復(fù)合酶法制備紫花蕓豆抗氧化肽

李雪，左鋒，王長遠，2

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶163319；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室，黑龍江大慶163319

紫花蕓豆營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、各種維生素等成分［1］，還因含有皂苷、尿毒酶和多種球蛋白等獨特成分，具有較高的藥用價值，因此受到醫(yī)學(xué)界的重視［2］。紫花蕓豆中蛋白含量豐富，且具有較好的功能性，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白。但大分子蛋白因結(jié)構(gòu)及抗原性強等原因不易被機體直接吸收，使得蕓豆蛋白在保健和疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制［3］。多肽是涉及機體內(nèi)各種細胞功能的活性物質(zhì)［4］，相對分子質(zhì)量小，易于人體吸收。研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白多肽鏈中的肽類物質(zhì)具有較強抗氧化活性，近年已成為研究熱點［5-8］。目前，植物蛋白中對大豆抗氧化肽的研究較多。CHEN 等［9］、徐力等［10］、榮建華［11］均從大豆蛋白中得到了具有抗氧化活性的多肽；程云輝等［12］從麥胚蛋白、王雙玉等［13］從玉米醇溶蛋白中也獲得了抗氧化活性肽。紫花蕓豆作為藥食同源的一種植物，其蛋白肽也將是一種較好的抗氧化肽生產(chǎn)的來源。酶法生產(chǎn)生物活性肽因其具有生產(chǎn)條件溫和、安全性高、價廉且可得到特定的活性肽等優(yōu)點，是目前生產(chǎn)活性肽的主要方法。蛋白質(zhì)多肽鏈內(nèi)部可能普遍存在功能區(qū)，含有許多生物活性肽，其在母體蛋白質(zhì)序列內(nèi)不具生物活性，但通過體內(nèi)或體外蛋白酶水解釋放出來后即可在體內(nèi)發(fā)揮特定的生理功能［14-15］。多數(shù)食物源蛋白質(zhì)水解得到的肽均能表現(xiàn)出一定的抗氧化性［16］。

本研究以紫花蕓豆為原料，建立復(fù)合酶體系，對紫花蕓豆蛋白進行水解，通過響應(yīng)面分析對水解工藝進行優(yōu)化，并對獲得的蕓豆蛋白肽進行抗氧化特性分析，為蕓豆蛋白的精深加工提供新途徑，也為紫花蕓豆抗氧化肽的生產(chǎn)及工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 紫花蕓豆 產(chǎn)自黑龍江，由黑龍江省大慶市國家雜糧工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 主要試劑及儀器 堿性蛋白酶（100 u ／ mg）購自北京索萊寶生物科技有限公司；中性蛋白酶（100 u／mg）購自上海源葉生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 000 u ／ g）、風味蛋白酶（30 000 u ／ g）、胰蛋白酶（74 000 u／g）購自德國賽國生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DPPH、硫酸亞鐵購自阿拉丁試劑有限公司；PHS.2C型精密pH 計購自美國METTLERTOLEDO 公司。

1.3 紫花蕓豆蛋白的提取 參照文獻［17］方法進行提取。將紫花蕓豆手工去皮后粉碎過80 目篩，石油醚脫脂5 h，制得脫皮脫脂的蕓豆粉。取蕓豆粉與蒸餾水按1 ∶10（W ／ V）比例混合，用1 mol ／ L NaOH調(diào)pH 至9.0，50 ℃攪拌提取50 min；1 789 ×g離心20 min，收集上清液置燒杯中，沉淀按固液比1 ∶8（W ／ V）混合，重復(fù)上述操作。將2 次收集的上清液混合，用1 mol／L HCl 調(diào)pH 至4.6，沉淀1 h，1 789×g離心20 min，棄上清液，沉淀用蒸餾水復(fù)溶，1 mol ／ L NaOH 調(diào)pH 至7.0，蛋白液噴霧干燥后，即獲得紫花蕓豆蛋白，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 紫花蕓豆蛋白水解物的制備 采用pH-stat法［18］。稱取一定量的蕓豆蛋白粉配成一定濃度的蛋白質(zhì)溶液，90 ℃下預(yù)處理10 min；調(diào)溶液pH 至各蛋白酶所需值，加入適量蛋白酶，并置恒溫水浴鍋中不斷攪拌，用0.2 mol／L NaOH 調(diào)溶液pH 維持不變后，進行滅酶處理，收集上清液，即為蕓豆蛋白水解物。記錄反應(yīng)過程中消耗NaOH 溶液的體積。按下式計算蛋白水解度。

式中B 為消耗NaOH 的體積（mL）；Mb 為NaOH濃度（0.2 mol ／ L）；Mp 為加入蛋白的質(zhì)量（g）；堿性蛋白酶1 ／ α 為1；htot 為每克蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，對于蕓豆蛋白質(zhì)來說，htot = 7.72。

1.5 蛋白酶的選擇 選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶共5 種進行最適蛋白酶篩選。底物濃度均為5%，在各自最適條件下水解蕓豆蛋白2 h。以水解度為指標，在各個酶最適條件下篩選出蕓豆蛋白水解度最高、效果最好的兩種蛋白酶，作為復(fù)合酶的組合。

1.6 單因素試驗設(shè)計 確定復(fù)合酶組合后，以酶解的反應(yīng)溫度、pH、酶比例（堿性蛋白酶∶中性蛋白酶）、反應(yīng)時間和酶添加量為影響因素，分析以上因素對紫花蕓豆蛋白水解度的影響，其中酶添加量部分，因選取的兩種蛋白酶的酶活力單位不同，因此選取總酶活力值作為指標，通過計算可得出每種酶的添加量，從而進行試驗?；A(chǔ)試驗條件為pH 10，酶比例1 ∶1，溫度55 ℃，酶解時間2 h，酶添加量6 000 u ／ mL。研究單個因素時，僅該因素條件發(fā)生變化，其他條件均為基礎(chǔ)試驗條件。單因素試驗水平見表1。

表1 單因素試驗水平表Tab.1 Levels in single factor test

1.7 響應(yīng)面分析試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 的原理［19］，選取溫度（A）、pH（B）、酶比例（C）和酶添加量（D）4 個影響顯著的因素作為自變量，水解度（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計類型為4 因素3 水平的響應(yīng)面試驗，共29 組試驗，其中5 組為中心零點試驗，24 組為析試驗。零點為區(qū)域的中心值，析因點為自變量取值在A、B、C、D 所構(gòu)成的三維頂點。將因素的上下水平編碼為1、-1，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6.1 軟件計算出實際水平［20-21］。因素水平見表2，Box-Behnken 試驗方案見表3。響應(yīng)曲面坡度的陡峭程度與平緩程度表明處理條件變化對響應(yīng)值即接枝度影響的大小，如響應(yīng)曲面坡度相對陡峭，表示處理條件變化對接枝度的影響較大；如響應(yīng)曲面坡度相對平緩，表示處理條件變化對接枝度的影響較?。?2］。

表2 響應(yīng)面因素水平編碼表Tab.2 Factors and levels in response surface optimization

表3 Box-Behnken 試驗方案Tab.3 Protocol of Box-Behnken test

1.8 蕓豆蛋白肽抗氧化能力的檢測 以羥自由基清除能力和DPPH 清除能力作為指標，以紫花蕓豆蛋白水解度作為參照，探討紫花蕓豆蛋白肽的抗氧化性。

1.8.1 羥自由基清除能力 在不同水解時間各取2 mL蕓豆蛋白水解上清液，分別依次加入6 mmol ／ L 硫酸亞鐵4 mL，6 mmol 過氧化氫2 mL，混勻，靜置10 min后，加入6 mmol ／ L 水楊酸2 mL，混勻靜置30 min后，于510 nm 波長處檢測吸光度值，空白對照組以蒸餾水代替蕓豆蛋白水解液。按下式計算羥自由基清除能力。

式中，A1為510 nm 波長下水解液的吸光度值，A0為510 nm 波長下對照的吸光度值。

1.8.2 DPPH 抗氧化能力 將樣品液100 μL（用雙蒸水溶解）與100 μL 0.1 mmol ／ L DPPH 溶液（用無水乙醇配置）混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min；在517 nm 波長處檢測樣品吸光度A1，用等體積無水乙醇代替DPPH 溶液作為空白對照組，吸光度值記作A0，其他條件與實驗組相同，檢測吸光度A2。按下式計算DPPH 自由基清除率。

2 結(jié) 果

2.1 最適蛋白酶的篩選 結(jié)果顯示，堿性蛋白酶和中性蛋白酶對紫花蕓豆蛋白的水解程度最好，水解度分別為29%和34%，而風味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解度則不高，因此，選擇堿性蛋白酶和中性蛋白酶進行復(fù)合酶的組合，見圖1。

圖1 5 種蛋白酶蕓豆蛋白水解度對比圖Fig.1 Hydrolysis degrees of five kinds of kidney bean protein

2.2 單因素試驗

2.2.1 溫度對紫花蕓豆蛋白水解度的影響 結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，蕓豆蛋白的水解度呈先上升后下降的趨勢，當溫度為55 ℃時，水解度達最大值，為32.75%，見圖2。

圖2 溫度對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis degree of kidney bean protein

2.2.2 pH 對紫花蕓豆蛋白水解度的影響 結(jié)果顯示，隨著pH 的升高，蕓豆蛋白水解度呈先上升后下降的趨勢，當pH 為10 時，水解度達最大值，即復(fù)合酶水解最適pH 為10，見圖3。

圖3 pH 對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of pH on hydrolysis degree of kidney bean protein

2.2.3 酶比例對紫花蕓豆蛋白水解度的影響 結(jié)果顯示，隨著中性蛋白酶比例的增加，蕓豆蛋白水解度呈上升趨勢，當中性蛋白酶用量一定時，隨著堿性蛋白酶用量的增加，蕓豆蛋白水解度呈下降趨勢，當酶比例為1 ∶3 時，蕓豆蛋白水解度最高，為蛋白酶最適復(fù)合配比，見圖4。

圖4 酶比例對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme ratio on hydrolysis degree of kidney bean protein

2.2.4 酶添加量對紫花蕓豆蛋白水解度的影響結(jié)果顯示，酶活在2 000 ～5 000 u ／ mL 時，隨著酶活力的增加，水解度呈上升趨勢，當酶活力在5 000 ～6 000 u ／ mL 時，水解度呈下降趨勢，因此最適酶添加量為5 000 u ／ mL，見圖5。

2.2.5 時間對紫花蕓豆蛋白水解度的影響 結(jié)果顯示，隨著酶解時間的增加，蕓豆蛋白水解度呈上升趨勢，在2.5 ～3 h 之間上升趨勢趨于平穩(wěn)，酶解3 h 時水解效果最佳，但考慮到實際因素，選擇酶解2.5 h 為最適時間，見圖6。

圖5 酶添加量對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on hydrolysis degree of kidney bean protein

圖6 時間對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.6 Effect of time on hydrolysis degree of kidney bean protein

2.3 Box-Behnken 試驗

2.3.1 Box-Behnken 試驗結(jié)果 通過模型預(yù)測得到最適紫花蕓豆蛋白復(fù)合酶酶解條件為：溫度56.29 ℃，酶添加比例1 ∶2，酶添加量5 800 u ／ mL，pH 10.94，此時的水解度預(yù)測值為43.54%。見表4。

2.3.2 回歸方程及顯著性檢驗 以水解度（Y）為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，A、B、C 和D 對應(yīng)響應(yīng)Y 的二元多項回歸方程為：Y = 26.52 + 2.63 A + 7.68 B +2.45 C+0.43 D+3.33 AB-0.77 AC-0.84 AD +1.16 BC+2.36 BD+0.8 CD+1.62 A2+ 1.07 B2-1.83 C2+ 1.63 D2，根據(jù)方差分析結(jié)果，剔除不顯著項，得到優(yōu)化后的響應(yīng)面方程為：Y=26.52+2.63 A+7.68 B + 2.45 C + 0.43 D + 3.33 AB + 2.36 BD -1.83 C2+ 1.63 D2。回歸模型系數(shù)見表5，回歸方程模型F檢驗顯著，失擬項不顯著，表明其他因素對試驗結(jié)果干擾較小，模型能較好地反映數(shù)據(jù)，因此，用此模型優(yōu)化反應(yīng)溫度、pH、酶比例、酶添加量及酶解時間對紫花蕓豆蛋白水解度的影響是可行的。因素AB的P= 0.001 15 ＜0.05，BD 的P= 0.012 0 ＜0.05，表明在3 個因素中，A 與B、B 與D 兩者之間有顯著的交互作用。

表4 Box-Behnken 試驗結(jié)果Tab.4 Result of Box-Behnken test

表5 回歸模型系數(shù)檢驗Tab.5 Regression model coefficient test

2.3.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化 在不同的pH 條件下，溫度對蕓豆蛋白水解度的影響變化趨勢基本相同，隨著pH 增大，蕓豆蛋白水解度呈上升趨勢。在一定pH條件下，蛋白水解度隨溫度變化不顯著。溫度的等高線比酶添加量的等高線密集，表明溫度比pH 對蕓豆蛋白水解度的影響要大。見圖7。

在不同的pH 條件下，酶添加量對蕓豆蛋白水解度的影響變化趨勢基本相同，隨著pH 增大，蕓豆蛋白水解度呈上升趨勢。在一定pH 條件下，蕓豆蛋白水解度隨酶添加量的變化不顯著。pH 的等高線比酶添加量的等高線密集，表明pH 比酶添加量對蕓豆蛋白水解度的影響要大。見圖8。

圖 7 溫度-pH 對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.7 Effect of temperature-pH on hydrolysis degree of kidney bean protein

2.3.4 最適復(fù)合酶酶解工藝參數(shù) 由2.3.1 項結(jié)果可知，模型預(yù)測的最適紫花蕓豆蛋白復(fù)合酶酶解條件為：溫度56.29 ℃，酶添加比例1 ∶2，酶添加量5 800 u ／ mL，pH 10.94，水解度預(yù)測值為43.54%。綜合實際應(yīng)用，考慮pH 對蕓豆蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的影響和酶用量等因素，最終確定最適紫花蕓豆蛋白復(fù)合酶酶解條件為：溫度55 ℃、酶添加比例1 ∶2、酶添加量5 000 u ／ mL 和pH 10，根據(jù)上述條件進行驗證，得到水解度的實際值為42.2%，二者接近。且復(fù)合酶酶解紫花蕓豆蛋白肽的水解度要高于5 種蛋白酶單獨酶解紫花蕓豆蛋白肽的水解度。

圖8 pH-酶添加量對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.8 Effect of pH-enzyme addition on hydrolysis degree of kidney bean protein

2.4 蕓豆蛋白肽抗氧化性 結(jié)果顯示，隨著時間的延長，紫花蕓豆蛋白的水解度、DPPH 清除率和羥自由基的清除率均呈上升趨勢。水解度在0 ～0.5 h 內(nèi)迅速提高，0.5 h 后提高幅度變緩，在酶解時間為3 h時，達最高值，水解度為42.7%。綜合兩種自由基清除能力，當酶解時間為3 h 時，為制備紫花蕓豆抗氧化肽的最適水解時間。見圖9。

圖9 紫花蕓豆蛋白肽水解度與抗氧化性關(guān)系Fig.9 Relationship between hydrolysis degree and antioxidant activity of kidney bean protein peptide

3 討 論

有研究認為，水解植物蛋白時使用堿性蛋白酶較為合適［23］，堿性蛋白酶對酶解羧端疏水性氨基酸有較強的專一性。NICHOLAS 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶Alcalase 可裂解酪蛋白中G1u、Met、Leu、Tyr、Lys 和Gln 的羧端肽鍵；而中性蛋白酶AS1.398 僅僅水解羧基端為Tyr、Phe、Trp 等的芳香族疏水性氨基酸的肽鍵。酶的專一性決定了某種蛋白酶可能僅對某些肽鍵或帶有某種基團的氨基酸所形成的肽鍵作用，不同蛋白酶對底物蛋白水解所得的酶解物的種類和生物活性是不同的，因此，采用復(fù)合酶對紫花蕓豆蛋白進行水解，將得到更多不同相對分子質(zhì)量的肽鏈，而酶種類的不同也是制備高活性抗氧化肽的重要因素之一。選擇兩種酶進行復(fù)合，在水解紫花蕓豆蛋白時則可以同時作用2 個酶的切割位點，即可水解出更多不同的肽鏈。

實驗中溫度范圍為45 ～65 ℃，溫度升高后，蕓豆蛋白的水解度呈先上升后下降趨勢，上升趨勢是因為適當?shù)臏囟瓤商岣呙傅幕钚?，同時也可使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，從而暴露出更多的酶作用點，在一定時間內(nèi)與酶接觸增多。下降是因為當溫度超過一定值后，酶會發(fā)生變性，從而失去活性，導(dǎo)致水解不能繼續(xù)進行。

pH 范圍為8 ～12，蕓豆蛋白水解度隨pH 增大，呈先上升后下降趨勢。這是因為酶是一種特殊的蛋白質(zhì)分子，環(huán)境pH 會影響酶分子的構(gòu)象以及酶分子和底物的解離狀態(tài)，其催化能力也會隨pH 的變化而變化，從而影響酶的活性和酶促反應(yīng)速度，pH過高或過低對酶的反應(yīng)均不利。當pH 為10 時，水解度達最大值，即復(fù)合酶水解最適pH 為10。

蛋白酶比例研究中，中性蛋白酶比例增加，蕓豆蛋白水解度呈上升趨勢，堿性蛋白酶用量增加，蕓豆蛋白水解度呈下降趨勢。堿性蛋白酶對酶解羧端疏水性氨基酸有較強的專一性，而中性蛋白酶可水解一些羧端芳香族疏水性氨基酸的肽鍵，兩種酶各有專長，具體水解效果與底物密切相關(guān)。

酶添加量研究中，酶活范圍為2 000 ～6 000 u／mL，隨著酶活力的增加，水解度呈先上升后下降趨勢，這是因為過量的酶不僅會增加成本，還可能會抑制與底物蛋白的反應(yīng)，從而降低了水解度。

隨著酶解時間的延長，蕓豆蛋白的水解度呈上升趨勢，最后趨于平穩(wěn)，這是因為隨著酶解時間的延長，底物蕓豆蛋白的濃度不斷減少，蛋白質(zhì)上肽鍵的數(shù)量也在減少，同時酶的活性也在下降。

水解時間延長，紫花蕓豆蛋白的水解度、DPPH清除率和羥自由基清除率均呈上升趨勢。呈現(xiàn)這種趨勢的原因可能為酶解初期底物和酶均很充足，而隨著水解時間的延長，底物和酶的濃度不斷降低。DPPH 清除率和羥自由基清除率為先緩慢上升，再快速上升，再緩慢上升的趨勢。當水解時間為3 h時，DPPH 清除率和羥自由基清除率均達到最大值，可能是因為隨著水解時間的延長，水解度增大，肽的相對分子質(zhì)量減小，具有抗氧化活性的肽就越多，從而使得DPPH 清除率和羥自由基清除率不斷增大，這與RAMESH 等［25］的研究相一致，羥自由基和DPPH清除率最大值分別為37.5%和40.1%，表明紫花蕓豆蛋白肽具有較強的抗氧化性，可作為一種天然的抗氧化劑進行深入研究并應(yīng)用。目前紫花蕓豆蛋白抗氧化肽的研究不多，馬萍等［26］采用雙酶分段水解法對紫花蕓豆蛋白水解，并進行了雙酶分段水解的工藝優(yōu)化，最終紫花蕓豆蛋白的水解度達58.8%，酶解時間為7.5 h。本研究采用復(fù)合酶法進行紫花蕓豆蛋白肽的水解研究，最終水解度為42.2%，酶解時間為3 h，雖然水解度較雙酶分段水解度低，但酶解時間較雙酶分段水解減少一半以上，而水解度卻可達雙酶分段水解的72%左右，考慮到操作和儀器的使用消耗等因素，復(fù)合酶水解紫花蕓豆蛋白的方法比較簡單且高效。

本研究采用復(fù)合酶法制備蕓豆蛋白抗氧化肽，復(fù)合酶的組合為中性蛋白酶和堿性蛋白酶，通過單因素和響應(yīng)面試驗對復(fù)合酶水解工藝進行優(yōu)化，獲得最適水解條件為：溫度55 ℃、pH 10、酶添加比例為1 ∶2、酶添加量5 mL，在此條件下，測得紫花蕓豆蛋白水解度為42.2%。對水解后的紫花蕓豆蛋白肽進行抗氧化性測定，羥基和和DPPH 清除率分別達37.5%和40.1%，證明紫花蕓豆肽具有較好的抗氧化性，即為紫花蕓豆抗氧化肽。本研究為紫花蕓豆抗氧化肽的制備提供參考，也為紫花蕓豆蛋白肽在天然抗氧化劑的開發(fā)方面提供技術(shù)支持。