益母草提取物對粉塵螨殺滅活性及機制研究

何萌萌，秦浩遠，余晚鳳，褚凌渺，馮 蕊，范冬青，李 磊，柴晶晶，陳 冰，孫恩濤*

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 檢驗學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

粉塵螨(

Dermatophagoides

farinae

)屬疥螨目(Sarcoptiformes)、麥?zhǔn)瞅?Pyroglyphidae)，是強烈的吸入性過敏原，其排泄物中所含的酶、蛻皮產(chǎn)生的皮屑、腺體分泌物或唾液、尸體分解時產(chǎn)生的可溶性蛋白等都具有強致敏性，可誘發(fā)哮喘、過敏性鼻炎、濕疹等多種過敏反應(yīng)性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，粉塵螨主要以人類或動物身上掉下來的皮屑為食，所以廣泛分布于人類的活動場所，尤其臥室居多，而減少環(huán)境中的塵螨數(shù)量或減少與塵螨的接觸時間，可以大大緩解過敏患者的癥狀，降低塵螨導(dǎo)致過敏性疾病的發(fā)病率。目前，殺螨劑主要用于防治植食性害螨，也可輔助用于室內(nèi)殺螨，是防控螨類的重要手段。有報道表明，部分化學(xué)殺螨劑因高毒高風(fēng)險被逐漸淘汰，致使生物殺螨劑越來越受到重視。全球已報道具有殺蟲活性的植物提取物超過1 005種，其中39種有殺螨活性，主要包括植物粗提物、生物堿類、黃酮類、檸檬素類和植物精油類等殺螨活性成分，且防效良好。我國中草藥數(shù)量眾多、種類豐富，從中篩選出高效、經(jīng)濟、對環(huán)境友好的天然殺螨活性成分已成為研究熱點之一。益母草(

Leonurus

japonicus

Houtt)又名坤草，為唇形科益母草屬1年或2年生草本植物，以其地上部分的干燥全草入藥，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、清熱解毒之功效，臨床多用于婦產(chǎn)科疾病的治療且效果顯著。在益母草相關(guān)研究中，徐心植等研究報道了提取分離自益母草的水蘇堿和益母草堿對柑桔全爪螨有觸殺活性，且王睿研究發(fā)現(xiàn)各益母草殺螨活性物質(zhì)提取溶劑中水的提取率最高，但益母草提取物對粉塵螨的生物活性及解毒代謝酶系的影響尚未見報道。研究以水為提取溶劑，進行室內(nèi)生物測定，對益母草提取物的殺螨活性及作用機制進行初步探究，旨在為粉塵螨的防治及新型植物源殺螨劑的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

益母草干粉購自陜西康泰生物有限公司，密封避光保存。粉塵螨成螨源自實驗室純培養(yǎng)，于23.5±1 ℃、RH75%±10%的人工培養(yǎng)箱內(nèi)保存。乙酰膽堿酯酶(AChE)活性檢測試劑盒和還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒購自Solarbio公司；單胺氧化酶(MAO)試劑盒、CaMg-ATP酶活性測定試劑盒、多功能氧化酶(MFO)試劑盒、羧酸酯酶(CarE)活性測定試劑盒均購自蘇州科銘生物；BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自上海生工。

1.2 方法

(1)藥液配置。參考高岐等利用微波加熱技術(shù)，稱取不同質(zhì)量的益母草干粉(1 g、1.5 g、2 g、2.5 g)，以去離子水為提取溶劑配置成100 mL的溶液，微波提取時間為8 min、功率為616 W，對益母草中總生物堿進行微波提取，得到濃度分別為0.01 gDW/mL，0.015 gDW/mL，0.02 gDW/mL，0.025 gDW/mL(1 gDW/mL為1 mL水溶液中含有1 g干植物的提取物)的提取液。

(2)觸殺活性測定。改良自FAO推薦的玻片浸漬法，用雙面膠紙將活動正常、大小一致的粉塵螨成螨背部向下粘于載玻片的一端，每玻片30頭，在各組不同濃度藥液中浸8 s后取出，用吸水紙吸去蟲體上的浮藥，放入裝有濕棉花的透明盒中再放入恒溫培養(yǎng)箱(溫度23.5 ℃，RH 70%～80%)。分別于24 h、48 h、72 h觀察其死亡情況，用毛筆尖輕觸螨體，肢體不動者判斷為死亡。用清水做空白對照，每一濃度重復(fù)3次，記錄實驗數(shù)據(jù)。

(3)熏蒸活性測定。參考FAO的方法，將粘有30頭粉塵螨成螨的玻片膠紙面朝下，斜插放入容量為1 000 mL、裝有等量不同濃度藥液的廣口試劑瓶中，注意螨體不與藥液接觸，迅速蓋上瓶蓋密封。將廣口瓶置于23.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，全黑暗條件下進行熏蒸。每一濃度3次重復(fù)，并設(shè)空白對照，分別觀察24 h、48 h、72 h的死亡情況，記錄實驗數(shù)據(jù)。

(4)酶活性測定。從培養(yǎng)基中挑取1 000只粉塵螨成螨于1.5 mL滅菌EP管中，用以上測得殺螨活性最高濃度的益母草提取物藥液分別處理不同時間(0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)，去除螨體組織殘留藥液后用液氮充分研磨，-80 ℃保存?zhèn)溆?。乙酰膽堿酯酶(AChE)、CaMg-ATP酶、單胺氧化酶(MAO)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、多功能氧化酶(MFO)和蛋白酶的活性測定分別參照各自的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。以清水代替藥液,其余條件相同,設(shè)置對照組，處理組與對照組均重復(fù)3次，統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)。

(5)統(tǒng)計分析。用Abbott公式對死亡率進行校正：

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0處理，采用Duncan氏新復(fù)極差顯著性測驗(Duncan's Multiple-Range Test)。

2 結(jié)果與分析

2.1 益母草提取物對粉塵螨的觸殺活性

浸漬法測試益母草提取物對粉塵螨的殺滅活性如表1所示。由表1可知，益母草提取物對粉塵螨有良好的觸殺活性，且觸殺活性隨處理濃度的升高而增強。在供試濃度為0.01 gDW/mL時，24 h校正死亡率為26.80%；而當(dāng)供試濃度為0.025 gDW/mL時，24 h校正死亡率為96.10%，與其他處理有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)益母草提取物濃度相同時，隨著處理時間的延長，其觸殺活性也增強。

表1 浸漬法測試益母草提取物對粉塵螨的殺滅活性

2.2 益母草提取物對粉塵螨的熏蒸活性

通過熏蒸試驗發(fā)現(xiàn)，益母草提取物對粉塵螨的熏蒸活性較低，不同濃度藥液處理24 h、48 h校正死亡率均低于50%，且差異不顯著(P>0.05)。在供試濃度為0.02 gDW/mL時，24 h的校正死亡率僅為5.89%，而72 h校正死亡率為39.25%(P<0.05)?？芍S著作用時間的延長，其校正死亡率有所升高，熏蒸作用殺螨效果與作用時間呈正相關(guān)，熏蒸法測試益母草提取物對粉塵螨的殺滅活性如表2所示。

表2 熏蒸法測試益母草提取物對粉塵螨的殺滅活性

2.3 益母草提取物對粉塵螨體內(nèi)酶活性的影響

(1)對乙酰膽堿酯酶(AChE)活性的影響。益母草提取物對粉塵螨AChE活性的影響如圖1所示。由圖1可知，益母草提取物處理粉塵螨后，處理組與對照組AChE活性變化趨勢相似，兩組活性變化趨勢均為4 h內(nèi)上升，4～8 h降低，8～16 h活性持續(xù)升高。處理組AChE活性于16 h最高，比活力為0.456 OD·min·mL；16 h前處理組活性高于對照組,16～24 h處理組與對照組活性均降低，且處理組活性低于對照組，說明AChE被先激活后抑制。

(2)對CaMg-ATP酶活性的影響。益母草提取物對粉塵螨CaMg-ATP酶活性的影響如圖2所示。由圖2可知，CaMg-ATP酶活性總體呈先上升后下降的變化趨勢。20 h內(nèi)活性上升且處理組高于對照組；20～24 h內(nèi)處理組活性顯著降低，而對照組活性下降不明顯，表明對CaMg-ATP酶活性的影響為先激活后抑制。

圖1 益母草提取物對粉塵螨AChE活性的影響 圖2 益母草提取物對粉塵螨Ca2+Mg2+-ATP酶活性的影響注：不同小寫字母表示不同時間下對照組蟲體內(nèi)酶活性差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同時間下處理組蟲體內(nèi)酶活性差異顯著(P<0.05)。下圖同。

(3)對單胺氧化酶(MAO)活性的影響。益母草提取物對粉塵螨MAO活性影響如圖3所示。由圖3可知，處理組與對照組MAO活性在4 h內(nèi)上升，4～8 h活性下降，而后隨著作用時間的延長，MAO活性變化不顯著。MAO活性在24h內(nèi)處理組均高于對照組，說明益母草提取物可激活MAO。

(4)對羧酸酯酶(CarE)活性的影響。益母草提取物對粉塵螨CarE活性影響如圖4所示。由圖4可知，CarE活性在24 h內(nèi)呈下降趨勢。處理組與對照組活性變化較為相似，處理組活性在4 h內(nèi)迅速下降；4～20 h活性上下波動；20～24 h活性急速下降，處理24 h活性降至最低。除8 h處理組活性高于對照組外，其余時間處理組活性均低于對照組，可得益母草提取物對CarE有顯著的抑制作用。

圖3 益母草提取物對粉塵螨MAO活性的影響圖4 益母草提取物對粉塵螨CarE活性的影響

(5)對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性的影響。益母草提取物對粉塵螨GSTs活性的影響如圖5所示。由圖5可知，處理組GSTs活性均低于對照組，24 h內(nèi)活性變化趨勢均為下降。總體來看，處理組與對照組活性變化趨勢基本相同，整個過程中處理組GSTs活性均低于對照組，可得出益母草提取物使GSTs活性降低，對GSTs有抑制作用。

(6)對多功能氧化酶(MFO)活性的影響。益母草提取物對粉塵螨MFO活性的影響如圖6所示。由圖6可知，處理組與對照組MFO活性變化差異顯著。處理組MFO活性在4 h內(nèi)迅速上升，4 h MFO活性最高比活力為0.196 OD·min·mL；4～24 h MFO活性先急速降低后持續(xù)緩慢下降。8 h內(nèi)處理組MFO活性高于對照組，此后均低于對照組，說明益母草提取物對MFO活性影響表現(xiàn)為先激活后抑制。

圖5 益母草提取物對粉塵螨GSTs活性的影響圖6 益母草提取物對粉塵螨MFO活性的影響

圖7 益母草提取物對粉塵螨蛋白酶活性的影響

(7)對蛋白酶活性的影響。益母草提取物對粉塵螨蛋白酶活性的影響如圖7所示。由圖7可知，蛋白酶活性變化幅度不大，且處理組與對照組活性變化趨勢差異不明顯。8 h內(nèi)處理組蛋白酶活性高于對照組，即蛋白酶被激活；12～16 h內(nèi)處理組活性低于對照組，即酶活性被抑制；20～24 h內(nèi)活性上升，蛋白酶被再次激活，可知益母草提取物對蛋白酶活性影響較復(fù)雜，表現(xiàn)為先激活，后抑制，再激活的波動性。

3 討論

研究采用微波法以水為提取溶劑制備供試藥液，并同時采用玻片浸漬法和熏蒸法分別測定益母草提取物對粉塵螨的觸殺活性和熏蒸活性。在觸殺活性實驗結(jié)果中，0.025 gDW/mL的供試藥液24 h校正死亡率為96.10%，說明益母草提取物對粉塵螨有良好的觸殺活性。0.01 gDW/mL的益母草提取物處理24 h、48 h、72 h的校正死亡率分別為26.80%、29.41%、39.25%，而0.20 gDW/mL益母草提取物處理24 h、48 h、72 h的校正死亡率分別為39.87%、60.79%、76.29%。這與表皮穿透動力學(xué)中，穿透速度與所用藥劑的濃度成正比，并和穿透時間成指數(shù)關(guān)系的結(jié)論相同，可知濃度的升高或作用時間的延長，都可使校正死亡率升高，其觸殺活性也增強。

熏蒸活性測定結(jié)果表明，不同濃度藥液熏蒸處理24 h、48 h、72 h的校正死亡率均低于50%，益母草提取物對粉塵螨有熏蒸活性但較低。隨著處理時間的延長，校正死亡率逐漸升高，24 h、48 h、72 h后0.02 gDW/mL益母草提取物對粉塵螨的校正死亡率分別為5.89%、26.8%和39.25%。有研究表明，熏蒸活性隨時間延長而增強的結(jié)果類似，可能是由于活性物質(zhì)逐漸穿透螨體表皮層破壞其體壁結(jié)構(gòu)，抑制作用增強，致使粉塵螨正常生理生化代謝受阻。通過研究結(jié)果可初步推測，相較于熏蒸活性，益母草提取物對粉塵螨的觸殺活性更高。

研究已基本明確益母草提取物對粉塵螨有殺滅活性，但其殺螨作用機制尚不明確。由于殺螨機制的研究對殺螨劑的開發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要，因此通過測定益母草提取物作用不同時間后，粉塵螨體內(nèi)7種酶的活性對此進行探究。神經(jīng)毒素類殺螨劑是殺螨劑中最大的一類化合物，有研究表明大多數(shù)殺螨劑都是通過干擾神經(jīng)功能達到致死作用。乙酰膽堿酯酶(AChE)是神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶，也是神經(jīng)毒素類殺蟲劑的作用靶標(biāo)。研究表明，AChE先被益母草提取物激活后被其抑制，說明螨體內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)活動先被促進后被阻斷。益母草提取物對CaMg-ATP酶活性的影響為先激活后抑制，抑制作用可能致螨體細胞內(nèi)Ca“超載”，從而引起神經(jīng)傳遞的阻斷。單胺氧化酶(MAO)可催化一些神經(jīng)突觸的傳遞物質(zhì)神經(jīng)胺，同時是多數(shù)殺蟲劑的主要靶標(biāo)。研究中MAO被持續(xù)激活，刺激神經(jīng)傳導(dǎo)過度興奮，從而破壞神經(jīng)活動的正常進行。研究結(jié)果表明，益母草提取物作用于粉塵螨后，螨體內(nèi)AChE和CaMg-ATP酶都受到了一定程度的抑制，而MAO被激活，可能會引起神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂從而導(dǎo)致粉塵螨的死亡。

羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)是昆蟲體內(nèi)三大主要解毒代謝酶系，可防御來自外界的有毒物質(zhì)。CarE和MFO對內(nèi)、外源有毒物質(zhì)的解毒代謝及殺蟲劑的抗性形成起重要作用，而GSTs具有保護體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等作用。研究中，益母草提取物對以上三種酶均有抑制作用，推測其作用機制是解毒酶不能與提取物中的有毒物質(zhì)結(jié)合，使益母草提取物無法在到達作用位點前被阻隔或降解，從而導(dǎo)致螨體內(nèi)組織損傷進而導(dǎo)致死亡。蛋白酶是生物體內(nèi)的主要消化酶系，蛋白酶活性的升高或降低將直接影響生物體對蛋白質(zhì)的吸收和利用，其影響程度與試螨在外源有毒化合物作用下(尤其在死亡前)體內(nèi)發(fā)生的一系列生理生化反應(yīng)有關(guān)。研究中蛋白酶活性表現(xiàn)為波動性變化，推測益母草提取物能影響粉塵螨體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝活動。

研究結(jié)果初步表明益母草提取物對粉塵螨具有觸殺活性，熏蒸活性較弱；推測其作用機制與神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，也與解毒代謝活動關(guān)聯(lián)。對此筆者會繼續(xù)研究，為將益母草進一步開發(fā)為特異性高、對人畜安全、低毒且長期使用不易產(chǎn)生抗藥性的新型綠色環(huán)保殺螨劑提供理論基礎(chǔ)。