基于高通量測(cè)序的結(jié)直腸癌組織中環(huán)狀RNA 功能研究與預(yù)后分析

傅中懋，羅 再，戎澤印，章建明，李騰飛，余志龍，黃 陳

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科，上海200080

結(jié)直腸癌是當(dāng)今世界最常見的惡性消化道腫瘤之一，每年新增結(jié)直腸癌患者人數(shù)為185 萬，新增死亡人數(shù)為88 萬［1］。在美國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率與病死率在男性和女性罹患的惡性腫瘤中均排第三［2］。據(jù)我國腫瘤中心登記的數(shù)據(jù)顯示，2015 年結(jié)直腸癌在總新發(fā)腫瘤中發(fā)病率與病死率均排第五［3］。結(jié)直腸由可治愈的局部惡性病變發(fā)展到轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌需要經(jīng)過一個(gè)漫長的時(shí)間窗，因此早期診斷的意義重大。目前，結(jié)直腸癌檢查主要為直腸指診和結(jié)腸鏡檢查。由于侵入式檢查會(huì)給患者帶來不適感，患者往往不愿意定期檢查［4］。計(jì)算機(jī)斷層掃描檢查雖然為非侵入性，但由于其局限于形態(tài)成像，可能會(huì)將殘余糞便誤診為腫瘤而導(dǎo)致假陽性結(jié)果［5］，因此血源性生物標(biāo)志物被認(rèn)為是一種侵入性最小的選擇。近年來，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、CA242 等已被證實(shí)與結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)后相關(guān)［6］。但是這些指標(biāo)的特異性往往有所欠缺，例如在其他惡性腫瘤如卵巢癌、胰腺癌，甚至在良性疾病如炎癥性腸病中，CEA 的水平也會(huì)升高［7］。因此為了改善患者預(yù)后，深入研究結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制，挑選新型生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

隨著二代測(cè)序技術(shù)與生物信息技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）的研究與認(rèn)識(shí)越發(fā)深入。circRNA在哺乳動(dòng)物中普遍存在，作為一種不具有5'端帽子結(jié)構(gòu)和3'端多腺苷酸尾部結(jié)構(gòu)的特殊環(huán)狀閉合RNA，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解［8］。由于circRNA的廣泛性、組織發(fā)育階段特異性、高度保守性等特點(diǎn)，其具有成為新型臨床診斷標(biāo)志物的潛力［9］。circRNA因其在真核生物中所具有的細(xì)胞或組織特異性以及發(fā)育階段特異性，已被證實(shí)參與不同疾病的致病過程［10］。同時(shí)，circRNA 結(jié)構(gòu)特異性決定了其特有的生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)蛋白翻譯、基因轉(zhuǎn)錄等［11］。目前，越來越多的證據(jù)表明circRNA 作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA 在細(xì)胞質(zhì)參與miRNA 結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)，從而在致癌過程中發(fā)揮著重要作用，如circNHSL1 通過miR-1306-3p/SIX1/vimentin 途徑促進(jìn)癌癥進(jìn)程［12］。但是當(dāng)前在結(jié)直腸癌中關(guān)于表達(dá)差異circRNA 的選擇、circRNA 的生物學(xué)功能及其與患者預(yù)后關(guān)系的研究仍很少。

本研究通過對(duì)12 對(duì)結(jié)直腸癌患者的新鮮結(jié)直腸癌組織和癌旁組織進(jìn)行高通量測(cè)序分析，篩選出表達(dá)差異的circRNA 并進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）技術(shù)驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，構(gòu)建circRNA 與微RNA（microRNA，miRNA）、mRNA 的互作網(wǎng)絡(luò)，并初步研究差異表達(dá)的circRNA與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制與新型臨床標(biāo)志物的篩選提供研究基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017 年1 月—2018 年12 月在上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院普外科行結(jié)直腸癌根治術(shù)的12 例患者的癌組織和癌旁組織（距離癌組織>5 cm）用于高通量測(cè)序。收集2015年1月—2017年12月行結(jié)直腸癌根治術(shù)的44 例患者的癌組織和癌旁組織（距離癌組織>5 cm），用于RTqPCR 實(shí)驗(yàn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。②患者病歷資料完整，隨訪數(shù)據(jù)完整。③術(shù)前未經(jīng)過新輔助放射治療和化學(xué)治療。④患者無其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位原發(fā)惡性腫瘤患者。②患者臨床、隨訪資料不完整。組織標(biāo)本取出后即刻放入液氮盒或?80 ℃冰箱保存。研究獲上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件編號(hào)2019SQ274）。所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 circRNA高通量測(cè)序

RNA 高通量測(cè)序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。使用mirVana miRNA （AM1561，中國Ambion）分離試劑盒提取樣品總RNA，用ribo-zero 試劑盒（RS-122-2301，美國Illumina）捕獲并去除核糖體RNA，用RNA 碎片化試劑（AM8740，美國ABI）將RNA 片段化，配置一鏈合成體系通過六堿基隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，隨后在此基礎(chǔ)上配置二鏈合成體系，用上標(biāo)Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶（18064014，美國Invitrogen）增加cDNA 產(chǎn)量，其中dUTP 代替dTTP 合成第二鏈cDNA，用UNG 酶法將富含dUTP 的第一鏈消化，將第二鏈cDNA 進(jìn)行純化，將純化后的cDNA 末端補(bǔ)平，加A 尾修飾和加測(cè)序接頭，qPCR 擴(kuò)增構(gòu)建測(cè)序文庫。將構(gòu)建好的文庫使用安捷倫2100 生物分析儀（5067-1511，美國Aglient）檢測(cè)RNA完整性，RNA 完整性參數(shù)（RIN）≥7 的樣品進(jìn)行后續(xù)分析，在Illumina 測(cè)序平臺(tái)（HiSeq 2500，美國Illumina）對(duì)這些文庫進(jìn)行測(cè)序。最后根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)：基因表達(dá)值倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）>2 或FC

1.3 差異表達(dá)circRNA的功能預(yù)測(cè)分析

1.3.1 差異表達(dá)circRNA GO 富集分析 基因本體（gene ontology，GO）分析主要通過分析細(xì)胞組分、分子功能、生物過程3個(gè)方面來描述基因行使的主要功能。在得到差異表達(dá)的circRNA 后，根據(jù)circRNA 來源基因的GO 功能注釋信息，計(jì)算每個(gè)GO條目中差異表達(dá)的circRNA數(shù)量，超幾何分布檢驗(yàn)差異circRNA 在GO 條目中富集的程度，以P<0.05 為閾值篩選顯著富集的GO 條目，結(jié)合GO 注釋結(jié)果，預(yù)測(cè)差異表達(dá)的circRNA所行使的主要生物學(xué)功能。

1.3.2 差異表達(dá)circRNA KEGG 信號(hào)通路分析 circRNA信號(hào)通路分析主要依賴于京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）公共數(shù)據(jù)庫，通過基因的KEGG 注釋結(jié)果研究疾病信號(hào)通路和轉(zhuǎn)導(dǎo)。在得到差異表達(dá)的circRNA 后，計(jì)算統(tǒng)計(jì)每個(gè)信號(hào)通路中差異circRNA 來源基因的富集程度，根據(jù)P<0.05進(jìn)行KEGG富集通路篩選分析。

1.4 RT-qPCR驗(yàn)證分析

在篩選出的具有表達(dá)差異的circRNA 中各挑選2 個(gè)顯著上調(diào)與顯著下調(diào)的RNA，在44 對(duì)結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證circRNA 含量；其中挑選的上調(diào)的circRNA 為表達(dá)差異倍數(shù)最大前5 中的hsa_circ_0023984 與hsa_circ_0008192，挑選的下調(diào)的circRNA 為表達(dá)差異倍數(shù)最大的hsa_circ_0020093 與hsa_circ_0069922。4 個(gè)circRNA 和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 基因的引物序列如表1 所示。首先使用PrimeScriptTMRT 試劑盒（RR036A，日本TaKaRa） 反轉(zhuǎn)錄500 ng RNA 為cDNA，然后用SYBR?Premix Ex TaqTM（RR820A，日本TakaRa）擴(kuò)增cDNA 進(jìn)行RT-qPCR。將GAPDH 作為內(nèi)部對(duì)照，用公式2-ΔΔCt計(jì)算circRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.5 circRNA-miRNA靶向作用預(yù)測(cè)

挑選上述實(shí)驗(yàn)的差異表達(dá)circRNA， 通過CircInteractome 分析網(wǎng)站挑選具有潛在結(jié)合circRNA 能力的miRNA，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)個(gè)數(shù)及context+score percentile評(píng)分綜合篩選出最優(yōu)的的miRNA。接著通過MicroRNA、TargetScan 與TangetMiner 網(wǎng)站對(duì)篩 選 的miRNA 進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，取3 個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，得到miRNA 靶基因。最后根據(jù)度分析指標(biāo)在Cytoscape 軟件上構(gòu)建circRNAmiRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)。

1.6 患者預(yù)后分析

將表達(dá)上調(diào)的hsa_circ_0023984、hsa_circ_0008192與表達(dá)下調(diào)的hsa_circ_0020093 與hsa_circ_0069922 按照表達(dá)水平高低與44 例結(jié)直腸癌患者臨床資料相匹配，通過分析總生存期（overall survival，OS）研究表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的circRNA與患者預(yù)后之間的聯(lián)系。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)量circRNA 表達(dá)量的RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，最終結(jié)果用x±s 表示。結(jié)直腸癌組與癌旁正常組之間circRNA 表達(dá)水平的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中circRNA的表達(dá)分析

經(jīng)高通量測(cè)序后共檢測(cè)出20 924個(gè)circRNA，其中有9 796個(gè)circRNA 在circBase數(shù)據(jù)庫中，第6對(duì)樣本預(yù)測(cè)表達(dá)circRNA數(shù)量最多（圖1A、B）。相較于正常的結(jié)直腸癌旁組織，在結(jié)直腸癌組織中異常顯著表達(dá)的circRNA共有373 個(gè)（︱log2FC︱>1，P<0.05），其中上調(diào)顯著的有243個(gè)，下調(diào)顯著的有130個(gè)。將有顯著差異表達(dá)的circRNA數(shù)據(jù)制成火山圖（圖1C）和聚類分析熱圖（圖1D），在RNA測(cè)序結(jié)果中篩選上調(diào)與下調(diào)最顯著的5個(gè)circRNA，具體信息見表2。其中hsa_circ_0079534 表達(dá)上調(diào)最多，F(xiàn)C 為14.24；hsa_circ_0020093下調(diào)最明顯，F(xiàn)C為?8.27。

2.2 結(jié)直腸癌組織中circRNA的功能分析

圖1 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)circRNA的可視化分析Fig 1 Visual analysis of the differential expression of circRNAs in colorectal cancer and adjacent tissues

表2 circRNA測(cè)序結(jié)果中表達(dá)差異最顯著的10種circRNATab 2 Ten circRNAs with the most significant expression in the sequencing result

通過GO 富集分析與KEGG 通路分析預(yù)測(cè)差異表達(dá)circRNA 的功能。部分差異表達(dá)的circRNA 對(duì)應(yīng)1 個(gè)GO注釋，分別根據(jù)生物過程、細(xì)胞定位、分子功能3個(gè)部分對(duì)應(yīng)將最富集的前10條篩選出來。差異顯著circRNA在生物過程預(yù)測(cè)顯示較為富集的是細(xì)胞排泄、細(xì)胞內(nèi)源性pH的調(diào)節(jié)、對(duì)cAMP合成過程的負(fù)向調(diào)控以及對(duì)草酸運(yùn)輸調(diào)控等；其細(xì)胞定位主要在生殖核、紡錘體中央?yún)^(qū)、細(xì)胞質(zhì)膜以及刷狀緣膜等處；差異表達(dá)的circRNA分子功能分析提示結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制與部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性密切相關(guān)，如硫酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與次級(jí)活性硫酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、草酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、G蛋白偶聯(lián)受體活性等（圖2A）。KEGG通路分析表明，在circRNA相關(guān)通路中最富集的通路是對(duì)腫瘤微環(huán)境中蛋白聚糖的調(diào)控，同時(shí)circRNA調(diào)控的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、紅細(xì)胞白血病病毒癌基因同源物（v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog，ErbB）信號(hào)通路與結(jié)直腸癌發(fā)生息息相關(guān)，circRNA相關(guān)的白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移也可能參與了結(jié)直腸癌的致病過程（圖2B）。

圖2 差異表達(dá)circRNA 的GO分析和KEGG分析Fig 2 GO analysis and KEGG analysis of differentially expressed circRNAs

2.3 RT-qPCR 檢 測(cè) 結(jié) 果 與circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng) 絡(luò)分析

在所有差異表達(dá)的circRNA 中挑選出表達(dá)差異最顯著的4 個(gè)circRNA，分別為hsa_circ_0023984、hsa_circ_0008192、hsa_circ_0020093 與hsa_circ_0069922。前兩者在測(cè)序結(jié)果中預(yù)測(cè)表達(dá)上調(diào)，后兩者預(yù)測(cè)表達(dá)下調(diào)。我們?cè)?4 對(duì)結(jié)直腸癌及癌旁組織樣本中使用RT-qPCR 技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證circRNA 測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。用于RT-qPCR驗(yàn)證的44 例患者年齡為35～84 歲，男性26 例，女性18例；患者分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第8 版結(jié)直腸癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期3 例，Ⅱ期19 例，Ⅲ期20 例，Ⅳ期2 例。結(jié)果（圖3A）顯示：hsa_circ_0023984在結(jié)直腸癌腫瘤組織與癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.179 6±0.446 6 與0.012 2±0.017 4 （t=2.480，P=0.017）；hsa_circ_0008192在結(jié)直腸癌腫瘤組織與癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.089 4±0.186 7 與0.032 6±0.052 4（t=2.190，P=0.034）；hsa_circ_0020093 在結(jié)直腸癌腫瘤組織與癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.057 8±0.146 1 與0.457 6±0.625 5（t=4.725，P<0.000 1）；hsa_circ_0069922 在結(jié)直腸癌腫瘤組織與癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.030 9±0.030 9 與0.409 5±0.279 4（t=8.645，P<0.000 1）。通過RT-qPCR 證實(shí)了circRNA測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

利用CircInteractome、MicroRNA、TargetScan 等網(wǎng)站對(duì)上調(diào)明顯的hsa_circ_0023984 和hsa_circ_0008192 及下調(diào)顯著的hsa_circ_0020093 和hsa_circ_0069922 進(jìn)行下游miRNA 及最終調(diào)控的mRNA 預(yù)測(cè)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果優(yōu)先選擇相關(guān)系數(shù)最高的4 個(gè)miRNA 和20 個(gè)mRNA 構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA 互作網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 軟件將其可視化為核心網(wǎng)絡(luò)圖（圖3B）。該圖顯示含鋅指和BTB 結(jié)構(gòu)域蛋白1（zinc finger and BTB domain containing 1， ZBTB1）、 SEC23 同 源 物A （SEC23 homolog A，SEC23A）、脆性X 智力低下蛋白翻譯調(diào)節(jié)蛋白1（FMRP translational regulator 1，F(xiàn)MR1）、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）、具有植物同源結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白20 樣蛋白1（PHD finger protein 20 like 1，PHF20L1）等為靶向關(guān)系最多的mRNA原始基因。

2.4 差異表達(dá)circRNA與患者預(yù)后的關(guān)系

結(jié)合患者的臨床資料，通過Kaplan-Meier 生存分析顯示，hsa_circ_0008192 在患者腫瘤組織中高表達(dá)時(shí)其OS 較差（P=0.026 2），同時(shí)對(duì)于hsa_circ_0023984 高表達(dá)的患者OS 也趨于變短（P=0.039 8）（圖4A、B）。hsa_circ_0020093 在患者腫瘤組織中高表達(dá)時(shí)其OS 較好（P=0.000 1，圖4C），對(duì)于同樣表達(dá)下調(diào)的hsa_circ_0000111 也有類似的結(jié)果（P=0.002 2，圖4D）。我們的研究結(jié)果提示，差異表達(dá)的circRNA 可能是判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立且有價(jià)值的指標(biāo)。

3 討論

盡管當(dāng)前結(jié)直腸癌總的發(fā)病率與病死率持續(xù)下降，但進(jìn)展期的結(jié)直腸癌依舊給公共衛(wèi)生體系帶來極大的負(fù)擔(dān)；進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)早期識(shí)別結(jié)直腸癌與指導(dǎo)治療有著重要的意義［13］。circRNA 作為單鏈共價(jià)閉合的RNA 分子，具有與線性RNA 完全不同的結(jié)構(gòu)，其3' 末端和5' 末端連接在一起構(gòu)成了特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)［14］。circRNA 的穩(wěn)定性很大程度由其結(jié)構(gòu)決定。由于circRNA 缺乏類似線性RNA 的3'尾和5'帽子結(jié)構(gòu)，其在很大程度避免了脫帽反應(yīng)、脫腺苷化反應(yīng)等相關(guān)的線性RNA 降解方式，因此細(xì)胞質(zhì)中circRNA 的半衰期可達(dá)48 h以上而線性RNA半衰期均僅為10 h［15-16］。與此同時(shí)，circRNA 在不同組織及不同發(fā)育階段存在特異性表達(dá)［9］。目前越來越多研究［12，17］發(fā)現(xiàn)，circRNA 與腫瘤的發(fā)生與促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。在腫瘤組織中差異表達(dá)的circRNA 如胃癌中高表達(dá)circMLLT10 的患者預(yù)后明顯更差，提示circRNA 可作為判斷腫瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)志物［18］。由于circRNA 所具有的穩(wěn)定性、細(xì)胞類型或發(fā)育階段特異性、結(jié)構(gòu)保守性，使circRNA 可能成為新型生物診斷標(biāo)志物［9］。因此，研究circRNA 在結(jié)直腸癌中的作用意義重大。

本研究通過高通量測(cè)序獲得了結(jié)直腸癌circRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)庫，從2 萬多個(gè)circRNA 中篩選了具有顯著表達(dá)差異的373 個(gè)circRNA。在對(duì)表達(dá)差異的circRNA 進(jìn)行功能分析時(shí)，我們通過GO分析和KEGG通路注釋分析預(yù)測(cè)了這些circRNA 的潛在功能。在GO 分析中顯示，在生物學(xué)過程中最富集的是細(xì)胞排泄與對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性pH 的調(diào)節(jié)，分別各有6 種circRNA 與此過程相關(guān)。在細(xì)胞定位分析中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA 大多都分布在細(xì)胞質(zhì)膜上，這與circRNA主要位于細(xì)胞質(zhì)或儲(chǔ)存于外泌體中相一致［19］。分子功能分析提示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制與部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性密切相關(guān)；目前已有研究已經(jīng)證實(shí)了在結(jié)直腸中circRNA 與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如G 蛋白偶聯(lián)受體之間存在聯(lián)系［20］。將這些差異表達(dá)的circRNA 進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，共有173 條通路與結(jié)直腸癌發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，其中包括了VEGF 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等。對(duì)于結(jié)直腸癌中的VEGF 信號(hào)通路，Li等［21］發(fā) 現(xiàn)circCCT3 通 過 充 當(dāng)miR-613 的 海 綿 來 調(diào) 節(jié)VEGF 信號(hào)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外Zhong等［22］發(fā)現(xiàn)circMYLK 可充當(dāng)miR-29a 的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），通過激活血管內(nèi)皮生長因子A （vascular endothelial growth factor A，VEGFA）/血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）和下游Ras/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信號(hào)通路來促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致膀胱癌的進(jìn)展。

圖3 circRNA差異表達(dá)及circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Differential expression of circRNA and circRNA-miRNA-mRNA network plot

圖4 4種差異表達(dá)circRNA的臨床預(yù)后分析Fig 4 Clinical prognosis analysis of four differentially expressed circRNAs

此外，我們?cè)赾ircRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)庫挑選了顯著上調(diào)和顯著下調(diào)共4個(gè)circRNA在44對(duì)新鮮的結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織中進(jìn)行了RT-qPCR分析，驗(yàn)證結(jié)果與在測(cè)序結(jié)果中驗(yàn)證基本一致。結(jié)合患者的臨床資料，初步研究了高表達(dá)與低表達(dá)的circRNA與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)的hsa_circ_0008192 和hsa_circ_0023984 患者OS 較差，而高表達(dá)的hsa_circ_0020093 和hsa_circ_0069922 患者OS 較好。但考慮患者的例數(shù)較少，我們準(zhǔn)備在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)大樣本量繼續(xù)驗(yàn)證。

在目前已知的circRNA 中，僅有少部分同時(shí)含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）和小開放閱讀框（small open reading frame，sORF）結(jié)構(gòu)才可翻譯并編碼多肽。如在肝癌中高表達(dá)的circβ-catenin 可以通過編碼多肽β-catenin-370aa 來減弱β-catenin 磷酸化，從而激活Wnt/β-catenin 通路，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展［23］。在結(jié)直腸癌中，差異表達(dá)的circLgr4 通過編碼多肽Lgr4-aa 來激活Wnt/β-catenin 通路經(jīng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移［24］。大多數(shù)circRNA通過與miRNA形成ceRNA，負(fù)向調(diào)控miRNA 的功能使其靶基因表達(dá)失調(diào)，參與并促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展［21-22，25］。因此，我們對(duì)挑選的4 個(gè)circRNA進(jìn)行了circRNA-miRNA-mRNA 的靶向預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了ZBTB1、SEC23A、FMR1、NAMPT、PHF20L1 等為靶向關(guān)系最多的mRNA原始基因。

在這些靶向基因中，由煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）基因編碼的蛋白是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）生物合成過程中的關(guān)鍵酶。它可在組織或細(xì)胞水平影響機(jī)體代謝、細(xì)胞增殖分化與凋亡，尤其是衰老過程。NAMPT 在人類多種惡性腫瘤中上調(diào)，包括乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌和多種造血系統(tǒng)惡性腫瘤［26-27］。與此同時(shí)，在一些惡性腫瘤如胃癌、甲狀腺癌和前列腺癌中，NAMPT的表達(dá)與腫瘤侵襲和化學(xué)治療耐藥相關(guān)［28］。有文獻(xiàn)［29］也報(bào)道了在結(jié)直腸癌中NAMPT 明顯上調(diào)，且NAMPT 通過控制干細(xì)胞信號(hào)途徑增加了癌癥起始細(xì)胞的數(shù)量，從而導(dǎo)致了結(jié)直腸癌的發(fā)生。通過對(duì)circRNA 網(wǎng)絡(luò)的分析，hsa-miR-576-5p 與hsa-miR-1228 與NAMPT 關(guān) 系 密 切，因此我們推測(cè)hsa_circ_0008192 或hsa_circ_0023984 高表達(dá)患者OS 總體變短可能與circ0023984-miR-576-5p-NAMPT或circ0008192-miR1228-NAMPT調(diào)控軸相關(guān)。

綜上，本研究利用高通量測(cè)序篩選了差異表達(dá)的circRNA并對(duì)相應(yīng)功能進(jìn)行分析，用RT-qPCR驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)合患者資料分析了預(yù)后，此外構(gòu)建了部分與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控軸。在后續(xù)研究中，我們將從體內(nèi)外方向共同驗(yàn)證和完善本研究預(yù)測(cè)的circRNA-miRNA 靶向結(jié)合網(wǎng)絡(luò)，旨在進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制，從而為結(jié)直腸癌的早期診斷與治療提供新的研究思路。