低聚原花青素對過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌損傷的保護(hù)作用機制

周海濤，曹建民，胡 戈，牛衍龍，龔 平，邵芙蓉，張子坤，黃景宣，董愛霞

(1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，中國北京100023；2.北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，中國北京100191；3.北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院，中國北京100084；4.常州大學(xué)，中國江蘇常州213164；5.贛南醫(yī)學(xué)院，中國江西贛州341000)

研究表明，長時程、大強度運動可誘發(fā)過度訓(xùn)練及運動性骨骼肌損傷[1～2]。氧化應(yīng)激是過度訓(xùn)練致骨骼肌損傷及運動能力下降的關(guān)鍵因素[3～4]。絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號系統(tǒng)在機體對環(huán)境應(yīng)激適應(yīng)及維持內(nèi)部環(huán)境氧化/抗氧化動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。其中，p38 MAPK信號與運動及運動引發(fā)和加劇的氧化應(yīng)激及骨骼肌損傷密切相關(guān)[5～6]。研究證實，長時程、大強度運動引發(fā)的過度訓(xùn)練使得機體氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，自由基在體內(nèi)過度堆積，MAPK系統(tǒng)活化，進(jìn)而對骨骼肌功能造成損傷[1，7]。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是蔬菜和水果中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，其低聚物——低聚原花青素(oligomerized proanthocyanidins，OPC)是目前國際上公認(rèn)的天然抗氧化劑，可以高效清除機體內(nèi)過量堆積的自由基，提高抗氧化酶活性，有效地拮抗大強度運動誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，保護(hù)機體結(jié)構(gòu)/功能[8]。但OPC能否通過調(diào)控MAPK信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)預(yù)防和延緩過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌損傷的相關(guān)研究尚未見報道。本研究以42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練建立過度訓(xùn)練致運動性骨骼肌損傷動物模型，期間以O(shè)PC進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)，通過觀察大鼠骨骼肌組織形態(tài)，檢測過度訓(xùn)練和骨骼肌損傷標(biāo)志物及骨骼肌氧化應(yīng)激水平、p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)，探討了OPC改善過度訓(xùn)練致運動性骨骼肌損傷的作用機制，發(fā)現(xiàn)OPC可通過改善氧化應(yīng)激，調(diào)控p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)，保護(hù)過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌結(jié)構(gòu)/功能，這將為運動性骨骼肌損傷的防控提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

65只7周齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級 Wistar大鼠(雄性)源自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，動物生產(chǎn)合格證編號:SCXK(京)2016-0010，平均體重為(250.1±13.9)g。實驗過程中，室內(nèi)溫度保持在(22±2)℃，相對濕度控制在55%～75%，自然光照。所有實驗大鼠均在北京體育大學(xué)SPF級屏障系統(tǒng)(SYXK京2016-033)以基礎(chǔ)飼料[斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，SCXK(京)2019-0010]和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 藥物與試劑

OPC，純度≥95%，低聚體10%～45%(西安通澤生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)羥胺法試劑盒(南京建成生物工程研究所)；3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)、8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)酶聯(lián)免疫試劑盒(上海迪奧生物科技有限公司)；睪酮(testosterone，T)和皮質(zhì)酮(corticosterone，Cor)放射免疫試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)；p38/p-p38 MAPK抗體(Sigma公司，美國)。

OPC以蒸餾水配制為30 mg/mL的溶液，4℃冰箱避光冷藏待用。

1.3 儀器

DSPT-202型動物跑臺(杭州段氏制造廠)，ISO9001型電子天秤(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，NR-B17CC型超低溫冰箱(日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社)，電動組織勻漿器(美國KIMBLE公司)，5417R低溫超速離心機(德國艾本德股份公司)，721紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，MultiSkan3 酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)，r-911全自動放免計數(shù)儀(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實業(yè)總公司)，RT2200C全自動生化分析儀(美國雷杜公司)，LEICA RM2016病理切片機(德國RM公司)，Pannoramic MIDI全自動數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(匈牙利3D HISTECH公司)。

1.4 動物分組

實驗大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后，經(jīng)3 d跑臺訓(xùn)練(5 m/min、20 min/d)進(jìn)行篩選淘汰。將剩余60只大鼠隨機分為3組:安靜對照組(C組，12只)、過度訓(xùn)練組(OM組，24只)、OPC干預(yù)組(OOM組，24 只)。

1.5 過度訓(xùn)練模型建立及營養(yǎng)干預(yù)方案

C組不進(jìn)行任何運動，其他組進(jìn)行42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練以建立過度訓(xùn)練模型。具體方案[9～10]見圖1。各組大鼠每天于訓(xùn)練前1 h灌胃1次。其中，OOM組根據(jù)預(yù)實驗并參考文獻(xiàn)[8]以150 mg/(kg·d)和5 mL/kg的劑量及體積灌胃OPC，其他組灌胃等體積的蒸餾水。

圖1 大鼠跑臺訓(xùn)練方案[9]從第2周開始，每次訓(xùn)練初始速度為10 m/min，每5 min增加5 m/min，直至本周目標(biāo)強度。最后1周訓(xùn)練，大鼠若無法維持目標(biāo)強度，則運動至力竭。Fig.1 Treadmill training program of rats[9]From the second week，the initial speed of each training was 10 m/min，and the speed increased by 5 m/min every 5 min until the target speed of that week was reached.During the last week of training，if the rats could not maintain the target speed，they would exercise to exhaustion.

1.6 取材

受訓(xùn)練強度/頻度、疲勞恢復(fù)等多重因素影響，實驗動物出現(xiàn)意外死亡。實驗結(jié)束時，OM、OOM組大鼠分別剩余11只和14只。

大鼠末次跑臺訓(xùn)練結(jié)束后即刻采用2%戊巴比妥鈉溶液對其進(jìn)行麻醉，腹主動脈放血處死。收集全血5 mL，37℃自然凝固，待血清出現(xiàn)后于冰箱4℃存放24 h。4℃、3 000 r/min離心10 min，分離制備血清，并將其置于-20℃冰箱中保存待測。

分離出大鼠兩側(cè)完整的比目魚肌，以4℃的生理鹽水進(jìn)行漂洗，快速去除血液及其他結(jié)締組織，吸干水份后切取右側(cè)組織300 mg，均勻地分為3份，以錫紙包裹標(biāo)記后裝入密封袋，并立即投入液氮中，隨后放入-80℃超低溫冰箱保存，待測SOD活性以及MDA、3-NT、8-OHdG含量。

切取部分左側(cè)組織，修整為0.5 cm×0.5 cm×1 cm組織塊，置入組織固定液中固定24 h后包埋，切片后用于p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的免疫組化檢測及骨骼肌組織病理變化的HE染色和觀察。

1.7 相關(guān)指標(biāo)檢測

400倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行骨骼肌組織形態(tài)學(xué)觀察。骨骼肌SOD活性采用羥胺法測定，MDA含量采用TBA法測定，3-NT和8-OHdG含量采用酶聯(lián)免疫吸附測試法測定，血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性采用全自動生化分析儀測定，血清T和Cor采用放射免疫法測定。

p38-MAPK及p-p38 MAPK的蛋白質(zhì)表達(dá)水平采用免疫組化法測定:石蠟切片經(jīng)梯度乙醇脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，加入3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，使用牛血清蛋白室溫封閉30 min，加入一抗(稀釋比1︰100)4℃孵育過夜，清洗后加入二抗室溫孵育50 min，再次清洗后采用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，最后脫水封片。采用數(shù)字病理切片掃描儀對每張切片進(jìn)行全視野數(shù)字掃描，細(xì)胞核染色為深棕色、棕黃色、淺黃色和藍(lán)色時分別對應(yīng)強陽性、中度陽性、弱陽性和陰性，對陽性細(xì)胞數(shù)量及染色強度進(jìn)行分析記錄，識別出陽性細(xì)胞面積，應(yīng)用公式計算H-score以便定量分析[11]。H-score=(強陽性細(xì)胞密度×3)+(中度陽性細(xì)胞密度×2)+(弱陽性細(xì)胞密度×1)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 22.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練及OPC干預(yù)對大鼠T/Cor比值的影響

血清T/Cor比值是運動人體科學(xué)領(lǐng)域評價運動負(fù)荷狀況及診斷過度訓(xùn)練的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。為評測過度訓(xùn)練動物模型是否成功建立及OPC的干預(yù)效果，本實驗對各組大鼠血清T及Cor的水平進(jìn)行了檢測。表1顯示:對組間血清T水平而言，OM組較C組極顯著降低(P＜0.01)，OOM組較OM組極顯著升高(P＜0.01)；對組間血清Cor水平而言，OM組較C組極顯著升高(P＜0.01)，OOM組較OM組極顯著降低(P＜0.01)；對組間血清T/Cor比值而言，其變化趨勢與血清T的變化趨勢相一致。從表1數(shù)據(jù)可知，OM組大鼠T/Cor比值較C組下降86.48%，達(dá)到相關(guān)過度訓(xùn)練診斷標(biāo)準(zhǔn)(血清T/Cor比值下降30%以上)[12]，說明本實驗采用的42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練方案成功建立了過度訓(xùn)練模型。同時，OOM組T/Cor比值較OM組大幅提升，但與C組比較其下降幅度仍達(dá)到37.76%，說明OPC干預(yù)在一定程度上可緩解和改善長時程、大強度運動所致過度訓(xùn)練。

表1 運動及OPC干預(yù)對大鼠血清T/Cor水平的影響Table 1 Effects of exercise and OPC intervention on serum T/Cor levels of rats(±s)

表1 運動及OPC干預(yù)對大鼠血清T/Cor水平的影響Table 1 Effects of exercise and OPC intervention on serum T/Cor levels of rats(±s)

注:與C組比較，**表示具有極顯著性差異(P＜0.01)；與OM組比較，##表示具有極顯著性差異(P＜0.01)。Notes:**P＜0.01 vs.C group；##P＜0.01 vs.OM group.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 T/(n g·m L-1)1.7 8±0.7 3 0.4 8±0.1 3**1.2 4±0.6 5##C o r/(n g·m L-1)2 3.7 9±3.9 2 4 5.9 3±6.9 4**3 0.1 3±8.4 0##T/C o r(1 0-2)8.2 1±4.4 2 1.1 1±0.4 5**5.1 1±3.5 8##

2.2 42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練及OPC干預(yù)對大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影響

研究表明，SOD活性可以有效反映機體抗氧化能力[13]；MDA可以敏感地反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平[1]；3-NT和8-OHdG則分別是蛋白質(zhì)和DNA氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物[14]。這些指標(biāo)能夠直接或間接反映骨骼肌氧化損傷程度。為此，本實驗選擇以上指標(biāo)評測6周遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練致過度訓(xùn)練及OPC干預(yù)對大鼠骨骼肌抗氧化應(yīng)激能力的影響。表2顯示:在SOD活性方面，OM組較C組顯著降低(P＜0.05)，OOM 組較 OM 組極顯著升高(P＜0.01)；在MDA、3-NT和8-OHdG含量方面，OM組較C組極顯著升高(P＜0.01)，OOM組較OM組顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。以上數(shù)據(jù)提示:6周遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練誘發(fā)大鼠過度訓(xùn)練的同時導(dǎo)致大鼠骨骼肌出現(xiàn)多層面氧化應(yīng)激損傷；OPC干預(yù)可以有效提升大鼠骨骼肌抗氧化和清除自由基的能力，預(yù)防和延緩氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生與發(fā)展。

表2 運動及OPC干預(yù)對大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影響Table 2 Effects of exercise and OPC intervention on SOD activity and the contents of MDA，3-NT and 8-OHdG in rat skeletal muscle(±s)

表2 運動及OPC干預(yù)對大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影響Table 2 Effects of exercise and OPC intervention on SOD activity and the contents of MDA，3-NT and 8-OHdG in rat skeletal muscle(±s)

注:與C組比較，*表示具有顯著性差異(P＜0.05)，**表示具有極顯著性差異(P＜0.01)；與OM組比較，#表示具有顯著性差異(P＜0.05)，##表示具有極顯著性差異(P＜0.01)。Notes:*P＜0.05，**P＜0.01 vs.C group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs.OM group.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 S O D/(U·m g-1)5 6.5 0±3.1 1 5 3.1 5±2.9 7*6 1.8 5±4.5 9##M D A/(n m o l·m g-1)0.9 0±0.2 1 1.2 5±0.2 2**0.7 4±0.1 4#3-N T/(n m o l·L-1)4 7.7 4±2 1.3 4 8 0.1 2±2 1.0 3**5 8.6 3±2 3.9 1#8-O H d G/(n g·L-1)1 2.1 6±1 3.1 9 3 6.6 4±9.2 8**1 8.1 5±6.1 5##

2.3 42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練及OPC干預(yù)對大鼠骨骼肌p38 MAPK信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

p38 MAPK是MAPK信號系統(tǒng)中重要的信號通路，在保持機體內(nèi)氧化/抗氧化動態(tài)平衡和運動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。運動中肌肉收縮可激活p38 MAPK信號通路，且運動強度與p38 MAPK激活程度呈正相關(guān)[1]。同時，p38 MAPK的活化與過度訓(xùn)練致運動性骨骼肌損傷密切相關(guān)[15]。為此，本實驗檢測了骨骼肌p38 MAPK的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及其磷酸化水平，以評價42 d遞增跑臺訓(xùn)練對骨骼肌的損傷程度及OPC的干預(yù)效果。從表3和圖2的結(jié)果可知，OM組p38 MAPK及其磷酸化水平均顯著高于C組(P＜0.05)，同時OOM組顯著低于OM組(P＜0.05)，說明42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練激活了p38 MAPK信號通路，使p38 MAPK磷酸化水平升高，同時p38 MAPK蛋白過度表達(dá)；OPC干預(yù)可以有效抑制p38 MAPK信號通路的活化并下調(diào)p38 MAPK蛋白的過度表達(dá)。

圖2 各組大鼠骨骼肌p38 MAPK和p-p38 MAPK的表達(dá)情況(免疫組化分析，400×)C:安靜對照組；OM:過度訓(xùn)練組；OOM:OPC干預(yù)組(標(biāo)尺:20 μm)。采用免疫組織化學(xué)(石蠟切片)法檢測p38 MAPK和pp38 MAPK的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。蛋白質(zhì)表達(dá)分析以切片陽性細(xì)胞數(shù)和染色強度為依據(jù)。顯微鏡下視野細(xì)胞核陽性由強至弱依次為深棕色、棕黃色、淺黃色，藍(lán)色為陰性。Fig.2 Expressions of p38 MAPK and p-p38 MAPK in rat skeletal muscle in each group(IHC，400×)C:Control group；OM:Overtraining group；OOM:OPC treatment combined with overtraining group(scale bar:20 μm).Immunohistochemistry analysis(paraffin section)was employed to test the expressions of p38 MAPK and p-p38 MAPK.Analysis of protein expression was based on the number of positive cells and staining intensity in the sections.Under the microscope，the positive nuclei of skeletal muscle cells(from strong to weak)were dark brown，brownish yellow and light yellow，respectively，and the negative ones were stained blue.

表3 運動及OPC干預(yù)對大鼠骨骼肌p38 MAPK/p-p38 MAPK表達(dá)的影響Table 3 Effects of exercise and OPC intervention on p38 MAPK/p-p38 MAPK expressions in rat skeletal muscle(±s)

表3 運動及OPC干預(yù)對大鼠骨骼肌p38 MAPK/p-p38 MAPK表達(dá)的影響Table 3 Effects of exercise and OPC intervention on p38 MAPK/p-p38 MAPK expressions in rat skeletal muscle(±s)

注:與C組比較，*表示具有顯著性差異(P＜0.05)；與OM組比較，#表示具有顯著性差異(P＜0.05)。表4注釋相同。Notes:*P＜0.05 vs.C group；#P＜0.05 vs.OM group.These are same in the Table 4.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 p 3 8 M A P K 1 5 5.0 9±2 5.4 8 2 4 0.6 1±3 3.6 2*1 8 0.5 0±2 6.5 0#p-p 3 8 M A P K 1 0 8.3 7±1 9.7 0 1 5 8.9 4±2 7.5 8*8 6.9 4±2 5.6 4#

2.4 42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練及OPC干預(yù)對大鼠骨骼肌組織形態(tài)的影響

病理診斷是骨骼肌損傷診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。圖3顯示:400倍光鏡下，C組大鼠骨骼肌形態(tài)正常，細(xì)胞核未見腫脹、固縮現(xiàn)象；OM組骨骼肌肌纖維間細(xì)胞增生，大量炎性細(xì)胞浸潤，血管周圍膠原增生嚴(yán)重；OOM組大鼠骨骼肌損傷程度較OM組明顯改善，僅出現(xiàn)輕度炎性細(xì)胞浸潤。上述結(jié)果說明，6周遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練誘發(fā)過度訓(xùn)練的同時引發(fā)大鼠骨骼肌組織形態(tài)出現(xiàn)病理性改變；OPC干預(yù)可以在一定程度上對運動損傷起到預(yù)防和緩解的作用。

圖3 各組大鼠骨骼肌的組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，400×)C:安靜對照組；OM:過度訓(xùn)練組；OOM:OPC干預(yù)組(標(biāo)尺:20 μm)。紅色箭頭:血管周圍膠原增生；黃色箭頭:炎性細(xì)胞浸潤。Fig.3 Pathological changes in skeletal muscle in each group of rats(HE，400×)C:Control group；OM:Overtraining group；OOM:OPC treatment combined with overtraining group(scale bar:20 μm).Red arrow:Perivascular collagen hyperplasia；Yellow arrow:Inflammatory cell infiltration.

2.5 42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練及OPC干預(yù)對大鼠血清CK、LDH活性的影響

體育實踐中，人們常以機體運動后血液循環(huán)系統(tǒng)中CK、LDH等骨骼肌細(xì)胞滲出物濃度來評價骨骼肌損傷程度及機體對運動負(fù)荷適應(yīng)與疲勞恢復(fù)程度[16]。為此，本實驗選用二者評價42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練致過度訓(xùn)練及OPC干預(yù)對骨骼肌損傷程度的影響。表4顯示:在CK活性方面，OM組較C組顯著上升(P＜0.05)，OOM組較OM組顯著下降(P＜0.05)；在LDH活性方面，OM組較C組顯著上升(P＜0.05)，OOM組較OM組呈現(xiàn)下降趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。這說明6周遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練誘發(fā)過度訓(xùn)練的同時導(dǎo)致大鼠骨骼肌損傷；訓(xùn)練期間的OPC干預(yù)可以有效改善和緩解骨骼肌損傷。

表4 運動及OPC干預(yù)對大鼠血清CK和LDH酶活的影響Table 4 Effects of exercise and OPC intervention on serum CK and LDH activities of rats(±s)

表4 運動及OPC干預(yù)對大鼠血清CK和LDH酶活的影響Table 4 Effects of exercise and OPC intervention on serum CK and LDH activities of rats(±s)

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 C K/(U·L-1)5 3 4.3 5±2 7 0.0 4 9 5 0.5 9±8 5.1 1*7 5 9.2 3±1 2 3.6 3#L D H/(U·L-1)1 0 7 3.6 1±2 1 8.2 1 1 7 8 3.3 5±4 2 6.3 2*1 5 0 4.7 2±4 1 3.2 4

3 討論

骨骼肌是機體最直接參與運動的器官，同時也是運動時主要供能和最大的耗能/耗氧器官[17]。研究表明，氧化應(yīng)激是長時程、大強度運動所致骨骼肌損傷的主要發(fā)病因素[1～4]。MAPKs是運動中氧化應(yīng)激主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，p38 MAPK的活化參與了運動應(yīng)激特別是氧化應(yīng)激致骨骼肌損傷的發(fā)生與發(fā)展[6]，運動強度及p38 MAPK活化程度與過度訓(xùn)練致運動性骨骼肌損傷密切相關(guān)[1，6，15]。OPC通過清除體內(nèi)過量堆積的自由基，提高抗氧化酶活性，可以有效地拮抗大強度運動誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[8]，從而保護(hù)骨骼肌結(jié)構(gòu)/功能，但具體作用機制尚不明確。

本實驗采用42 d遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練建立長時程、大強度運動致運動性骨骼肌損傷動物模型。實驗結(jié)果顯示，與C組比較，OM組血清T/Cor比值大幅下降，達(dá)到相關(guān)過度訓(xùn)練診斷標(biāo)準(zhǔn)；骨骼肌組織形態(tài)發(fā)生病理性改變；血清中CK、LDH等骨骼肌損傷標(biāo)志物的活性發(fā)生顯著性變化(P＜0.05)，說明建模成功。此外，OOM組血清T/Cor比值雖然未恢復(fù)到C組的水平，但是較OM組大幅度提升，同時OOM組大鼠骨骼肌組織形態(tài)、血清CK活性較OM組顯著改善，說明訓(xùn)練期間的OPC干預(yù)在一定程度上可改善和緩解長時程、大強度運動所致過度訓(xùn)練及骨骼肌結(jié)構(gòu)/功能損傷。

研究表明，骨骼肌中SOD活性及MDA、3-NT和8-OHdG含量能夠從不同層面直接或間接反映骨骼肌氧化損傷程度[1，13～14]。p38 MAPK 信號通路與運動及其引發(fā)和加劇的氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而過度訓(xùn)練引發(fā)的自由基過量堆積和機體抗氧化能力的下降是p38 MAPK活化和活性增加的重要機制[1，15]。本實驗中，與C組比較，OM組SOD活性顯著降低(P＜0.05)，MDA、3-NT 和 8-OHdG 含量極顯著升高(P＜0.01)，p38 MAPK及其磷酸化水平顯著提高(P＜0.05)，說明過度訓(xùn)練加劇了氧化應(yīng)激反應(yīng)，使自由基過量生成，進(jìn)而激活p38 MAPK信號通路。在Cho等[18]的研究中，可可原花青素通過阻止PC12細(xì)胞中p38 MAPK的活化，抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Jia等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素提取物有助于減輕HLE-B3細(xì)胞中過氧化氫引起的氧化應(yīng)激，并可抑制MAPK信號通路的激活。Kim等[20]的研究認(rèn)為，葡萄籽原花青素提取物可以抑制人類肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)中經(jīng)由白介素-17介導(dǎo)的白介素-6的表達(dá)增多，這一過程是通過抑制p38 MAPK的磷酸化來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，與OM組比較，OOM組SOD活性極顯著升高(P＜0.01)，MDA、3-NT 和 8-OHdG含量顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，p38 MAPK蛋白及其磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。綜合以上信息可知，OPC干預(yù)可能通過有效地提高大鼠骨骼肌中抗氧化酶活性，提升機體抗氧化能力，從而清除長時程、大強度運動過程中過量產(chǎn)生的自由基，延緩或抑制氧化應(yīng)激加劇，緩解其對骨骼肌造成的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及p38 MAPK信號通路蛋白質(zhì)的過度活化和表達(dá)，最終多層面緩解過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌的結(jié)構(gòu)/功能損傷。

4 結(jié)論

在本實驗條件下，OPC可以通過改善氧化應(yīng)激，下調(diào)p38 MAPK/p-p38 MAPK的表達(dá)，保護(hù)過度訓(xùn)練大鼠骨骼肌結(jié)構(gòu)/功能。其具體機制可能是通過多層面、多靶點提升骨骼肌抗氧化能力，緩解長時程、大強度運動過程中過量自由基的產(chǎn)生和堆積，進(jìn)而延緩或抑制氧化應(yīng)激的加劇及p38 MAPK信號通路蛋白質(zhì)的過度活化和表達(dá)。