丹參治療糖尿病神經(jīng)病變分子機(jī)制及其歸經(jīng)實(shí)質(zhì)探討*

鐘達(dá)源，李蘭，蔣成婷，鄧奕輝

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

糖尿病為慢性系統(tǒng)性疾病，全球發(fā)病率高達(dá)6.7%[1]，糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病最常見的長(zhǎng)期并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中發(fā)病率為15%[2]，其中以糖尿病神經(jīng)病理性疼痛最為常見，而糖尿病周圍神經(jīng)病變患者大概率會(huì)出現(xiàn)慢性疼痛[3]。雖然目前已開發(fā)出許多藥物用于治療糖尿病神經(jīng)病變，但在不良反應(yīng)和長(zhǎng)期療效方面仍表現(xiàn)不佳[4]，因此，有必要尋找新的更好的治療方法。最新證據(jù)表明，從生物心理社會(huì)的角度來(lái)看，天然保健品和膳食可能是糖尿病神經(jīng)病變新的獲益來(lái)源[5]，中藥及復(fù)方含有大量的化學(xué)成分，可作用于疾病相關(guān)的多個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)于糖尿病神經(jīng)病變這種多因素、復(fù)雜性疾病的治療具有優(yōu)勢(shì)。

糖尿病神經(jīng)病變屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，根據(jù)癥狀可將其歸屬于中醫(yī)的“消渴”“血痹”等范疇，病機(jī)主要包括陰陽(yáng)氣血虧虛和痰瘀內(nèi)積兩個(gè)方面。段力等[6]通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病周圍神經(jīng)病變是本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之病，本虛以氣虛、陰虛為主，標(biāo)實(shí)以血瘀為主。丹參是雙子葉唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血化瘀的功效，對(duì)證治療糖尿病神經(jīng)病變血瘀證有確切療效。文獻(xiàn)研究揭示了丹參在臨床試驗(yàn)中改善血脂的臨床效果[7]。有證據(jù)表明，丹參的生物活性成分可以改善小鼠的認(rèn)知缺陷，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，防止淀粉樣蛋白β纖維的形成和解聚[8]。丹參提取物可顯著改善脊髓損傷后組織病理學(xué)改變，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[9]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，丹參可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt、Akt、PI3K、NOS、AGEs等多條通路，改善氧化還原穩(wěn)態(tài)，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥，從而展現(xiàn)其抗糖尿病活性[10-13]?？梢姷⒃谥委熖悄虿∩窠?jīng)病變方面療效確切，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，針對(duì)丹參治療糖尿病神經(jīng)病變的研究逐漸深入，但尚無(wú)針對(duì)其具體分子作用機(jī)制的研究，且丹參治療糖尿病神經(jīng)病變是否與歸經(jīng)相關(guān)無(wú)從得知。因此，為了指導(dǎo)丹參治療糖尿病神經(jīng)病變的研究方向且探明丹參歸經(jīng)實(shí)質(zhì)，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對(duì)丹參治療糖尿病神經(jīng)病變的分子靶點(diǎn)及通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)丹參歸經(jīng)實(shí)質(zhì)進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)來(lái)源TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)，PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)，CTD數(shù)據(jù)庫(kù)，BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 丹參有效成分的收集及處理通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選丹參的有效成分。通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)查找化合物的3D結(jié)構(gòu)并將其導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)以預(yù)測(cè)其分子對(duì)接靶點(diǎn)。將丹參靶點(diǎn)名注釋后通過(guò)string數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索糖尿病神經(jīng)病變疾病靶點(diǎn)18 044個(gè)，將PPI網(wǎng)絡(luò)中包含的靶點(diǎn)與糖尿病神經(jīng)病變疾病靶點(diǎn)相交取共同子集，即得到丹參治療糖尿病神經(jīng)病變的靶點(diǎn)。

1.3 丹參靶點(diǎn)在心肝胰肺腎的蛋白表達(dá)網(wǎng)絡(luò)通過(guò)BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索PPI網(wǎng)絡(luò)中包含的基因在心肝胰肺腎的表達(dá)情況，并篩選表達(dá)最高的器官。采用丹參治療糖尿病神經(jīng)病變靶點(diǎn)、丹參靶點(diǎn)及丹參在心肝胰肺腎的最高表達(dá)分布數(shù)據(jù)，構(gòu)建丹參靶點(diǎn)在心肝胰肺腎的蛋白表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)cytoscape軟件進(jìn)行可視化。

1.4 丹參治療糖尿病神經(jīng)病變靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將丹參相關(guān)靶點(diǎn)間相互關(guān)系、化合物與靶點(diǎn)相互關(guān)系文件整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建丹參靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)Network Analysis功能，以degree>30篩選出丹參的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 丹參化學(xué)成分治療糖尿病神經(jīng)病變關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO及KEGG通路分析將丹參治療糖尿病神經(jīng)病變關(guān)鍵靶點(diǎn)通過(guò)R軟件的clusterProfiler[14]程序包進(jìn)行GO及KEGG富集分析，篩選有關(guān)通路，剔除無(wú)關(guān)通路；根據(jù)靶點(diǎn)在通路的富集定位，整合所有通路，構(gòu)建丹參治療糖尿病神經(jīng)病變靶點(diǎn)通路圖。

2 結(jié)果

2.1 丹參成分及其對(duì)應(yīng)靶蛋白的收集與篩選以O(shè)B>30，DL>0.2作為篩選條件檢索 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到丹參有效成分36個(gè)，見表1。

表1 丹參活性化合物基本信息

2.2 基因表達(dá)定位分析通過(guò)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)36個(gè)化合物成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)；以Norm Fit>0.7作為篩選條件，最后成功注釋得到147個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)string構(gòu)建靶點(diǎn)PPI，以結(jié)合系數(shù)>0.4作為條件篩選得到靶點(diǎn)133個(gè)，通過(guò)BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)查找133個(gè)基因靶點(diǎn)在心肝胰肺腎等器官的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)54個(gè)基因在心臟表達(dá)最高，35個(gè)基因在肝臟表達(dá)最高，這與丹參的歸經(jīng)“心肝”基本相符。129個(gè)基因與糖尿病神經(jīng)病變相關(guān)，在心肝胰肺腎等器官均有表達(dá)，這也表明糖尿病神經(jīng)病變是一個(gè)系統(tǒng)性疾病，病變涉及多個(gè)臟腑。見圖1。

圖1 “丹參-活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)-器官”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 “丹參-活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析通過(guò)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索糖尿病神經(jīng)病變疾病靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)丹參治療糖尿病神經(jīng)病變靶點(diǎn)129個(gè)；以丹參活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，構(gòu)建“丹參活性成分-靶點(diǎn)”預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)；該網(wǎng)絡(luò)包含171個(gè)節(jié)點(diǎn)及2 664條邊，平均度數(shù)15.58，以degree>30作為篩選條件得到丹參治療糖尿病神經(jīng)病變關(guān)鍵靶點(diǎn)32個(gè)。見圖2。

圖2 丹參“活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)”的相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集分析將32個(gè)丹參治療糖尿病神經(jīng)病變關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，以P<0.05進(jìn)行篩選，得到與丹參治療糖尿病神經(jīng)病變相關(guān)的生物功能條目33條，主要涉及蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、酶激活劑活性、MAP激酶活性、MAP激酶活性、氧化還原酶活性、核受體活性等相關(guān)生物功能。見表2。

表2 丹參治療糖尿病神經(jīng)病變GO富集分析數(shù)據(jù)表

2.5 KEGG富集分析將32個(gè)丹參治療糖尿病神經(jīng)病變關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，以P<0.05進(jìn)行篩選，剔除無(wú)關(guān)通路后得到與丹參治療糖尿病神經(jīng)病變相關(guān)的信號(hào)通路23條，主要包括VEGF信號(hào)通路、Sphingolipid信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路。靶點(diǎn)在通路上的富集結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路富集的靶點(diǎn)最多，以這3條通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的可行性高，見表3。

表3 丹參治療糖尿病神經(jīng)病變KEGG富集分析數(shù)據(jù)表

3 討論

隨著社會(huì)生活習(xí)慣、作息飲食習(xí)慣的改變，糖尿病發(fā)病率逐年上升。有數(shù)據(jù)表明，2016年全球糖尿病患者總數(shù)約3.82 億[15]，2013 年我國(guó)糖尿病發(fā)病率已達(dá)到 10.4%[16]。糖尿病神經(jīng)病變?yōu)樘悄虿〕Ｒ姴l(fā)癥，其中糖尿病周圍神經(jīng)病變最為常見。糖尿病周圍神經(jīng)病變患者常出現(xiàn)肢體麻木、疼痛，并伴有感覺和運(yùn)動(dòng)障礙，這不僅嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，而且對(duì)社會(huì)和家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)。因此，早期積極防治糖尿病神經(jīng)病變具有重要的意義?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療糖尿病神經(jīng)病變主要以控制血糖、改善循環(huán)和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)為主，雖然可以改善癥狀，緩解疼痛，但是未能根治糖尿病神經(jīng)病變[17]。

黃東輝等[18]發(fā)現(xiàn)丹參水提物可顯著提高糖尿病大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度、恢復(fù)神經(jīng)功能，且丹參注射液對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的治療效果也已經(jīng)得到循證醫(yī)學(xué)的證明[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，丹參多酚酸鹽可提高糖尿病周圍神經(jīng)病變療效，降低糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的炎性因子水平，提高周圍神經(jīng)傳導(dǎo)速度，且無(wú)明顯不良反應(yīng)[20-21]。韋凌云等[22]還發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽能改善血管內(nèi)皮功能。陳月嬋[23]研究發(fā)現(xiàn)丹參酮-ⅡA與甲鈷胺聯(lián)合有效降低血液黏稠度，改善微循環(huán)，而這可能與背根神經(jīng)節(jié)過(guò)度興奮及鈉通道蛋白表達(dá)的干預(yù)有關(guān)[24]。這些研究結(jié)果均顯示丹參對(duì)于糖尿病神經(jīng)病變具有確切療效。

糖尿病神經(jīng)病變病機(jī)復(fù)雜，其病變涉及多個(gè)臟腑、多種病機(jī)途徑及多條信號(hào)通路。目前雖然已經(jīng)有大量研究肯定了丹參對(duì)糖尿病神經(jīng)病變的治療作用，但丹參中包含化合物眾多，涉及多個(gè)靶點(diǎn)，要想明確丹參治療糖尿病神經(jīng)病變的機(jī)制就顯得困難重重。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)分析大數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行藥物研究的新模式[25-26]，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，可以預(yù)測(cè)丹參治療糖尿病神經(jīng)病變的靶點(diǎn)以及機(jī)制，從而指導(dǎo)丹參治療糖尿病神經(jīng)病變的研究方向。本研究通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)、PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，收集丹參藥物成分及靶點(diǎn)相關(guān)信息，最后通過(guò)Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行可視化處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參具有多成分多靶點(diǎn)特性，丹參133個(gè)基因靶點(diǎn)在心肝胰肺腎等器官的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)54個(gè)基因在心臟表達(dá)最高，35個(gè)基因在肝臟表達(dá)最高，這與丹參的歸經(jīng)心肝基本相符。129個(gè)基因與糖尿病神經(jīng)病變相關(guān)，在心肝胰肺腎等器官均有表達(dá)，這也表明糖尿病神經(jīng)病變是系統(tǒng)性疾病，病變涉及多個(gè)臟腑。富集分析結(jié)果顯示，丹參治療糖尿病神經(jīng)病變涉及的信號(hào)通路23條，其中 FoxO 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路富集的靶點(diǎn)最多，提示丹參發(fā)揮作用主要與這3條通路有關(guān)，GO富集分析的結(jié)果也進(jìn)一步支撐了這個(gè)結(jié)論。目前最新研究也表明，MAPK信號(hào)通路[27-29]、PI3K-Akt信號(hào)通路及FoxO 信號(hào)通路[30]與糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病密切相關(guān)，這也從反面驗(yàn)證了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。表明本研究結(jié)果可以為后續(xù)從丹參中提取有效藥物成分治療糖尿病神經(jīng)病變提供重要依據(jù)，而這也將對(duì)未來(lái)論證中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的科學(xué)性提供有價(jià)值的參考。