶須、ZnO-NPs和普通ZnO的抗菌性能，結(jié)果顯示具有納米結(jié)構(gòu)且不易團聚比表面積更大的針狀ZnO晶須抑菌效果最強，其次是ZnO-NPs，普通ZnO最差[33]；普通ZnO對細菌也存在一定的抑制作用，但其抑菌效果遠遠低于ZnO-NPs，喻兵權(quán)等的研究結(jié)果指出，當普通ZnO和ZnO-NPs質(zhì)量分數(shù)均為5%時，ZnO-NPs可抑制97.9%的大腸桿菌和98.8%的金黃色葡萄球菌生長，而普通ZnO抑制率僅為52.9%和68.3%[31]；曲敏利等的研究結(jié)果也表明, ZnO-NPs的抑菌圈的半徑比普通ZnO的半徑要大2倍以上[32]；Dadook M等研究了12種固氮菌對ZnSO4的敏感性，發(fā)現(xiàn)50 ppm的ZnSO4會對固氮菌這類土壤中的有益細菌的生長產(chǎn)生顯著抑制[34]; 龍新憲等對東南景天根圈土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，1 000 mg·kg-1的ZnSO4處理后的土壤中可培養(yǎng)微生物量顯著降低，而普通ZnO處理后的微生物量卻沒有顯著變化[35]。本研究通過將一株好氧反硝化菌分別暴露于不同濃度的普通ZnO、ZnO-NPs和ZnSO4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度普通ZnO脅迫對好氧反硝菌株的生長幾乎沒有影響，濃度達到50 mg·L-1時，對使處于對數(shù)生長期的菌株生長速率變慢，平臺期生長速率逐漸恢復(fù)。有研究指出，ZnO的抑菌機制主要是通過降低纖維蛋白的合成，從而抑制細菌繁殖[19]，與本研究中普通ZnO主要對對數(shù)生長期的菌株產(chǎn)生抑制的結(jié)果相吻合。而ZnO-NPs不僅會對生長期菌株生長速率產(chǎn)生抑制，還會縮短菌株生長的平臺期，使菌株提前進入衰亡期，這可能與ZnO-NPs粒徑細小，比較面積大，會通過與菌體作用產(chǎn)生不可逆物理性損傷，或通過產(chǎn)生活性氧自由基，對細菌產(chǎn)生細胞毒性，從而對菌株有一定的殺滅作用有關(guān)[36-37]；低濃度ZnSO4對菌株生長有一定的促進作用，ZnSO4濃度為200 mg·L-1時會降低菌株生長速率，但在暴露14 h后有所恢復(fù)，表明菌株可能具有一定的鋅離子調(diào)控體系，隨暴露時間延長可對高濃度的鋅離子產(chǎn)生適應(yīng)性[38]，并且ZnSO4僅一定程度降低了菌株生長速率，并不會造成菌株平臺期縮短，提前進入衰亡期，可見ZnSO4毒性相比于對菌株可能有殺滅作用的ZnO-NPs較弱。

綜上所述，3種形態(tài)結(jié)構(gòu)鋅化合物對好氧反硝化菌株Zobellellasp. B307的抑制作用依次為ZnO-NPs> ZnSO4>普通ZnO。ZnO-NPs因表面效應(yīng)引起的細菌表面不可逆的損傷對細菌具有一定的殺滅作用，因此對菌株生長及脫氮功能的抑制作用最強，因會產(chǎn)生亞硝態(tài)氮的累積現(xiàn)象，對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的潛在危害也最大；ZnSO4通過釋放鋅離子，對菌株產(chǎn)生毒性，但由于菌株可能具有鋅離子調(diào)節(jié)系統(tǒng)，因而暴露后期對ZnSO4產(chǎn)生適應(yīng)性，使其抑制作用減弱；普通ZnO僅會抑制菌株繁殖，并無殺滅作用，因此對菌株抑制作用最弱。根據(jù)上述結(jié)果，在今后重金屬鋅相關(guān)材料的生產(chǎn)使用中需盡量減少ZnO-NPs的使用，尋求其替代品，以減少對近海氮素循環(huán)產(chǎn)生的潛在有害影響。

4 結(jié)論

(1)ZnO-NPs會導(dǎo)致菌株生長平臺期縮短，提前進入衰退期；ZnSO4對菌株生長速率有輕微抑制作用，但在暴露14 h后逐漸減弱；普通ZnO對處于對數(shù)生長期的菌有輕微抑制，但抑制效應(yīng)較前兩類鋅相比并不明顯。

(2)ZnO-NPs會導(dǎo)致菌株前期脫氮速率減慢，暴露12 h后的脫氮過程處于停滯狀態(tài)，體系出現(xiàn)亞硝態(tài)氮積累現(xiàn)象；ZnSO4對菌株前期脫氮功能有一定的抑制作用，但在后期有緩慢恢復(fù)的趨勢，體系并無亞硝態(tài)氮累積；普通ZnO對菌株脫氮功能的抑制作用并不顯著。

(3)3種形態(tài)結(jié)構(gòu)鋅對菌株Zobellellasp. B307的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為可產(chǎn)生菌體物理損傷的ZnO-NPs毒性最強，其次是通過鋅離子釋放產(chǎn)毒的ZnSO4，普通ZnO僅抑制對數(shù)生長期菌株的繁殖，毒性相對較弱。