人狂犬病病毒抗體ELISA 定量檢測方法的建立

卞論，趙卉，賈慶釗，方浩霖，何春輝，葉珂，林冠峰，吳英松

1.南方醫(yī)科大學，廣東 廣州510515；2.中山大學附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州510000；3.廣州諾誠生物制品有限公司，廣東廣州511495

狂犬病是病死率極高的急性傳染病，目前尚無有效的治療手段，疫苗免疫是預防該病發(fā)生的唯一途徑［1-2］。狂犬病血清學檢測用于常規(guī)狂犬病疫苗免疫后的效果評價。檢測狂犬病病毒中和抗體可評價人用狂犬病疫苗的免疫學效果、狂犬病免疫球蛋白的中和活性、進行狂犬病病例實驗室診斷等［3］。世界衛(wèi)生組織推薦的狂犬病病毒中和抗體檢測標準方法為小鼠腦內中和法（mice neutralization test，MNT）和快速熒光灶抑制試驗（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）［4］。兩者均存在耗時長、設備成本高等缺點，不方便大規(guī)模普及［5］。ELISA 法可作為MNT、RFFIT 的潛在替代性檢測方法，因其敏感、簡單、重復性好等優(yōu)點［6］，可使人體抗狂犬病病毒抗體水平的檢測更方便和快捷［7］。

本研究建立了檢測狂犬病病毒抗體的ELISA定量檢測方法，并驗證了其臨床應用的性能及可行性。

1 材料與方法

1.1 病毒及血清 PM 株狂犬病病毒滅活全病毒及血清樣本由廣州諾誠生物制品有限公司提供；人抗狂犬病病毒血清國家標準品購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑及儀器 抗狂犬病病毒單克隆抗體（S010，線性表位）由南方醫(yī)科大學抗體工程研究所保存；抗人IgG 二抗（抗人IgG-6#）購自深圳菲鵬生物股份有限公司；鹽酸阿霉素、BSA、EDC、NHS、丙烯酰胺、SDS、TMB 為美國Sigma 公司產品，其他試劑均為國產分析純；HRP 快速標記試劑盒購自北京博奧龍免疫技術有限公司；96 孔微孔板（規(guī)格：96 孔12 × 8）購自廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司；層析柱填料SephadexTMG-50 購自美國Amersham Pharmacia公司；超濾離心管為美國Millipore 公司產品。

1.3 溶液配制 包被液：50 mmol ／ L Tris-HCl 緩沖液，pH 7.2；封閉液：50 mmol ／ L Tris-HCl 緩沖體系中加入0.1%BSA、4%海藻糖、0.05% NaN3，0.22 μm過濾后調pH 至7.2，4 ℃保存；洗滌液：50 mmol ／ L Tris-HCl 緩沖液，pH 7.8，0.84% NaCl，0.01% NaN3，0.06% Tween 20；分析緩沖液：PBS 緩沖液，pH 7.8，0.22 μm 過濾，4 ℃保存；標準品稀釋液：50 mmol ／ L Tris-HCl 緩沖液pH 7.8，含0.9% NaCl、0.1% NaN3、0.01% Tween-20、1.5% BSA，0.22 μm 過濾；顯色液A 液：TMB（四甲基聯(lián)苯胺）200 mg，無水乙醇（或DMSO）100 mL，加超純水至1 000 mL，0.45 μm 濾膜過濾；顯色液B 液：Na2HPO4·12H2O 36.8 g，C6H8O7·H2O 9.33 g，H2O20.5 mL 加超純水至1 000 mL，0.45 μm濾膜過濾；終止液：2 mol ／ L H2SO4。

1.4 抗體包被 將S010 以一定濃度溶于包被液中，反應孔中加入100 μL，37 ℃振蕩包被2 h；棄孔內包被液，加入0.1% BSA 封閉液，150 μL ／ 孔，4 ℃封閉過夜；棄孔內溶液，拍干，抽真空，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 抗人IgG 抗體的H R P 標記 按HRP 快速標記試劑盒說明書將抗人IgG 二抗與HRP 酶進行偶聯(lián)標記，產物經SephadexTMG-50 純化后收集，HRP 活性測定符合要求后置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標準品配制 采用標準品稀釋液將國家標準品配制成濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.4 及1 IU ／ mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測方法 于包被有S010 抗體的反應孔中加入1 ∶100 稀釋的狂犬病病毒滅活全病毒100 μL，37 ℃振蕩孵育1 h；棄溶液，洗滌液洗滌4 次，將標準品或待檢測樣品按1 ∶10 稀釋后，加入25 μL 至微孔板中，并加入用分析緩沖液按一定比例稀釋的HRP標記的二抗75 μL，37 ℃孵育1.5 h；棄孔內溶液，洗滌液洗滌6 次，每孔加入A 液、B 液各50 μL，37 ℃孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，用Biotech 酶標儀于450 nm 波長處檢測A值。

1.8 試劑使用量的優(yōu)化 將S010 分別以2、3.5、5 μg ／ mL 濃度進行包被，按1.7 項方法進行檢測；將HRP 標記的二抗分別按1 ∶1 000，1 ∶2 000，1 ∶40 000 稀釋，按1.7 項方法進行檢測。

1.9 反應曲線繪制 用建立的ELISA 方法檢測不同濃度（0、0.05、0.1、0.2、0.4、1.0 IU ／ mL）標準品，以標準品濃度為橫坐標，扣除0 IU ／ mL 本底的信號值為縱坐標，繪制標準品濃度-信號值擬合曲線，確定擬合方程及相關系數(shù)。

1.10 方法的驗證

1.10.1 空白限確定 使用建立的ELISA 方法對空白樣本重復檢測20 次后獲得樣本信號值，計算mean +2 SD值后，通過代入擬合方程得出空白限。

1.10.2 準確度 向2 個已知濃度血清樣本（A：1.23 IU ／ mL；B：3.12 IU ／ mL）中加入一定量國家標準品，分別計算獲得樣品的理論濃度，使用建立的ELISA 方法進行檢測，重復3 次并計算均值，通過理論濃度與實際測定濃度均值比值計算回收率。

1.10.3 精密度 用建立的ELISA 方法對自制質控品（QC-1：5 IU ／ mL；QC-2：2.5 IU ／ mL）進行檢測，計算分析內變異系數(shù)（n= 10）和分析間變異系數(shù)（n= 5）。

1.11 與同類試劑的比較 用建立的ELISA 方法對10 份未接種狂犬病疫苗的陰性血清樣本及62 份RFFIT 法測定值大于0.5 IU ／ mL 的陽性血清樣本進行檢測，以0.5 IU ／ mL 為陰陽性判斷線，比較兩者結果的一致性；并同時用建立的ELISA 方法及RFFIT 法對62 份陽性血清進行檢測，以ELISA 方法檢測值為橫坐標，RFFIT 法檢測值為縱坐標，繪制曲線，比較兩者檢測結果的相關性。

2 結 果

2.1 試劑最佳使用量 確定S010 最佳包被濃度為3.5 μg ／ mL，酶標二抗最佳稀釋度為1 ∶10 000，見表1。

2.2 反應曲線 采用線性擬合方式測得試劑劑量-反應曲線線性相關系數(shù)為r2= 0.992，見圖1。

2.3 空白限 結果顯示，mean + 2 SD值代入擬合方程計算得空白限為0.03 IU ／ mL。

2.4 準確度 結果顯示，A、B 血清樣本檢測回收率分別為89.6%和92.6%，符合診斷試劑檢定要求，見表2。

2.5 精密度 結果顯示，QC-1 和QC-2 兩個質控品分析內變異系數(shù)和分析間變異系數(shù)分別為13.9%、14.3%和11.5%、13.2%，見表3，表明精密度較好。

2.6 陰陽符合率 結果顯示，總陰陽符合率為100%。

2.7 比對試驗 結果顯示，自建ELISA 方法檢測值與RFFIT 法檢測值相關性較好，相關系數(shù)R2為0.712，見圖2。

表1 試劑使用量比對優(yōu)化結果（A450）Tab.1 Optimization of dosage of reagents（A450）

圖1 自制人抗狂犬病病毒抗體分析試劑反應曲線Fig.1 Reaction curve of prepared analytical reagent for rabies virus antibody

表2 ELISA 方法回收率驗證結果（n = 3）Tab.2 Verification for recovery rate of samples determined by developed ELISA method（n = 3）

表3 ELISA 方法精密度驗證結果Tab.3 Verification for precision of developed ELISA method

圖2 ELISA 方法與RFFIT 法檢測值的比對試驗（n=62）F ig.2 Comparison of determination results by developed ELISA method and RFFIT（n = 62）

3 討 論

人體接種狂犬病疫苗后，機體可產生狂犬病病毒中和抗體，抗體水平≥0.50 IU ／ mL 即可認為達到保護性抗體水平［8］。檢測狂犬病病毒中和抗體水平的金標準是世界衛(wèi)生組織推薦的MNT 法和RFFIT 法［4，9］。MNT 法雖然為最早應用的中和抗體檢測方法，但其變異系數(shù)大，檢測結果重復性差，而且出于動物福利因素考慮，逐漸被FRFFIT 法取代。RFFIT 法是通過使用一定量的狂犬病病毒CVS 株與稀釋的滅活后血清混合溫育后加入敏感細胞懸液，再通過計算得出抗體效價，具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點［10］。但RFFIT 法在操作中需使用狂犬病病毒，須在2 級生物安全實驗室內才能進行操作，因此基層機構較難開展，應用范圍有限。

本研究使用ELISA 法進行狂犬病疫苗免疫后的效果評價則可較好地規(guī)避MNT 法和RFFIT 法的缺點［11-12］。但ELISA 法由于使用的抗原的純度及組分不同，檢出抗體也不同，包含中和抗體在內的所有抗狂犬病病毒抗體，因此檢測的特異性受到一定的限制。但檢測狂犬病疫苗接種者血清內狂犬病病毒抗體一定程度也可反映狂犬病疫苗接種免疫的有效性，其在某些情況下具有一定的現(xiàn)實應用價值，如大樣本疫苗免疫臨床試驗初篩等［13］。ELISA 法定量檢測狂犬病病毒抗體，操作快速、簡便，樣本質量要求低，易于標準化，不依賴生物安全實驗室［14］，更適合大規(guī)模樣本的抗體初步篩查評估。

本研究反應模式為捕獲包被間接法，用抗狂犬病病毒單克隆抗體包被微孔板內加入純化的狂犬病病毒顆粒后，形成固相復合抗原層，再進行間接法檢測程序，可使非特異性反應較大程度降低。自制試劑與RFFIT 法平行檢測對比時也體現(xiàn)出了較好的相關性，兩個不同濃度自制質控品分析內和分析間變異系數(shù)分別為13.9%、14.3%和11.5%、13.2%，基本符合使用要求。因此，本研究建立的ELISA 方法有望用于大規(guī)?？袢∫呙缑庖咝Ч某醪胶Y查評估。