瀕危植物瑤山苣苔的大小孢子發(fā)生和雌雄配子體發(fā)育研究

施慧嬡 陳發(fā)菊 梁宏偉 王玉兵

（三峽區(qū)域植物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室/三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，宜昌 443002）

瑤山苣苔（Dayaoshania cotinifolia）為苦苣苔科（Gesneriaceae）瑤山苣苔屬（Dayaoshania）多年生草本植物，僅分布于廣西大瑤山局部地區(qū)［1］，因其僅有一個分布點，個體數(shù)量稀少，分布面積狹窄，且受人類活動的影響而處于瀕危狀態(tài)。在1999 年國務(wù)院頒布的《國家重點保護(hù)植物名錄》（第一批）中被列為國家Ⅰ級保護(hù)植物；在2012 年原國家林業(yè)局頒布的《全國極小種群野生植物拯救保護(hù)實施方案（2010～2015）》中，瑤山苣苔被列為優(yōu)先拯救保護(hù)的極小種群植物；在2013 年原環(huán)境保護(hù)部和中國科學(xué)院發(fā)布的《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷》中被評估為極危種（CR）（http：//www.mee.gov.cn/gkml/hbb/bgg/201309/t20130912_260061.htm）。目前，瑤山苣苔的生物學(xué)研究主要集中于開花生物學(xué)［2］、形態(tài)解剖學(xué)［3］、種群生態(tài)學(xué)［4～6］、組織培養(yǎng)［7～8］和保護(hù)遺傳學(xué)［9］等方面，而與瑤山苣苔生殖生物學(xué)相關(guān)研究未見報導(dǎo)。本文利用常規(guī)石蠟切片法對瑤山苣苔的大小孢子和雌雄配子體發(fā)育進(jìn)行研究，探討其在該發(fā)育過程中是否存在致瀕環(huán)節(jié)，其結(jié)果也可為瑤山苣苔及苦苣苔科植物的生殖生物學(xué)研究積累基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

瑤山苣苔實驗材料于2009 年5 月至2010 年7月采自廣西壯族自治區(qū)金秀老山自然保護(hù)區(qū)。將不同發(fā)育時期的瑤山苣苔花芽和受精后的雌蕊材料于FAA 固定液（70%Ethyl alcohol 90ml：Acetic acid 5mL：Formalin 5mL）中固定24 h 后，帶回實驗室，分離出雌蕊和雄蕊并分別放入裝有70%酒精溶液的小瓶中，置于4℃冰箱備用。采用常規(guī)石蠟切片法［10］，Laica RM切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度8 μm；采用番紅—固綠（Safranin-Fast Green）對染法進(jìn)行染色，脫水透明封片；用Nikon 80i顯微鏡觀察與拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥壁的發(fā)育

瑤山苣苔一朵花中常具2枚雄蕊，雄蕊由花絲和花藥組成，花藥背著，每個花藥具4個花粉囊（見圖版Ⅰ：A）。早期花藥為四棱形的花藥原始體，花藥原始體中部的細(xì)胞發(fā)育成藥隔和維管束，隨著花藥原始體不斷發(fā)育，其四個角隅處表皮下出現(xiàn)細(xì)胞核大、細(xì)胞質(zhì)濃的孢原細(xì)胞。孢原細(xì)胞經(jīng)過平周分裂，向外形成初生周緣細(xì)胞，向內(nèi)產(chǎn)生初生造孢細(xì)胞。初生周緣細(xì)胞進(jìn)行平周和垂周分裂形成4～5 層細(xì)胞的花藥壁細(xì)胞；初生造孢細(xì)胞分裂形成次生造孢細(xì)胞，次生造孢細(xì)胞具有較大且明顯的核，細(xì)胞質(zhì)濃厚，染色較深，排列緊密整齊（見圖版Ⅰ：B）。隨著次生造孢細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育，花藥壁細(xì)胞出現(xiàn)分化，當(dāng)小孢子母細(xì)胞形成時，花藥壁由外到內(nèi)依次發(fā)育為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層（見圖版Ⅰ：C）。在小孢子形成雄配子體的過程中，表皮下藥室內(nèi)壁細(xì)胞體積增大，徑向延長，其細(xì)胞壁逐漸特化，發(fā)生帶狀纖維加厚，僅在相鄰兩個花粉囊連接處的細(xì)胞壁不加厚；在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時，中層細(xì)胞的儲藏物逐漸減少，并在小孢子形成過程中逐漸解體被吸收，直至消失；花藥壁最內(nèi)層細(xì)胞體積明顯增大，區(qū)別于其他花藥壁層。絨氈層細(xì)胞初期為單核，細(xì)胞核大，呈多邊形，細(xì)胞質(zhì)濃厚，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂之前，絨氈層細(xì)胞體積迅速擴(kuò)大，并伴隨液泡化。瑤山苣苔從5月份花芽分化開始細(xì)胞內(nèi)容物迅速增加，此時絨氈層細(xì)胞發(fā)達(dá)，細(xì)胞質(zhì)濃厚，排列整齊（見圖版Ⅰ：D）；在小孢子進(jìn)一步發(fā)育形成雄配子體的過程中，絨氈層不斷解體，為小孢子的發(fā)育提供充足的營養(yǎng)（見圖版Ⅰ：G），當(dāng)花粉粒成熟時，絨氈層消失（見圖版Ⅰ：H）。

2.2 小孢子發(fā)生及雄配子體形成

花發(fā)育到9月份，花藥壁內(nèi)的孢原細(xì)胞分化出初生造孢細(xì)胞，再經(jīng)過數(shù)次有絲分裂，產(chǎn)生次生造孢細(xì)胞。次生造孢細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，體積增大，細(xì)胞質(zhì)濃厚；到9月初次生造孢細(xì)胞發(fā)育成多面形的小孢子母細(xì)胞（即花粉母細(xì)胞）（見圖版Ⅰ：C）。隨即小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂期，經(jīng)第一次減數(shù)分裂形成兩個子核，隨即進(jìn)入第二次減數(shù)分裂形成四個子核，此過程是連續(xù)型胞質(zhì)分裂，而不伴隨細(xì)胞板的形成；隨后四分體小孢子逐漸形成自己的細(xì)胞壁，并包被在共同的胼胝質(zhì)壁中，呈品字形（見圖版Ⅰ：E）。剛釋放出來的小孢子細(xì)胞形狀不規(guī)則，伴隨小孢子體積縱向擴(kuò)展和細(xì)胞壁增厚，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核在細(xì)胞的一側(cè)，此時的小孢子細(xì)胞多呈腎形，長橢圓形，半球形（見圖版Ⅰ：F）。隨著小孢子體積的進(jìn)一步增大，小孢子細(xì)胞質(zhì)迅速液泡化形成大液泡，核大而胞質(zhì)少，這時絨氈層細(xì)胞已經(jīng)開始解體，把營養(yǎng)提供給小孢子以繼續(xù)發(fā)育成熟，隨著小孢子的發(fā)育，細(xì)胞質(zhì)增多，小孢子細(xì)胞核移到細(xì)胞的一側(cè)（見圖版Ⅰ：G），形成單核靠邊期小孢子。隨后小孢子細(xì)胞中的液泡逐漸變小直至消失，核分裂形成一個大的生殖核和一個小的營養(yǎng)核，隨后發(fā)生胞質(zhì)分裂，生殖核游離在營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)育形成成熟花粉粒即雄配子體（見圖版Ⅰ：H～I(xiàn)）。

雄配子體在同一花藥室內(nèi)發(fā)育時期基本同步，但同一花中不同花藥的發(fā)育不同步。同時可以觀察到瑤山苣苔花粉有極少部分?jǐn)∮F(xiàn)象，圓球形染色較深的為可育花粉；少量花粉皺縮，呈不規(guī)則的圓錐形或圓餅形，為敗育花粉。

2.3 胚珠的發(fā)生與結(jié)構(gòu)

瑤山苣苔的雌蕊由兩個心皮組成，從子房橫切面看，2 個心皮分別向近軸面（腹面）卷曲，與邊緣的遠(yuǎn)軸面（背面）相連，并向子房室中部內(nèi)伸，膨大分叉，內(nèi)伸胎座膜上具有角質(zhì)層，形成介于典型的側(cè)膜胎座與典型的中央胎座之間的中間類型，子房1 室，多胚珠（見圖版Ⅱ：A～B）。胚珠發(fā)生時在子房室特化的側(cè)膜胎座處表皮下產(chǎn)生一團(tuán)分生細(xì)胞即胚珠原基（見圖版Ⅱ：D）；在大孢子時期，胚珠原基基部兩側(cè)表皮下的細(xì)胞分裂，向上生長，包住珠心，成為具2～3層細(xì)胞的單層珠被，其頂端留有珠孔，大孢子母細(xì)胞只被一層珠心組織所包圍。珠被在發(fā)育過程中，圍繞胚囊合點端至2/3胚囊處產(chǎn)生珠被絨氈層，胚囊成熟時，珠被及珠被絨氈層將胚囊包圍。由于珠被和珠柄以及其他部分的不對稱生長，使胚珠的珠孔一端逐漸向下方彎曲，成熟時胚珠為倒生型、單珠被、薄珠心（見圖版Ⅱ：C）。

2.4 大孢子的發(fā)生發(fā)育及雌配子體的形成

胚珠發(fā)育初期，在靠近珠孔端表皮層下分化出細(xì)胞質(zhì)濃厚、細(xì)胞核顯著的大型細(xì)胞，即孢原細(xì)胞（見圖版Ⅱ：D）。孢原細(xì)胞分裂形成周緣細(xì)胞和造孢細(xì)胞，周緣細(xì)胞進(jìn)行平周和垂周分裂增加珠心組織，造孢細(xì)胞直接發(fā)育為大孢子母細(xì)胞，其細(xì)胞體積大，細(xì)胞質(zhì)濃厚，具顯著的細(xì)胞核，核仁明顯，與周圍珠心組織細(xì)胞有明顯差異，包被在薄地珠心組織中（見圖版Ⅱ：E）。隨著胚珠的發(fā)育，珠被發(fā)育完全，胚珠倒生，大孢子母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂，合點端的1 個大孢子細(xì)胞明顯增大，繼續(xù)發(fā)育成為功能大孢子，位于珠孔端的其余3個大孢子不發(fā)育，很快退化（見圖版Ⅱ：F）。功能大孢子沿珠孔—合點軸縱向伸長，體積增大并液泡化，形成單核胚囊（見圖版Ⅱ：G）。經(jīng)過1次有絲分裂，形成2個游離核，分別移到胚囊兩極，形成2核胚囊（見圖版Ⅱ：H），胚囊中出現(xiàn)多個液泡，2 核分別在珠孔端和合點端再分裂，形成4 核胚囊，隨后再分裂一次，形成8 核胚囊（見圖版Ⅱ：I～L）。8 個核位于共同的細(xì)胞質(zhì)中，珠孔端和合點端各有4 個核，隨后兩端各有1個核向胚囊中央移動，融合形成二倍體的中央細(xì)胞，位于胚囊中央（見圖版Ⅱ：J～K）。珠孔端的3個核分化形成1個卵細(xì)胞和2個助細(xì)胞的卵器，卵器包被濃厚的胚囊物質(zhì)（見圖版Ⅱ：J），合點端其余3個核分化出細(xì)胞壁，反足細(xì)胞成品字排列（見圖版Ⅱ：L），形成成熟胚囊即雌配子體。

瑤山苣苔為胚珠倒生，單珠被，薄珠心，具有珠被絨氈層。雌配子體是由1 個功能大孢子發(fā)育而來，形成7 孢8 核胚囊，這種胚囊發(fā)育方式被稱為單孢子—蓼型胚囊，這一發(fā)育特點屬于原始發(fā)育類型。

2.5 胚和胚乳的發(fā)育

瑤山苣苔成熟胚囊發(fā)生雙受精以后，受精極核（見圖Ⅲ：A）的分裂早于合子，隨著初生胚乳核的分裂，將胚囊分割成大小不等的2 個腔，大的靠近珠孔端，小的靠近合點端，并分別由此發(fā)育出珠孔吸器和合點吸器（見圖Ⅲ：B）。合點吸器在胚乳發(fā)育早期將位于珠被最外層和珠被絨氈層之間的珠被細(xì)胞逐漸吸收解體，形成較大的空腔；而此時的珠孔吸器內(nèi)的核未分裂，細(xì)胞質(zhì)濃厚，染色較深。當(dāng)受精卵發(fā)育成4細(xì)胞原胚時，吸器內(nèi)的細(xì)胞高度液泡化，向外伸展，形成外珠孔，并逐步將包圍在珠孔端的珠被細(xì)胞吸收解體，珠孔吸器在隨后胚的發(fā)育過程中殘存較長時間。

位于珠孔吸器與合點吸器間的胚乳核經(jīng)兩次橫分裂形成直線排列的4 核胚乳（見圖Ⅲ：B），隨即形成細(xì)胞壁，胚乳細(xì)胞在隨后的分裂過程中均伴隨細(xì)胞壁的分化，瑤山苣苔的胚乳發(fā)育為細(xì)胞型（見圖Ⅲ：C），在胚的發(fā)育過程中，胚乳被胚吸收耗盡（見圖Ⅲ：F）。

瑤山苣苔的卵細(xì)胞受精以后，經(jīng)過短暫休眠從珠孔伸入早期胚乳核游離的腔中（見圖Ⅲ：D）。隨著胚乳的發(fā)育，休眠合子經(jīng)1 次橫向分裂，形成一個頂細(xì)胞和一個基細(xì)胞。頂細(xì)胞再進(jìn)行2 次縱向分裂形成4 細(xì)胞原胚，隨后經(jīng)1 次橫分裂形成8細(xì)胞原胚（見圖Ⅲ：E），再經(jīng)幾次分裂形成多細(xì)胞球胚，至此不再分裂直到果實成熟；基細(xì)胞經(jīng)幾次橫分裂形成胚柄，瑤山苣苔的胚柄在胚的發(fā)育過程中并不解體。隨著胚和胚乳的發(fā)育，珠被外表皮呈瓦片狀增厚，發(fā)育成為外種皮，珠被絨氈層細(xì)胞壁增厚發(fā)育為內(nèi)種皮。

3 討論

植物生殖生物學(xué)的性狀因受外部環(huán)境因素的影響較少而具有相對的遺傳穩(wěn)定性，是系統(tǒng)學(xué)及分類學(xué)研究的重要內(nèi)容，特別在進(jìn)行屬以上的系統(tǒng)發(fā)育研究時具有重要的意義［11］?，幧杰奶ε咧榈股?、單珠被、薄珠心，具有珠被絨氈層，胚囊為單孢子發(fā)生類型，屬典型的蓼型胚囊發(fā)育方式，這些發(fā)育特征與苦苣苔科其他植物胚胎的發(fā)育方式基本相似［12～18］，表明瑤山苣苔與其他苦苣苔科各屬種之間系統(tǒng)發(fā)育上具有一致性，這一研究結(jié)果也為苦苣苔科植物的胚囊發(fā)育的類型確定提供了新的佐證資料。

本研究表明，瑤山苣苔即具有一些較為原始的胚胎學(xué)特征，如倒生胚珠、二核花粉粒、單孢子胚囊的蓼形胚囊等［16，19］；同時，瑤山苣苔也具有較為進(jìn)化的胚胎學(xué)特征，如絨氈層為較進(jìn)化的腺質(zhì)絨氈層和單珠被，表明瑤山苣苔的胚胎學(xué)特征具有過渡特征。王文采認(rèn)為瑤山苣苔的雄蕊著生于花冠近基部處，花藥二室平行，不開叉，是苦苣苔科較為原始的屬種［1］。由于苦苣苔科植物的胚胎學(xué)信息較少，本研究雖不能確定瑤山苣苔的系統(tǒng)位置，但可以推測瑤山苣苔是苦苣苔科系統(tǒng)進(jìn)化中是由原始向進(jìn)化的一種過渡植物類群。

植物的有性生殖成功與否對物種的延續(xù)和種群的拓展起決定性作用，而與植物有性生殖相關(guān)的過程包括花器官的分化、雌雄配子的形成、傳粉受精、胚胎發(fā)育以及種子的形成等，這些生殖過程中的任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，都將不同程度地導(dǎo)致生殖失敗，進(jìn)而可能引起植物瀕危［20］?，幧杰奶υ诖菩叟渥芋w發(fā)育及胚胎發(fā)育過程的細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)有少量花粉敗育現(xiàn)象，但其花粉量大，絕大部分均為發(fā)育成熟，少量的花粉敗育對其生殖成功影響不大；雌配子體形成過程中也未見異常的現(xiàn)象，表明雌配子體形成在瑤山苣苔的胚胎發(fā)育過程中可以正常發(fā)育，不是導(dǎo)致其瀕危的原因。

瑤山苣苔在果實發(fā)育成熟時，胚僅發(fā)育至球形胚時期，需要經(jīng)過一定時間的休眠才能完成形態(tài)后熟；而瑤山苣苔果實成熟已是深秋，自然條件下，要經(jīng)過一個相對干旱寒冷的冬季，可能影響種子胚的形態(tài)后熟，從而導(dǎo)致種子萌發(fā)率降低。在野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在瑤山苣苔群落較大的種群附近，很少見到瑤山苣苔的幼苗，這很可能是造成瑤山苣苔瀕危的主要內(nèi)在原因。