青海地區(qū)野生狐貍棘球絳蟲感染情況調(diào)查研究

朵紅,張學(xué)勇,馬怡雋,付永,沈秀英,郭志宏,更求久乃,馬國柱,王小紅,李劍,宋仁德,陳有錄,林芳明,王欣玥

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2.青海省稱多縣獸醫(yī)站，稱多 815100；3.青海省祁連縣獸醫(yī)站，祁連 810400;4.青海省貴南縣獸醫(yī)站，貴南 813100；5.青海省玉樹市獸醫(yī)站，玉樹 815000)

棘球蚴病(Echinococcosis) 又稱包蟲病(Hydatidosis)，由寄生在狐貍、犬和狼等終宿主的棘球絳蟲(Echinococcus)成蟲排出的蟲卵，污染環(huán)境，動物和人誤食后，蟲卵在體內(nèi)孵化成幼蟲引起的一種嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。棘球蚴病在世界范圍內(nèi)流行[1-3]，我國是發(fā)病率較高的國家之一，西北地區(qū)的廣大農(nóng)牧區(qū)是我國包蟲病的主要流行區(qū)，尤其是青藏高原。由于其特殊的生態(tài)環(huán)境和氣候條件，牛、羊等家畜是廣大牧民群眾賴以生存的基礎(chǔ)，同時，青藏高原也是野生動物繁衍生息的場所。棘球絳蟲在人、家畜、野生動物之間混合感染，形成特殊的生活史循環(huán)鏈。青藏高原不僅是世界上棘球蚴感染較高的地區(qū)，而且有些地區(qū)細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲混合感染[4,5]。

青海省分布著三種狐貍即赤狐、沙狐和藏狐[6,7]。在生態(tài)系統(tǒng)中它們與許多嚙齒類、兔形目等動物構(gòu)成了多房棘球絳蟲的循環(huán)鏈[8]；藏狐和高原鼠兔間構(gòu)成石渠棘球絳蟲的循環(huán)鏈[9]。在青海省的牧區(qū)，野生狐貍活動范圍與家畜的牧場重疊，野生狐貍排出的糞便污染草原環(huán)境，牛羊等草食動物采食被蟲卵污染的牧草、水源后，感染上棘球蚴病。隨著國家野生動物保護(hù)法的實(shí)施，野生狐貍數(shù)量增加，狐貍又是多房棘球絳蟲的主要重要終末宿主，為進(jìn)行棘球絳蟲野生宿主的防治，對野生狐貍棘球絳蟲感染調(diào)查顯得尤為重要。

為掌握青海省野生狐貍棘球絳蟲感染狀況，我們應(yīng)用棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒，對收集于青海省稱多縣、貴南縣、祁連縣的野生狐貍糞便進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品

于2018年4月至2020年4月，在青海省稱多縣收集狐貍糞便129份，祁連縣收集狐貍糞便84份，貴南縣收集狐貍糞便47份。

1.2 試劑盒和儀器

1.2.1試劑盒

棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，天禾生物技術(shù)研究院(珠海)有限公司生產(chǎn)，批號：110200402，生產(chǎn)日期：2020年4月2日。

1.2.2儀器

多功能酶標(biāo)儀(SYNERGY2,美國BioTek公司生產(chǎn))。

1.3 方法

1.3.1樣品處理

實(shí)驗前，需將糞樣置于-80℃凍存至少15d以上。取糞樣約1g放入盛有1mL樣品稀釋液的試管中，振蕩使糞樣混懸，3000rmp離心10min，取上清進(jìn)行檢測。如離心后不能吸取上清的糞樣，可增加1mL稀釋液重懸后再離心。

1.3.2夾心ELISA檢查法

取出試劑盒平衡至室溫，包被板孔中加入處理后樣品100uL。陽性對照、陰性對照各加1孔，臨界對照加3孔，留一孔不加樣品作為空白對照。置37℃ 6min。洗板機(jī)洗板3次，洗板結(jié)束將微孔板倒置在吸水紙上拍干。每孔加酶標(biāo)記物50uL，置37℃ 30min。洗板3次，每孔加顯色液A/B各50uL，震蕩混勻，置37℃ 避光30min。每孔加入終止液50uL(1滴)，混勻后用酶標(biāo)儀讀數(shù)。以空白孔調(diào)零，450nm波長測定OD置。

1.3.3結(jié)果判定

實(shí)驗成立條件是陰性對照OD值<臨界對照OD值平均值，臨界對照OD值平均值>0.15，陽性對照OD值>0.50，證明實(shí)驗成立，否則實(shí)驗結(jié)果無效，需重新實(shí)驗。結(jié)果判定,陰性：樣品OD值/臨界對照OD值平均值<1.0，陽性：樣品OD值/臨界對照OD值平均值≥1.0

2 結(jié)果

用于試驗的3個試劑盒陰性對照OD值分別為：0.196,0.107，0.066，臨界對照OD值平均值分別為：0.379，0.404，0.315，陰性對照OD值<臨界對照OD值平均值，臨界對照OD值平均值都>0.15，陽性對照OD值分別為：3.766，3.478，3.222，陽性對照OD值>0.50，試驗成立。

稱多縣收集的129份狐貍糞便，經(jīng)棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒檢測15份陽性，陽性率11.6%；祁連縣收集的84份狐貍糞便，經(jīng)棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒檢測3份陽性，陽性率3.6%；貴南縣收集的47份狐貍糞便，經(jīng)棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒檢測0份陽性，陽性率0。經(jīng)棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒檢測的共260份狐貍糞便中陽性18份，平均陽性率7.5%。

表1 棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒檢測結(jié)果

3 討論

糞抗原檢測法操作簡便、方便易行、敏感性高，是目前棘球蚴病防治效果考核的重要方法，已在實(shí)踐中應(yīng)用多年，但用該方法檢測野生動物糞便的報道較少。對收集于青海省3個地區(qū)的260份狐貍糞便，用棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒檢查出陽性糞便18份，陽性率7.5%，3個地區(qū)中稱多縣收集的狐貍糞便陽性率最高達(dá)11.6%，祁連縣收集的狐貍糞便陽性率較低為3.6%，貴南縣收集的狐貍糞便中沒有發(fā)現(xiàn)陽性。稱多縣收集的狐貍糞便陽性率大于其它2個地區(qū)。王虎等[10]1995—2005年在青海省青南高原區(qū)調(diào)查124只狐貍，27只感染棘球蚴，感染率21.8%，祁連山地和河湟谷地區(qū)調(diào)查24只狐貍，9只感染棘球絳蟲，感染率37.5%。我們于2011—2012年收集解剖青海省海晏縣、貴南縣、稱多縣、剛察縣36只狐貍，4只感染棘球絳蟲，感染率11.1%[11]。李清德等[12]對民和縣南大山林區(qū)收集的狐貍和狼的糞便用犬糞包蟲抗原檢測 ELISA試劑盒進(jìn)行了檢查，結(jié)果狐貍糞陽性率為27.5%。說明青海省野生狐貍上棘球絳蟲感染率較高，在棘球蚴防治中應(yīng)加強(qiáng)野生終末宿主的防治。

棘球絳蟲糞抗原檢測試劑盒的微孔板表面包被的是抗細(xì)粒棘球絳蟲單克隆抗體，可以與被檢樣品中的細(xì)粒棘球絳蟲抗原形成抗體—抗原復(fù)合物，加入抗細(xì)粒棘球絳蟲單克隆抗體酶標(biāo)記物，形成免疫復(fù)合物，加入顯色液后發(fā)生顏色反應(yīng)，顏色的強(qiáng)度與待測樣品中的棘球絳蟲抗原的含量成正比。該檢測方法應(yīng)用細(xì)粒棘球絳蟲單克隆抗體進(jìn)行檢測，對多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲也應(yīng)該有較高的檢出率。有報道顯示糞抗原檢測方法對2種棘球絳蟲(細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲)的鑒別準(zhǔn)確率為87%～95%[13]。由于青海省存在細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、石渠棘球絳蟲的感染，下一步，我們將對檢測結(jié)果為陽性的糞便進(jìn)行PCR檢查和LAMP檢測，以綜合評價糞抗原檢測試劑盒對青海省野生狐貍糞便棘球絳蟲感染的檢查效果。