低等生物谷氨酸脫氫酶基因用于作物遺傳改良的研究進(jìn)展

龔茵茵，燕 璐，林建中，劉選明

(湖南大學(xué)生物學(xué)院植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410082)

氮是氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、植物激素、葉綠素的重要組分，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。植物的氮源主要來(lái)自土壤中的有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮，而有機(jī)含氮化合物大多數(shù)不是水溶性的，通常不能直接被利用，只有氨基酸、酰胺和尿素等水溶性的有機(jī)氮化合物能夠被吸收[1]。因此，以銨鹽(NH4+)和硝酸鹽(NO3-)為主要形式的無(wú)機(jī)氮是植物最主要的氮來(lái)源[2]。植物通過(guò)其特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞綄H4+和NO3-等礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素吸入體內(nèi)。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物根據(jù)環(huán)境和自身需求的不同，形成了對(duì)氮具有不同親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制[3]。另外，在不同的植物以及植物的不同生長(zhǎng)階段，其對(duì)NH4+和NO3－的需求比例也不同。例如，水稻以吸收NH4+為主，且在幼穗分化期是氮的吸收高峰[4]。植物吸收的NH4+可直接參與合成氨基酸，但吸收的NO3－必須經(jīng)過(guò)代謝還原轉(zhuǎn)變?yōu)镹H4+才能被利用[5]。因此，NH4+相對(duì)于NO3－在植物氮的同化利用中更有優(yōu)勢(shì)，研究植物體內(nèi)NH4+的同化過(guò)程并提高其同化利用效率的工作意義重大。

在高等植物體內(nèi)，NH4+的同化一般認(rèn)為有兩條途徑:一條是NH4+由谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS；EC 6.3.1.2)/谷氨酸合成酶(glutamate synthase，GOGAT；EC 1.4.7.1)循環(huán)途徑合成谷氨酰胺(glutamine，Gln)；另一條途徑是 NH4+與 α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，2-OG)通過(guò)谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH；EC 1.4.1.2～4)的作用生成谷氨酸(glutamate，Glu)[6](圖1)。在高等植物中，由于GDH對(duì)NH4+的親和力較低，因此GS/GOGAT途徑是其N(xiāo)H4+同化的主要途徑，GDH途徑僅為輔助性支路途徑[2]。然而讓人驚訝的是，在低等生物(如細(xì)菌、真菌和低等藻類(lèi))中，其GDH對(duì)NH4+的親和力很高，在NH4+的同化中發(fā)揮著重要作用[7]。

圖1 植物氨同化代謝途徑GDH:谷氨酸脫氫酶；GS:谷氨酰胺合成酶；GOGAT:谷氨酸合成酶；TCA:三羧酸循環(huán)。Fig.1 Ammonia assimilation pathway in plantsGDH，glutamate dehydrogenase；GS，glutamine synthetase；GOGAT，glutamate synthase；TCA，tricarboxylic acid cycle.

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，原有物種間的生殖隔離已被打破，外源基因的轉(zhuǎn)入成為可能。直接在基因水平進(jìn)行植物的定向遺傳改造和功能研究，不僅發(fā)掘和鑒定了大量?jī)?yōu)質(zhì)基因，解析了其內(nèi)在的生理和分子機(jī)理，而且為作物的遺傳育種提供了基因資源和理論指導(dǎo)。因此，將任意來(lái)源的優(yōu)質(zhì)基因轉(zhuǎn)入作物以定向遺傳改造，為作物的遺傳性狀改良和優(yōu)良材料(品種)創(chuàng)制提供了新的思路和技術(shù)手段。由于低等生物的GDH對(duì)NH4+的親和力顯著高于高等植物，研究者們利用基因工程手段在作物中異源表達(dá)低等生物的GDH基因，提高作物的氮素利用率，以培育在低氮栽培條件下能夠高產(chǎn)或穩(wěn)產(chǎn)的作物新品種。其中一些作物新品種的耐逆性和品質(zhì)由于低等生物GDH基因的轉(zhuǎn)入被顯著提高。本文對(duì)近年來(lái)在作物中異源表達(dá)低等生物GDH基因的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，并對(duì)該領(lǐng)域后續(xù)相關(guān)研究提出了進(jìn)一步的展望。

1 GDH的生化特性

GDH是生物界中廣泛存在的一種多聚酶。目前已知的GDH可分為六聚體和四聚體兩大類(lèi)。六聚體GDH分布極為廣泛，在細(xì)菌、真菌、高等動(dòng)植物中均有報(bào)道，而四聚體GDH僅發(fā)現(xiàn)于幾種酵母中。植物體內(nèi)的GDH以六聚體的形式存在，由α、β 亞基組成，共有 6α、5α:1β、4α:2β、3α:3β、2α:4β、1α:5β和6β等7種同工酶[8]。在NAD(P)H作為輔助因子的情況下，GDH催化2-OG與NH4+的可逆氨化生成Glu的反應(yīng):2-OG+NAD(P)H+NH4++H+?L-Glu+NAD(P)++H2O[9]。GDH因輔酶不同而分為NAD(H)依賴(lài)型GDH[NAD(H)-GDH；EC 1.4.1.2]和 NADP(H)依賴(lài)型 GDH[NADP(H)-GDH；EC 1.4.1.4]。NAD(H)-GDH主要存在于線粒體，在細(xì)胞質(zhì)中也有發(fā)現(xiàn)[8]，而NADP(H)-GDH存在于線粒體和葉綠體[6]。水稻中共有4個(gè)GDH基因(OsGDH1、OsGDH2、OsGDH3 和 OsGDH4)，除 OsGDH4 編碼的蛋白質(zhì)屬于NADP(H)-GDH外，其余基因編碼的蛋白質(zhì)均屬于NAD(H)-GDH型[10]。

在高等植物中，GDH和GS都是最初同化NH4+的酶，但是GDH對(duì)NH4+的親和力比GS低，說(shuō)明GDH只有在NH4+濃度較高時(shí)才能將其同化為谷氨酸[11]。因此，高等植物對(duì)NH4+的同化以GS/GOGAT途徑為主，而GDH途徑僅起輔助作用(圖1)。不同于高等植物，在低等生物中，GDH對(duì)NH4+的親和力較高[12]。例如，水稻OsGDH4對(duì)NH4+的米氏常數(shù)(Km)為(12.43±1.84)mmol/L，而稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的 MgGDH 對(duì) NH4+的 Km為(0.67±0.05)mmol/L[10]，鮑魚(yú)菇(Pleurotus cystidiosus)的Pc-GDH 對(duì) NH4+的 Km為(3.73±0.23)mmol/L[13]。由此說(shuō)明，低等生物GDH在NH4+的同化過(guò)程中起著重要作用，可以在較低濃度時(shí)順利同化NH4+，其N(xiāo)H4+的同化效率顯著大于高等植物GDH。因此，近年來(lái)將低等生物GDH基因用于改良作物對(duì)NH4+的同化效率備受關(guān)注。然而比較遺憾的是，導(dǎo)致高等植物和低等生物GDH對(duì)NH4+親和力有如此大差異的具體機(jī)制沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

2 GDH的生理功能

碳和氮是植物所必需的元素，植物在生長(zhǎng)過(guò)程中需要維持碳氮代謝的平衡，而2-OG是一種連接碳氮代謝的重要中間產(chǎn)物[14]。由于GDH可催化2-OG和NH4+的還原氨化生成谷氨酸，同時(shí)也可將谷氨酸氧化脫氨生成2-OG和NH4+(圖1)，因此GDH在維持碳氮代謝平衡中發(fā)揮重要作用。另外，GDH還參與了光呼吸過(guò)程中NH4+的回收利用，以及逆境脅迫下細(xì)胞內(nèi)過(guò)量積累NH4+的同化。

2.1 GDH在維持碳氮代謝平衡中的作用

碳氮代謝聯(lián)系密切，碳代謝為氮代謝提供代謝需要的碳源和能量，而氮代謝同時(shí)又為碳代謝提供酶和光合色素[15～16]。兩者協(xié)調(diào)程度不僅影響植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，而且很大程度上決定干物質(zhì)的積累量。在GDH催化的氨同化反應(yīng)中，碳骨架2-OG和還原力NAD(P)H都需要碳代謝來(lái)提供，而GDH能夠提高氮同化能力，進(jìn)而增加酶及葉綠素的量，間接影響碳同化。因此，GDH在維持碳氮代謝平衡中起著重要作用。目前，普遍認(rèn)為GDH具有雙重功能:當(dāng)外部環(huán)境含有過(guò)量無(wú)機(jī)氮源時(shí)，GDH行使NH4+的同化功能；當(dāng)植物缺少有機(jī)碳源時(shí)，如處于黑暗而不能進(jìn)行光合作用，GDH通過(guò)脫氨作用分解谷氨酸產(chǎn)生2-OG，為三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)提供碳骨架[17]。Stewart等[18]報(bào)道，玉米GDH通過(guò)催化氧化脫氨作用，將谷氨酸分解為2-OG和NH4+，在蛋白質(zhì)水解釋放氮的再循環(huán)中起著重要作用。在種子萌發(fā)和組織衰老等碳源受限的情況下，細(xì)胞需要通過(guò)蛋白質(zhì)的水解維持碳氮平衡。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的氨基酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用轉(zhuǎn)化為谷氨酸，谷氨酸經(jīng)脫氨作用生成2-OG參與碳循環(huán)。此外，在胺酰轉(zhuǎn)化成為谷氨酰胺和天門(mén)冬酰胺的過(guò)程中也有GDH的參與。Melo-Oliveira等[19]發(fā)現(xiàn)，擬南芥在黑暗或碳源(蔗糖)供給受限時(shí)GDH1的mRNA大量積累，而光照或添加蔗糖則會(huì)抑制GDH1的mRNA積累；在光照條件下生長(zhǎng)的植株，其葉片GDH1的mRNA維持在較低水平，但用NH4+處理可以誘導(dǎo)其增加，表明GDH在碳氮代謝平衡中起著重要的調(diào)控作用。

2.2 GDH在光呼吸中的作用

在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，光呼吸與光合作用相伴而生。與光合作用相反，光呼吸在吸收O2的同時(shí)釋放CO2，是植物體內(nèi)僅次于光合作用的代謝流[20]。光呼吸是發(fā)生在葉綠體、過(guò)氧化物酶體和線粒體等3個(gè)不同細(xì)胞器中的代謝循環(huán)，參與了植物的能量代謝和碳氮代謝，包括一些復(fù)雜的初級(jí)代謝網(wǎng)絡(luò)，如光合作用、氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)(TCA)和卡爾文循環(huán)(Calvin cycle)等[21]。C3植物的光呼吸實(shí)際上是乙醇酸代謝途徑，在葉綠體中形成的乙醇酸轉(zhuǎn)至過(guò)氧化物酶體，經(jīng)乙醇酸氧化酶催化，被氧化成乙醛酸和H2O2，后者由過(guò)氧化氫酶催化分解成H2O和O2。乙醛酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶作用變成甘氨酸，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。在線粒體中，2分子甘氨酸發(fā)生氧化脫羧和羥甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?分子絲氨酸，并產(chǎn)生NADH和NH3，釋放出CO2。絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)回過(guò)氧化物酶體，并與乙醛酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨作用，形成羥基丙酮酸，后者在甘油酸脫氫酶作用下還原為甘油酸。最后，甘油酸回至葉綠體，在甘油酸激酶的作用下生成3-磷酸甘油酸，進(jìn)入卡爾文循環(huán)，經(jīng)過(guò)一連串復(fù)雜的反應(yīng)后再生成核酮糖-1，5-二磷酸，重復(fù)下一次C2循環(huán)[22]。在光呼吸過(guò)程中，線粒體中經(jīng)甘氨酸脫羧酶催化產(chǎn)生的CO2和NH3，在葉綠體中分別被核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase-oxygenase，Rubisco)和 GS/GOGAT 途徑重新固定和利用[23]。在高等植物中，目前認(rèn)為葉綠體對(duì)NH4+最初的同化是由質(zhì)體谷氨酰胺合成酶(GS2)/鐵氧還蛋白依賴(lài)型GOGAT(Fd-GOGAT)途徑來(lái)完成的，GDH起著補(bǔ)充和輔助的作用[24]。當(dāng)葉綠體中的GS2/Fd-GOGAT途徑受到抑制時(shí)，GDH則參與對(duì)NH4+的再固定和利用[25]。由于線粒體中的甘氨酸氧化脫羧基過(guò)程會(huì)積累大量的NH4+，而GDH可以同化NH4+并解除細(xì)胞內(nèi)氨毒害，我們推測(cè)GDH在植物光呼吸中也具有重要功能。然而比較遺憾的是，GDH在植物光呼吸中的作用研究較少，其具體功能及調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

2.3 GDH在逆境響應(yīng)中的作用

植物不可避免地會(huì)遭受到各種不良環(huán)境脅迫，其中多種不利環(huán)境因素(如高溫、低溫、干旱、高鹽和病蟲(chóng)害等)會(huì)嚴(yán)重威脅植物的正常生長(zhǎng)，這導(dǎo)致一些重要糧食和經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量受損[26]。當(dāng)處于逆境脅迫條件下時(shí)，植物會(huì)啟動(dòng)一系列生理生化機(jī)制來(lái)響應(yīng)各種環(huán)境脅迫，如:增強(qiáng)蛋白水解酶活性；促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解；增加胞內(nèi)小分子物質(zhì)含量；提高胞內(nèi)滲透壓，從而增強(qiáng)脅迫耐受力。其中，蛋白質(zhì)降解過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的NH4+，而NH4+積累會(huì)引起細(xì)胞毒害，因此提高細(xì)胞內(nèi)NH4+的同化能力是減輕脅迫后果的一個(gè)脅迫應(yīng)對(duì)機(jī)制[27～28]。GDH雖然可催化還原氨化和氧化脫氨的可逆反應(yīng)，但是在非正常生長(zhǎng)條件下，GDH更趨向于催化還原氨化(即氨同化)反應(yīng)[29]。有研究證明，在衰老的葉片中GS和GOGAT的含量減少而GDH積累，并且GDH的活性大大提高[30～31]。與此相一致，在鹽脅迫條件下，與鹽敏感水稻品種相比，耐鹽水稻GDH的氨同化活性更高[32]。在耐銨鹽豌豆品種Pisum sativum中，根部GDH的氨化活性也顯著高于對(duì)照組[33]。大量研究結(jié)果表明，在逆境條件下植物細(xì)胞中GDH的氨同化活性增強(qiáng)，從而可以將細(xì)胞內(nèi)因蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的過(guò)量NH4+同化為谷氨酸，有效緩解或消除植物體內(nèi)的毒害作用，增強(qiáng)植物的耐逆性[14]。因此，GDH也被認(rèn)為是植物體內(nèi)的一種逆境響應(yīng)酶，參與了逆境脅迫或胞內(nèi)高NH4+條件下植物體內(nèi)過(guò)量NH4+的再次同化[14]。另外，脯氨酸的積累在植物非生物脅迫響應(yīng)和滲透調(diào)節(jié)中起著重要作用[34]，而谷氨酸是脯氨酸生物合成途徑中的主要前體[35]。在脅迫條件下，GDH催化2-OG和NH4+形成谷氨酸，從而促進(jìn)脯氨酸的合成，既減少了細(xì)胞內(nèi)NH4+的積累，又增加了脯氨酸的含量，從而顯著增強(qiáng)了植物的耐逆性[34]。GDH的氨同化能力使得其在植物逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用，其氨同化能力的大小與植物的耐逆性呈正相關(guān)。有意思的是，Toyota等[36]報(bào)道，谷氨酸在擬南芥中作為一種受傷信號(hào)分子迅速啟動(dòng)植物的防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)下游參與防御反應(yīng)的基因表達(dá)。GDH作為催化谷氨酸合成的重要酶類(lèi)，肯定也會(huì)參與該防御反應(yīng)的調(diào)控，但是其具體機(jī)制仍鮮見(jiàn)報(bào)道。

3 低等生物GDH基因在作物遺傳改良中的應(yīng)用

在高等植物中，盡管GDH在碳氮代謝平衡、光呼吸和逆境響應(yīng)等生理功能中起著重要作用，但是對(duì)NH4+的親和力較低使得其始終處于GS/GOGAT途徑的補(bǔ)充和輔助地位。與之相反，在低等生物中，GDH對(duì)NH4+的親和力較高，其氨同化能力顯著高于高等植物GDH。因此，近年來(lái)借助基因工程手段將外源的低等生物GDH基因異源表達(dá)于作物以改良其性狀的研究越來(lái)越受到關(guān)注。目前，在作物遺傳改良中研究者主要利用了低等生物GDH對(duì)NH4+的高親和力和高同化效率特性，其相關(guān)研究和探索主要集中在提高作物的氮素利用率和非生物脅迫耐受性，以及改良作物品質(zhì)等方面(表1)。需要特別說(shuō)明的是，雖然GDH在生物體中能同時(shí)可逆催化谷氨酸的合成和分解，但是NADP(H)-GDH主要催化谷氨酸的合成，而NAD(H)-GDH則主要催化谷氨酸的分解[13，37]。因此，用于作物遺傳改良的低等生物GDH主要為NADP(H)-GDH，其本質(zhì)是提高作物體內(nèi)的氨同化效率。

3.1 低等生物GDH基因用于提高作物氮素利用率

低等生物GDH對(duì)NH4+的親和力顯著高于高等植物GDH。例如，目前已知真菌GDH對(duì)NH4+的 Km為 0.2～4.5 mmol/L[10，12]，而已知高等植物GDH對(duì)NH4+的Km為10～80 mmol/L[38]。與高等植物相比，低等生物GDH對(duì)氮素(主要為NH4+)的利用率更高，這意味著在低濃度條件下其仍能正常同化環(huán)境中的NH4+。因此，近年來(lái)許多低等生物GDH基因被異源表達(dá)于作物以提高氮素利用效率，用于培育低氮肥需求而高產(chǎn)或穩(wěn)產(chǎn)的遺傳改良新材料(品種)。細(xì)菌GDH基因是最早用于提高作物氮肥利用率的外源基因。1999年，Lightfoot等[39]將大腸桿菌(Escherichia coli)的gdhA基因異源表達(dá)于煙草中，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因植株的氮素利用效率顯著提高。王芳等[40]將中間脈孢霉(Neurospora intermedia)的NiGDH基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因煙草能在低氮條件下正常生長(zhǎng)。黃國(guó)存等[41]將小球藻(Chlorella sorokiniana)的NADP(H)-GDH基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因煙草在低氮培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度和葉片數(shù)明顯高于對(duì)照。Egami等[42]將構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的NADP(H)-GDH基因gdhA過(guò)量表達(dá)于馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)在低氮條件下其轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖的碳和氮含量增加，且gdhA的過(guò)量表達(dá)能顯著增加塊莖干物質(zhì)，并能提高馬鈴薯的氮素利用效率。

對(duì)起源于沼澤地的重要糧食作物水稻來(lái)說(shuō)，其吸收和同化的氮素主要為NH4+，因此近年來(lái)將真菌GDH基因用于改良水稻氮素利用效率成為研究熱點(diǎn)。2010年，Abiko等[43]首次將黑曲霉(Aspergillus niger)的gdhA基因過(guò)量表達(dá)于水稻中，其轉(zhuǎn)基因株系的氮素利用率顯著提高，干重、含氮量和籽粒產(chǎn)量在正常栽培條件下均顯著提高，但是在低氮條件下并沒(méi)有明顯改善。隨后，我們研究組將埃倫柱孢(Cylindrocarpon ehrenbergii)的Ce-GDH基因轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因株系能顯著提高NH4+的同化效率，并提高在低氮栽培條件下的有效分蘗數(shù)、有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量[37]；同樣，分別將謝瓦散囊菌(Eurotium cheralieri)的EcGDH基因[44]和毛束霉屬(Trichurus)的TrGDH基因[45]轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)EcGDH和TrGDH轉(zhuǎn)基因水稻株系的NH4+同化效率顯著提高，苗期的濕重、干重和氮含量也均顯著提高，尤其在低氮栽培條件下的有效穗數(shù)、千粒重和單株產(chǎn)量均顯著高于未轉(zhuǎn)化對(duì)照。另外，我們還將蕓薹生鏈格孢菌(Alternaria brassicicola)的AbGDH基因轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因株系的氮素利用效率顯著提高，在低氮水培條件下其幼苗的生長(zhǎng)得到顯著改善，濕重和干重也顯著提高，遺憾的是沒(méi)有測(cè)定其成熟期的農(nóng)藝性狀[11]。此外，我們將鮑魚(yú)菇(P.cystidiosus)的PcGDH基因轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因株系的氮素利用效率提高明顯，在低氮水培條件下的幼苗生長(zhǎng)良好，但是在低氮栽培中并沒(méi)有顯著改善其產(chǎn)量[13]?？傊?，低等生物GDH基因確實(shí)能夠提高作物的氮素利用效率，有些GDH基因還能夠提高低氮栽培條件下的作物產(chǎn)量，具有良好的應(yīng)用前景。值得注意的是，并不是所有異源表達(dá)的低等生物GDH基因均能提高作物產(chǎn)量，這可能與該GDH基因的來(lái)源物種及其所編碼蛋白質(zhì)本身的理化性質(zhì)有關(guān)。

3.2 低等生物GDH基因用于提高作物耐逆性

植物在逆境脅迫下會(huì)增強(qiáng)蛋白水解酶活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解而產(chǎn)生大量NH4+。如果積累的過(guò)量NH4+不能得到及時(shí)清除，將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞內(nèi)氨毒害[27～28]。GDH被認(rèn)為是植物體內(nèi)的一種逆境響應(yīng)酶，可通過(guò)同化脅迫下產(chǎn)生的過(guò)量NH4+而解除細(xì)胞內(nèi)的氨毒害[14]。由于低等生物GDH同化NH4+的效率比高等植物內(nèi)源GDH更高，因此低等生物GDH基因也被用于改良作物的耐逆性。Nolte等[46]將大腸桿菌(E.coli)的gdhA基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因植株能夠提高對(duì)除草劑草銨膦(phosphinothricin)的耐受性。后來(lái)，Lightfoot等[47]將該gdhA基因轉(zhuǎn)入玉米，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因植株在明顯缺水季節(jié)里的萌發(fā)率和生物產(chǎn)量均高于未轉(zhuǎn)化對(duì)照，說(shuō)明其耐旱性顯著增強(qiáng)。我們研究組將核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)的SsGDH基因轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因株系的NH4+同化效率顯著提高，同時(shí)也提高了對(duì)除草劑草銨膦的耐受性。但讓人意外的是，在正常水培條件下SsGDH轉(zhuǎn)基因幼苗的生長(zhǎng)被顯著抑制，苗長(zhǎng)、濕重和干重均比未轉(zhuǎn)化對(duì)照顯著降低[12]。同樣，我們將稻瘟病菌(M.grisea)的MgGDH基因轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因株系的耐旱性顯著增強(qiáng)。在干旱脅迫條件下，MgGDH轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)NH4+的含量顯著低于未轉(zhuǎn)化對(duì)照，小分子物質(zhì)如脯氨酸和可溶性糖的含量也顯著升高[10]。該結(jié)果說(shuō)明，外源MgGDH能有效消除水稻體內(nèi)的氨毒害，同時(shí)積累的脯氨酸和可溶性糖也提供了一定程度的滲透保護(hù)，從而提高了水稻的耐旱性。值得指出的是，我們發(fā)現(xiàn)只有少部分真菌的GDH基因能有效改良作物的抗逆性。例如，EcGDH轉(zhuǎn)基因水稻的耐旱性雖然比未轉(zhuǎn)化對(duì)照有所提高，但是低于MgGDH轉(zhuǎn)基因水稻。最近，谷氨酸被發(fā)現(xiàn)可以作為一種受傷信號(hào)分子啟動(dòng)植物的防御反應(yīng)，使植物逃避傷害或驅(qū)趕植食性昆蟲(chóng)[36]。其實(shí)，在低等生物GDH轉(zhuǎn)基因作物中有大量谷氨酸累積，其對(duì)作物生物脅迫抗性的影響是一個(gè)非常有趣的研究點(diǎn)。遺憾的是，迄今尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

3.3 低等生物GDH基因用于改良作物的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)

由于低等生物GDH對(duì)NH4+的同化效率比高等植物更高，所以其不僅能將更多NH4+同化固定于谷氨酸，而且谷氨酸還可將其獲得的NH4+用于其他氨基酸和蛋白質(zhì)的合成。另外，用于作物遺傳改良的低等生物GDH主要為NADP(H)-GDH，在細(xì)胞中主要催化2-OG和NH4+形成谷氨酸，從而使遺傳改良作物中的總氮含量顯著提高。因此，低等生物GDH轉(zhuǎn)基因作物在提高氮素利用效率的同時(shí)，還可促進(jìn)組織器官中谷氨酸、其他氨基酸以及蛋白質(zhì)含量的顯著提高，從而提高作物的氨基酸和蛋白質(zhì)含量，改善作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。Kisaka等[48]將構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)的gdhA基因過(guò)量表達(dá)于番茄，使得果實(shí)中游離氨基酸總量比未轉(zhuǎn)化對(duì)照高2～3倍。后來(lái)，Egami等[42]將該gdhA基因過(guò)量表達(dá)于馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)gdhA轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片在開(kāi)花期的光合作用速率和可溶性蛋白質(zhì)濃度都會(huì)增加。我們研究組也發(fā)現(xiàn)，真菌GDH轉(zhuǎn)基因水稻在提高氮素同化效率的同時(shí)，其植株中的谷氨酸、游離氨基酸和總氮含量也均顯著增加[10～13，37，44～45]。特別是對(duì)于PcGDH[13]和TrGDH[45]的轉(zhuǎn)基因水稻，不管在低氮還是高氮栽培條件下，種子中的谷蛋白和醇溶蛋白含量均顯著升高。有意思的是，Zhang等[49]直接將黑曲霉(A.niger)的gdhA基因轉(zhuǎn)入飼料稻(forage rice)，用于生產(chǎn)氨基酸和蛋白質(zhì)含量顯著提高的青飼料和谷物飼料。由此可見(jiàn)，低等生物GDH基因可用于作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的改良，特別是可提高作物中氨基酸和蛋白質(zhì)的含量，從而提升其作為食品或飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

氮作為植物生長(zhǎng)所必需的元素，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及作物的產(chǎn)量都十分重要。在高等植物中GS/GOGAT途徑是主要的氮代謝途徑，其相關(guān)機(jī)制研究得比較清晰。然而GDH途徑作為高等植物氮同化的旁路途徑，其參與植物碳氮代謝、光呼吸以及調(diào)控逆境脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制仍然不太清楚，相關(guān)的生理及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，在低等生物GDH基因用于作物的遺傳改良方面，仍然還有以下問(wèn)題需要解決:

1)低等生物GDH用于作物遺傳改良的選擇標(biāo)準(zhǔn)。雖然幾乎所有低等生物GDH均能提高作物的氮素利用效率和總氮含量，但是不一定能在低氮栽培條件下促進(jìn)作物的生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量，有的甚至還會(huì)抑制生長(zhǎng)，而有的卻能提高耐逆性(表1)。那么分子育種工作者該如何選擇合適的低等生物GDH用于特定性狀的遺傳改良呢？根據(jù)我們研究組多年來(lái)的研究結(jié)果初步推測(cè)，GDH在植物中導(dǎo)致不同的表型與其對(duì)NH4+的Km值有關(guān)。當(dāng)GDH的Km值較小時(shí)，其轉(zhuǎn)基因作物的耐逆性增強(qiáng)。如Km為(0.28±0.03)mmol/L的SsGDH能增強(qiáng)水稻對(duì)除草劑草銨膦的耐受性[12]。當(dāng)GDH的Km值較大時(shí)，其對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的耐逆性沒(méi)有顯著的提高。如Km為(3.73±0.23)mmol/L的PcGDH的轉(zhuǎn)基因作物在低氮和高氮栽培中的產(chǎn)量并沒(méi)有明顯的改善[13]。只有當(dāng)GDH的Km值處于合適的區(qū)間時(shí)，其轉(zhuǎn)基因作物在低氮栽培中的產(chǎn)量才會(huì)得到明顯改善。如Km為(1.48±0.11)mmol/L的TrGDH[45]和Km為(2.34±0.21)mmol/L的EcGDH[44]均能提高低氮栽培條件下水稻的產(chǎn)量。當(dāng)然，上述分析都是從受體作物水稻中得到的初步規(guī)律，關(guān)于導(dǎo)致不同表型的GDH臨界Km值還需要進(jìn)一步研究，甚至很有可能在不同受體作物中其臨界Km值也有所不同。

表1 低等生物GDH基因及其遺傳改良作物的表型Table 1 GDHs of lower organisms and phenotypes of their genetically modified crops

2)低等生物GDH對(duì)作物光呼吸的影響。GDH在高等植物光呼吸中的作用研究較少，其具體功能及調(diào)控機(jī)制仍不清楚。目前，僅報(bào)道當(dāng)葉綠體中的GS2/Fd-GOGAT途徑受到抑制時(shí)，GDH才參與對(duì)NH4+的再固定和利用[25]。同樣，低等生物GDH對(duì)作物光呼吸的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。其實(shí)，我們研究組發(fā)現(xiàn)有些低等生物GDH能夠抑制作物的光呼吸，從而提高作物的產(chǎn)量和耐逆性(未發(fā)表的結(jié)果)。因此，我們認(rèn)為作物內(nèi)源GDH和外源低等生物GDH對(duì)作物光呼吸的影響及其作用機(jī)制也將是一個(gè)重要的研究課題。

3)低等生物GDH遺傳改良作物的安全性問(wèn)題。雖然異源表達(dá)低等生物GDH基因可以在一定程度上改善作物的氮素利用效率、耐逆性和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，但是引入外源基因的安全性問(wèn)題還存在著一定的爭(zhēng)議。其實(shí)，除了對(duì)已獲得的低等生物GDH遺傳改良作物進(jìn)行常規(guī)的安全性檢測(cè)和評(píng)價(jià)外，還可以采用基因編輯技術(shù)改變作物本身GDH某些特定氨基酸殘基，以提高其對(duì)NH4+的親和力，從而培育對(duì)環(huán)境友好而安全的高產(chǎn)或穩(wěn)產(chǎn)作物新品種。因此，將來(lái)需要加大高等植物和低等生物GDH氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)對(duì)NH4+親和力影響的比較研究，鑒定決定NH4+親和力的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)、模體(motif)或結(jié)構(gòu)域(domain)，這樣才能采用基因編輯技術(shù)對(duì)作物GDH進(jìn)行有的放矢的改造。

總之，深入研究植物GDH的作用機(jī)制，可以有助于我們更好地理解植物碳氮代謝平衡和逆境脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制，為改良作物的氮素利用效率、耐逆性和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等提供理論指導(dǎo)。同時(shí)，發(fā)掘和鑒定新的低等生物優(yōu)質(zhì)GDH基因能夠?yàn)椴煌魑锾囟ㄐ誀畹倪z傳改良提供豐富的基因資源。