原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌中circPVT1的表達(dá)水平及診斷價(jià)值研究

高金霞 李秀元 牛瑩瑩 范興君 谷紅梅 楊勇 靳革

【摘要】 目的：探討環(huán)狀RNA PVT1（circPVT1）在原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者組織和血液中的表達(dá)情況及其在NSCLC早期診斷的應(yīng)用價(jià)值。方法：選取本院收治的68例NSCLC患者作為病例組，另選取同期于本院進(jìn)行體檢的68例正常人作為對(duì)照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)病例組的肺癌組織與癌旁正常組織及兩組血清circPVT1表達(dá)情況，分析circPVT1表達(dá)水平及其與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系，應(yīng)用ROC曲線分析circPVT1對(duì)于NSCLC早期診斷的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果：病例組肺癌組織circPVT1表達(dá)水平高于癌旁正常組織（P<0.05）。病例組血清circPVT1表達(dá)水平高于對(duì)照組（P<0.05）。不同性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、組織學(xué)分化程度的肺癌組織circPVT1表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），是否吸煙、不同腫瘤分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織circPVT1表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。組織circPVT1表達(dá)水平診斷NSCLC的ROC曲線下面積為0.805[P<0.001，95%CI（0.731，0.880）]。血清circPVT1表達(dá)水平診斷NSCLC的ROC曲線下面積為0.782[P<0.001，95%CI（0.704，0.860）]。結(jié)論：circPVT1在NSCLC組織和血清中的表達(dá)水平均明顯增高，腫瘤組織中circPVT1高表達(dá)與吸煙、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，circPVT1對(duì)于NSCLC具有一定的診斷價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 NSCLC circPVT1 ROC曲線

Study on the Expression Level and Diagnostic Value of circPVT1 in Primary Non-small Cell Lung Cancer/GAO Jinxia， LI Xiuyuan， NIU Yingying， FAN Xingjun， GU Hongmei， YANG Yong， JIN Ge. //Medical Innovation of China， 2021， 18（31）： 0-014

[Abstract] Objective： To investigate the expression of circular RNA PVT1 （circPVT1） in tissues and blood of patients with primary non-small cell lung cancer （NSCLC） and its application value in early diagnosis of NSCLC. Method： A total of 68 NSCLC patients admitted to our hospital were selected as the case group， and 68 normal people who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-QPCR） was used to detect the expression of circPVT1 in lung cancer tissues and adjacent normal tissues as well as the serum of the two groups， the expression level of circPVT1 and its relationship with the clinicopathological features of NSCLC were analyzed， the application value of circPVT1 for the early diagnosis of NSCLC was analyzed by ROC curve. Result： The expression level of circPVT1 in lung cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues （P<0.05）. The serum circPVT1 expression level in case group was higher than that in control group （P<0.05）. There was no significant difference in the expression level of circPVT1 in lung cancer tissues of different genders， ages， pathological types， tumor sizes and histological differentiation degrees （P>0.05）， but there were statistically significant differences in circPVT1 expression levels in lung cancer tissues with or without smoking， different tumor stages and with or without lymph node metastasis （P<0.05）. The area under ROC curve for diagnosis of tissue circPVT1 expression level in NSCLC was 0.805 [P<0.001， 95%CI （0.731， 0.880）]. The area under ROC curve of serum circPVT1 expression level for diagnosis of NSCLC was 0.782 [P<0.001， 95%CI （0.704， 0.860）]. Conclusion： The expression level of circPVT1 in NSCLC tissues and serum was significantly increased， the high expression of circPVT1 is associated with smoking， tumor stage and lymph node metastasis， circPVT1 has a certain diagnostic value for NSCLC.

[Key words] NSCLC circPVT1 ROC curve

First-author’s address： School of Public Health of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.31.003

肺癌已成為發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，發(fā)病情況仍處于逐年上升的趨勢(shì)，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占比最高，達(dá)到80%～90%。肺癌高額的治療費(fèi)用，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，且很多患者就診時(shí)肺癌已經(jīng)發(fā)展到中晚期，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)，目前手術(shù)、放化療、免疫治療、靶向治療等各種方法的應(yīng)用，5年生存率也僅15%左右[1]。因此，早期診斷、及早治療才是提高肺癌治療效果的重要方法[2]。環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)中，由于其特殊的廣泛性、保守性、穩(wěn)定性等特征，有望成為腫瘤早期診斷的新的生物標(biāo)記物[3]。circPVT1在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都起著重要作用，但關(guān)于circPVT1在肺癌中的表達(dá)情況的報(bào)道比較少見。本研究通過分析NSCLC患者組織及血液circPVT1的表達(dá)水平及其對(duì)于NSCLC的診斷價(jià)值，以期為肺癌的早期診療提供有價(jià)值的信息，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月-2019年12月于本院就診的NSCLC患者68例作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)切除肺組織進(jìn)行病理檢測(cè)，確診為NSCLC;本研究前未進(jìn)行與肺癌相關(guān)的手術(shù)、放化療或生物學(xué)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤;臨床資料不全。另選取同期于本院體檢的68例健康者作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 病例組術(shù)中留取肺癌組織和癌旁正常組織（距病灶2 cm），放于離心管中，液氮凍存。兩組抽取外周靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液存于EP管中，存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用Trizol法提取肺癌組織、癌旁正常組織及血清中總RNA，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物由上海生工生物工程公司合成，內(nèi)參GAPDH，以2-ΔΔCt表示目的基因的表達(dá)。circPVT1：正向引物CGACTCTTCCTGGTGAAGCATCTGAT;反向引物TACTTGAACGAAGCTCCATGCAGC;內(nèi)參GADPH：正向引物GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;反向引物ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用M（P25，P75）表示，比較采用秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn);采用ROC曲線分析血清及組織circPVT1表達(dá)水平對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 病例組男41例，女27例;年齡38～81歲，平均（62.14±10.98）歲;吸煙者39例，不吸煙者29例;鱗癌37例，腺癌31例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期45例。對(duì)照組男39例，女29例;年齡26～75歲，平均（53.26±13.53）歲;吸煙者40例，不吸煙者28例。兩組性別年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 病例組肺癌組織與癌旁正常組織circPVT1表達(dá)水平比較 肺癌組織circPVT1相對(duì)表達(dá)量為0.176（0.049，0.291）高于癌旁正常組織的0.081（0.022，0.179），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1。

2.3 兩組血清circPVT1表達(dá)水平比較 病例組血清circPVT1相對(duì)表達(dá)量為0.229（0.145，0.388）高于對(duì)照組的0.113（0.035，0.157），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

2.4 不同臨床特征的NSCLC患者肺癌組織circPVT1表達(dá)水平比較 不同性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、組織學(xué)分化程度NSCLC患者肺癌組織circPVT1表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;是否吸煙、不同腫瘤分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者肺癌組織circPVT1表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.5 組織circPVT1表達(dá)水平對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值 以癌旁正常組織circPVT1表達(dá)水平為對(duì)照，對(duì)circPVT1表達(dá)水平對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值采用ROC曲線分析，曲線下面積（AUC）為0.805[P<0.001，95%CI（0.731，0.880）]，見圖3。

2.6 血清circPVT1表達(dá)水平對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值 以對(duì)照組血清circPVT1表達(dá)水平為對(duì)照，對(duì)circPVT1表達(dá)水平對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值采用ROC曲線分析，AUC為0.782[P<0.001，95%CI（0.704，0.860）]，見圖4。

3 討論

環(huán)狀RNA是單鏈非編碼RNA，以共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)為特征。不同于線性RNA，它沒有5’端帽子結(jié)構(gòu)和3’端多聚A尾結(jié)構(gòu)，而是3’和5’端直接聯(lián)結(jié)形成一種閉合環(huán)狀的特殊結(jié)構(gòu)，這使其具備許多獨(dú)特生物學(xué)特性及功能[4]。環(huán)狀RNA在生物體內(nèi)廣泛存在，在血漿、外泌體等非組織中出現(xiàn)表達(dá)失調(diào)，體現(xiàn)出其無(wú)創(chuàng)、高效的早期診斷價(jià)值，以及對(duì)腫瘤變化實(shí)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等方面應(yīng)用意義[5]，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中都體現(xiàn)出其重要作用，成為目前的研究熱點(diǎn)。circPVT1是PVT1基因初始轉(zhuǎn)錄本中的一個(gè)外顯子環(huán)化而形成的一種circRNA，位置處于染色體8q24上，擁有癌癥易感基因位點(diǎn)和兩個(gè)內(nèi)含子側(cè)翼（41466bP和35269bP），以及許多Alu重復(fù)序列[6]。circPVT1是與人類衰老相關(guān)的circRNA，通過調(diào)控let-7對(duì)靶基因的影響來抑制衰老[7]。其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中也體現(xiàn)出其重要價(jià)值，circPVT1在胃癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)，并認(rèn)為是胃癌預(yù)后獨(dú)立的生物標(biāo)志物[8]。circPVT1在乳腺癌組織及患者血清中均呈現(xiàn)高表達(dá)，有望成為乳腺癌早期診斷的潛在分子生物標(biāo)志物[9]。

本研究結(jié)果顯示，病例組血清circPVT1表達(dá)水平高于對(duì)照組（P<0.05），circPVT1在NSCLC組織中表達(dá)水平高于癌旁正常組織（P<0.05），且其高表達(dá)與吸煙、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），提示circRNAs在肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移中扮演了重要的角色[10]。circRNA作為外泌體中的一類核酸分子，主要充當(dāng)微小RNA（miRNA）海綿，發(fā)揮其在基因表達(dá)中的調(diào)控作用。外泌體通過運(yùn)輸大量的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)來參與細(xì)胞間的信息交換，抑制或啟動(dòng)受體細(xì)胞中的各種信號(hào)通路，發(fā)揮其在腫瘤轉(zhuǎn)移中作用[11]。外泌體來源的circRNA大量存在于腫瘤患者的血漿中，故對(duì)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥進(jìn)行調(diào)節(jié)[12]。吸煙是NSCLC中基因突變的危險(xiǎn)因素，可能與煙草作為致癌物導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量DNA加合物，進(jìn)而造成呼吸道的細(xì)胞損傷有關(guān)。但很多研究更傾向于不吸煙人群，NSCLC中總體基因突變率與吸煙之間的關(guān)聯(lián)[13]。對(duì)于研究結(jié)論的不一致，可能與本研究樣本含量不大，且只是進(jìn)行單一的基因檢測(cè)有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入研究。

肺癌患者的診斷目前主要依賴CT影像學(xué)篩查、細(xì)胞穿刺活檢、病理組織切片等方法，細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)診斷雖然有較高的特異性，但敏感性較低。腫瘤生物標(biāo)志物是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，由腫瘤細(xì)胞合成、釋放或宿主對(duì)腫瘤反應(yīng)性釋放的物質(zhì)[14]，現(xiàn)在已逐步應(yīng)用到腫瘤的早期診斷中，如通過檢測(cè)組織或體液中特定circRNAs可以幫助診斷呼吸系統(tǒng)疾病[15-17]。本研究結(jié)果顯示，組織和血清circPVT1診斷NSCLC的ROC曲線下面積分別為0.805和0.782，表明circPVT1對(duì)于NSCLC具有較高的診斷能力。很多研究均證實(shí)了血漿circRNA對(duì)于肺癌的診斷價(jià)值，WANG等[18]研究hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821兩種circRNA對(duì)肺癌的診斷價(jià)值A(chǔ)UC分別為0.921和0.863，ZHAO等[19]研究中hsa_circ_0037515和hsa_circ_0037516兩種circRNA對(duì)肺癌的診斷價(jià)值A(chǔ)UC分別為0.81和0.82，聯(lián)合后AUC更是提高到0.9，表明血液circPVT1的診斷價(jià)值應(yīng)用前景廣闊。尤其是血液circPVT1的測(cè)定操作簡(jiǎn)單、成本低、侵入性小、更易于被患者所接受，circRNAs的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其不容易被核酸酶所分解，保持了高度的穩(wěn)定性，使circPVT1作為NSCLC診斷標(biāo)志物有天然的優(yōu)勢(shì)[20]，但尚需更大的樣本量證實(shí)及對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行更為深入的探索。

綜上所述，circPVT1在NSCLC組織和血清中的表達(dá)水平明顯增高，腫瘤組織中circPVT1高表達(dá)與吸煙、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，circPVT1對(duì)于NSCLC具有一定的診斷價(jià)值。在臨床上通過對(duì)circPVT1表達(dá)的檢測(cè)和分析判定，能夠?yàn)镹SCLC的早期診斷起到輔助性作用，有利于對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷、監(jiān)測(cè)病情和評(píng)估預(yù)后。

參考文獻(xiàn)

[1]李殿明，柳兆飛，寧國(guó)蘭，等.細(xì)胞周期蛋白25A在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與Let-7關(guān)系[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（11）：1622-1627.

[2]趙寶祥，李華，張亞君，等.microRNA-31聯(lián)合CEA對(duì)肺癌早期診斷的臨床意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2020，24（5）：763-766.

[3]許妍，趙雪，堵晶晶，等.環(huán)狀RNA研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2017，37（10）：99-108.

[4] Bachmayr H A，Reiner A T，Auer K，et al.Correlation of circular RNA abundance with Proliferation-exemplified with colorectal and ovarian cancer，idiopathic lung fibrosis，and normal human tissues[J].Sci ReP，2015，5（80）：8057.

[5]李勇，郭敏.環(huán)狀RNA在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2020，49（11）：21-24.

[6] Adhikary J，Chakraborty S，Dalal S，et al.CircularPVT1：an oncogenic non-coding RNA with emerging clinical importance[J].Journal of Clinical Pathology，2019，72（8）：513-519.

[7] Panda A C，Grammati K I，Kim K M，et al.Identification of senescence-associated circular RNAs（SAC-RNAs）reveals senescence suppressor CircPVT1[J].Nucleic Acids Research，2017，34（21）：6233-6246.

[8] CHEN J，LI Y，ZHENG Q P，et al.Circular RNA Profile identifies circPVT1 as a Proliferative factor and Prognostic marker in gastric cancer[J].Cancer Letters，2017，388：208-219.

[9]張?chǎng)┉偅鸫好?，尹貴彬.circPVT1與lncGAS5在乳腺癌中的表達(dá)[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2019，40（6）：29-32.

[10] LI Y S，HU J H，LI L J，et al.Upregulated circular RNA circ_0016760 indicates unfavorable prognosis in NSCLC and promotes cell progression through miR-1287/GAGE1 axis[J].Biochem Biophys Res Commun，2018，503（3）：2089-2094.

[11] Mashouri L，Yousefi H，Aref A R，et al.Exosomes：composition，biogenesis，and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance[J].Mol Cancer，2019，18（1）：75.

[12]文靜，呂麗華，姚嘉怡，等.外泌體來源的環(huán)狀RNA在腫瘤診療中的價(jià)值[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2020，35（12）：1213-1219.

[13]沈美頔，藺紅靜，李峰，等.非小細(xì)胞肺癌基因突變與吸煙相關(guān)性的研究現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2020，28（17）：3078-3080.

[14] CA724、CA153、PSA、HCG在肺癌患者病理類型診斷、臨床分期及預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用分析[J].臨床肺科雜志，2020，25（9）：1405-1410.

[15] Haque S，Harries L W.Circular RNAs（circRNAs）in health and disease[J].Genes（Basel），2017，8（12）：353.

[16] WANG J F，ZHAO X H，WANG Y B，et al.circRNA-002178 act as a ceRNA to promote PDL1/PD1 expression in lung adenocarcinoma[J].Cell Death Dis，2020，11（1）：32.

[17] FAN C M，WANG J P，TANG Y Y，et al.circMAN1A2 could serve as a novel serum biomarker for malignant tumors[J].Cancer Sci，2019，110（7）：2180-2188.

[18] WANG C D，TAN S Y，LIU W R，et al.RNA-Seq profiling of circular RNA in human lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma[J].Mol Cancer，2019，18（1）：134.

[19] ZHAO D M，LIU H G，LIU H C，et al.Down regulated expression of hsa_circ_0037515 and hsa_circ_0037516 as novel biomarkers for nonsmall cell lung cancer[J].Am J Transl Res，2020，12（1）：162-170.

[20]徐康喬，夏世金，王堅(jiān)，等.環(huán)狀RNA與呼吸系統(tǒng)疾病[J].中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2020，19（6）：611-616.

（收稿日期：2021-03-01） （本文編輯：田婧）

sdjzdx202203231640