高通量測序分析血根堿對中華鱉腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

陳貞年 王曉清 羅來婷 王 佩 涂開發(fā) 楊 濤 胡亞洲① 熊 鋼

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 長沙 410128；2. 湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院 長沙 410127)

中華鱉(Trionyx sinensis)是我國重要的名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物之一，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值(Zhang et al, 2018)。近年來，養(yǎng)殖過程中抗生素的使用與日俱增，抗生素雖然能有效防治動物疾病，但也會導(dǎo)致病原菌耐藥性以及藥物殘留等問題，對養(yǎng)殖環(huán)境和人類健康造成一定的影響。在此背景下，尋求綠色、健康、無污染的抗生素替代物已經(jīng)成為當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然趨勢(胡貴麗等, 2018)。

植物提取物中富含多種活性成分，并且具有天然、綠色、無污染等特點(diǎn)，這使得植物提取物成為最具潛力的抗生素替代物(陶新等, 2018)。血根堿是從博落回(Macleaya cordata)中分離出來的一種苯菲啶異喹啉類生物堿，在2011 年被批準(zhǔn)為國家二類新獸藥(2011 新獸藥證字34 號)，作為綠色、安全、高效的抗生素替代物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。研究表明，從博落回中提取的血根堿能促使小腸細(xì)胞更新，改善腸道健康和提高腸道免疫機(jī)能(陳家順等, 2018)，調(diào)控腸道中微生物菌群的穩(wěn)定(Chen et al, 2018)。腸道微生物的穩(wěn)定在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收(李桂英等, 2013)、提高抵抗力和免疫機(jī)制中起著不可替代的作用(湯菊芬等,2016)。腸道微生物群的失調(diào)與許多慢性病癥息息相關(guān)(Khachatryan et al, 2008)，在影響健康腸道菌群構(gòu)成和功能的因素中，遺傳(Turnbaugh et al, 2009)、食物(Hildebrandt et al, 2009)和藥物攝入(Russell et al,2012)等似乎都發(fā)揮了作用。

本研究以中華鱉為實(shí)驗(yàn)動物，投喂血根堿添加量不同的飼料進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用高通量測序?qū)χ腥A鱉腸道樣品進(jìn)行16S rRNA V3-4 區(qū)測序分析，旨在研究血根堿對中華鱉腸道微生物多樣性及物種豐度的影響。本研究從微生物角度來評價血根堿添加劑的作用，為血根堿在中華鱉飼料中的科學(xué)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中華鱉購于湖南常德市河州甲魚合作社，挑選480 只體重為(31.75±7.20) g 的健康活潑的中華鱉。暫養(yǎng)于水泥養(yǎng)殖池中1 周后，按照不同添加濃度進(jìn)行分組(RS1：0；RS2：50 mg/kg；RS3：100 mg/kg；RS4：150 mg/kg)，每組設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)組放養(yǎng)40 只中華鱉。血根堿(博落回散)購于湖南美可達(dá)生物資源有限公司，其有效成分為血根堿(≥98%)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組的設(shè)定向飼料中添加血根堿，并混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。投喂量約為中華鱉體重的3%，每天投喂2 次，飼養(yǎng)75 d。

飼養(yǎng)結(jié)束后，禁食24 h，從每個重復(fù)組中隨機(jī)選取5 只中華鱉，將其轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，使用丁香油將其麻醉后放置于解剖盤中，用75%的酒精進(jìn)行體表消毒，再用0.85%的無菌生理鹽水沖洗2～3 次。按照實(shí)驗(yàn)動物福利的基本要求在無菌操作環(huán)境下進(jìn)行解剖，取中腸組織，用生理鹽水沖洗掉內(nèi)容物后，立即放入液氮，速凍后移至–80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA 的提取和測序

高通量測序部分均委托北京諾禾致源科技股份有限公司(NOVOGENE)完成，具體操作方法如下：

(1)基因組DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增：樣品基因組DNA 采用SDS 法提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的濃度和純度。在離心管中，用無菌水將樣品稀釋至1 ng/μl。以稀釋的基因組DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域(16S V3-V4 區(qū))的選擇，使用帶Barcode的特異引物，Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer (New England Biolabs)和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增準(zhǔn)確性和效率。

(2)PCR 產(chǎn)物的混樣和純化：PCR 產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等質(zhì)量混樣，充分混勻后，使用2%瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，切割回收目標(biāo)條帶。使用GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific)回收產(chǎn)物。

(3)上機(jī)測序與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：使用TruSeq DNA PCRFree Sample Preparation Kit 試劑盒構(gòu)建文庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Q-PCR 和Qubit 定量，確定合格后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns (Thermofisher)構(gòu)建文庫。對文庫進(jìn)行Qubit 定量和文庫測試，然后，使用Life Ion S5TM 或Ion S5TMXL (Thermofisher)測序。使用Cutadapt 先對Reads 低質(zhì)量部分剪切，再根據(jù)Barcode 從得到的Reads 中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode 和引物序列初步質(zhì)控，得到原始數(shù)據(jù)(Raw reads)，經(jīng)過以上處理，得到的Reads 需要去除嵌合體序列。嵌合體是多個親本序列之間的雜交產(chǎn)物，可能會被錯誤地解釋為新的生物體，序列通過UCHIME algorithm 與數(shù)據(jù)庫(Gold database)檢測2 個或多個片段的嵌合序列，比對檢測嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Clean reads)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

拼接測序得到的原始數(shù)據(jù)，篩選有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(Operational taxonomic units, OTUs)聚類分析。通過Alpha 多樣性分析中華鱉腸道微生物菌群豐度和多樣性，根據(jù)Beta 多樣性分析得到的距離矩陣進(jìn)行UPGMA 聚類分析，得到可視化差異程度。結(jié)合屬分類水平的Heatmap 進(jìn)行分析，從聚類結(jié)果可知，樣品在屬分類水平上的腸道菌群的相似性和差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA 測序結(jié)果分析

對4個組的20個樣品的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得的總讀數(shù)(Total reads)為1478897，均值為73945(圖1)。根據(jù)97%相似度分類獲得OTU序列，RS1～RS4組總OTUs分別為258、412、977和1004(表1)。由此可以看出，實(shí)驗(yàn)組的OTU數(shù)目顯著高于對照組(P＜0.05)，尤其是RS3和RS4組。

圖1 不同樣品間OTU 統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.1 The OTUs statistical results of different samples

表1 各樣品中高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.1 Summary of high throughput sequencing results of each sample

表2 各樣品優(yōu)勢細(xì)菌門類及相對豐度(%)Tab.2 Dominant bacterial phyla and the relative abundance of each sample (%)

2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)組成及相對豐度

將相似度較高的序列聚在一起稱為OTUs 聚類，不同OTU 代表不同微生物種類，統(tǒng)計(jì)不同的OTU 對應(yīng)的微生物門類和相對豐度(表2)。結(jié)果顯示，RS1組中檢測到的物種門類為變形菌門(Proteobacteria)、衣原體門(Chlamydiae)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)，除了變形菌門、衣原體門和厚壁菌門，其他門類占比均不足1%。RS2 組中主要檢測到變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。RS3 組中主要有變形菌門、衣原體門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門。RS4 組中主要有變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、衣原體門、柔膜菌門(Tenericutes)和放線菌門。由此可知，中華鱉腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，其中，變形菌門呈顯著下降趨勢(P＜0.05)；衣原體門、放線菌門、擬桿菌門呈不規(guī)律變化；厚壁菌門呈顯著上升趨勢(P＜0.05)。整體來看，實(shí)驗(yàn)組腸道菌群組成結(jié)構(gòu)較對照組復(fù)雜，物種多樣性更高。

圖2 屬分類水平上的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of species at the genus level

篩選每組樣品中相對豐度最高的前10 種OTU 對應(yīng)的菌類，在屬分類水平上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2)。結(jié)果顯示，在RS1 組中，主要優(yōu)勢菌種為螺桿菌屬(Helicobacter)(90.80%)，其次是衣原體屬(Chlamydia)(3.92%)。RS2 組中，優(yōu)勢菌種為螺桿菌屬(87.15%)、擬桿菌屬(Bacteroides)(2.04%) 和伊麗莎白菌屬(Elizabethkingia)(1.49%)。RS3 組中，優(yōu)勢菌種為螺桿菌屬(40.59%)、衣原體屬(15.21%)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)(6.31%)、勞森菌屬(Lawsonia)(3.74%)和殺雄菌屬(Arsenophonus)(1.51%)。RS4 組中，優(yōu)勢菌種為螺桿菌屬(41.19%)、不動桿菌屬(Acinetobacter)(11.54%)、衣原體屬(8.87%)、伊麗莎白菌屬(4.70%)、脲原體屬(Ureaplasma)(2.31%)、乳桿菌屬(Lactobacillus)(2.78%)和擬桿菌屬(2.45%)。

根據(jù)樣品在屬分類水平上的注釋和豐度信息，選取豐度前35的屬分級聚類，并繪制Heatmap (圖3)。在屬分類水平上可看到，螺桿菌屬的豐度在實(shí)驗(yàn)組中呈下降趨勢。隨著添加量的增加，優(yōu)勢菌屬的數(shù)量增多。

2.3 腸道菌群Alpha 多樣性分析

覆蓋率(Goods coverage)指數(shù)可以反映測序的深度。本研究中各樣品的覆蓋指數(shù)均在0.99以上(圖4a)，表明測序的深度基本覆蓋到樣品中的所有微生物菌群。Shannon指數(shù)主要用于評估樣本中微生物的多樣性，Shannon值越大，表明群落多樣性越高。Shannon指數(shù)箱型圖(圖4b)顯示，實(shí)驗(yàn)組多樣性均高于對照組，其中，RS4組顯著高于RS1組(P＜0.05)，RS3組和RS4組顯著高于RS2組(P＜0.05)，而RS1組和RS2組則無顯著差異(P＞0.05)。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)可以評估菌群物種的豐度，指數(shù)越大表明菌群的豐度越高。Ace和Chao1 指數(shù)箱型圖(圖4c、圖4d)顯示，實(shí)驗(yàn)組較對照組呈上升趨勢，其中，RS3、RS4 組顯著高于RS1、RS2 組(P＜0.05)，RS1 和RS2 組間無顯著差異(P＞0.05)。表明，適量添加血根堿能有效提高腸道微生物菌群的多樣性及物種豐度。

圖3 腸道微生物屬分類水平的熱圖Fig.3 Heatmap of the classification level of gut microbes

圖4 Alpha 多樣性組間比較Fig.4 Comparison of Alpha diversity between groups

進(jìn)一步分析各分組中樣品菌群間多樣性的相互關(guān)系，并構(gòu)建Venn 圖(圖5)。結(jié)果顯示，RS1 組具有的OTU 總數(shù)為258；實(shí)驗(yàn)組中，RS2～RS4 組的OTU總數(shù)分別為412、977 和1004。其中，RS1～RS4 組特有OTUs 分別為10、37、302 和347。4 個組共享OTU為160，占總OTU 數(shù)的6.04%。從樣本間菌群相似性來看，對照組與實(shí)驗(yàn)組間的相似性較低，說明，血根堿的添加對腸道菌群組成結(jié)構(gòu)有明顯影響，總體來說提高了腸道微生物菌群的復(fù)雜度及豐度。

2.4 腸道菌群Beta 多樣性分析

圖5 不同實(shí)驗(yàn)組的OTU 分析Fig.5 OTU analysis of different experimental groups

RS1 與RS2 組腸道內(nèi)菌群組成在PC1 上相差較小(圖6a)，而RS3 和RS4 組與RS1 組距離較遠(yuǎn)。表明，RS1 與RS2 組的菌群構(gòu)成差異較小，與RS3、RS4 組差異較大。基于Weighted UniFrac 距離的PCoA分析結(jié)果顯示(圖6b)，RS1 與RS2 組菌群構(gòu)成相似，與RS3、RS4 組相差較遠(yuǎn)?；谝陨戏椒ǖ玫降木嚯x矩陣用于UPGMA 聚類分析(圖7)，并將聚類結(jié)果整合到門分類水平上菌群的相對豐度，結(jié)果顯示，RS1 與RS2 組間相似性較高，與RS3、RS4 組相似性較低。由此可知，血根堿對腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成有明顯影響，當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/kg 時，腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，菌群結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，種類較多。

圖6 組間PCA 和PCoA 分析Fig.6 PCA and PCoA analysis between groups

圖7 基于Weighted Unifrac 距離的UPGMA 聚類樹Fig.7 UPGMA clustering tree based on Weighted Unifrac distance

3 討論

腸道微生物菌群是腸道黏膜上的一個復(fù)雜多樣的生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生態(tài)的相對穩(wěn)定對于動物機(jī)體消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)宿主免疫功能、抵御有害微生物侵害等具有重要意義(Huang et al, 2018; Pérez et al, 2010; De Schryver et al, 2014)。腸道菌群結(jié)構(gòu)的失衡可能會導(dǎo)致機(jī)體的免疫系統(tǒng)遭到破壞、細(xì)菌性疾病暴發(fā)(朱文根等, 2019)。本研究利用16S rRNA 高通量測序，分析不同濃度血根堿對中華鱉腸道黏膜上皮菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為探究血根堿的微觀作用機(jī)制及中華鱉飼料開發(fā)提供理論依據(jù)。

通過Alpha多樣性分析可知，實(shí)驗(yàn)組的Shannon指數(shù)均大于對照組，且呈上升趨勢，說明添加血根堿在一定程度上可以提高腸道菌群的多樣性。從Ace和Chao1分析可知，血根堿可提高腸道中微生物菌群的豐度。但值得注意的是，RS1對照組和RS2組之間并無顯著差異(P＞0.05)。主成分分析PCA可反映樣品間的關(guān)系，PCA圖中的距離反映了樣品間的差異，樣品中菌群的組成結(jié)構(gòu)越相似，它們在PCA圖中分布的距離就越近。Beta多樣性分析表明，RS1與RS2組間的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)差異較小，而與RS3、RS4的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)差異較大?？傮w來說，不同濃度的血根堿添加組中，腸道黏膜上皮菌群的相對豐度和優(yōu)勢菌群發(fā)生了較為明顯的變化，說明添加血根堿可提高腸道黏膜上皮菌群的多樣性。當(dāng)添加量達(dá)到100 mg/kg時，其腸道菌群多樣性顯著提高(P＜0.05)。

物種注釋結(jié)果顯示，對照組中腸道菌群構(gòu)成前5的門類有變形菌門、衣原體門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，其中，變形菌門是優(yōu)勢菌群，占絕對優(yōu)勢，次優(yōu)勢菌群是衣原體門，與何嬌嬌等(2018)對魚類腸道微生物菌群研究結(jié)果相似。可以推測變形菌門和衣原體門為中華鱉腸道黏膜上皮的固有菌群。在屬分類水平上，螺桿菌屬和衣原體屬為優(yōu)勢菌屬，其中，螺桿菌屬占據(jù)絕對優(yōu)勢。在實(shí)驗(yàn)組中，變形菌門均呈下降趨勢，在RS3 組中為最低，而衣原體門則呈不規(guī)律變化。在屬分類水平上，腸道菌群中優(yōu)勢菌群的數(shù)量與血根堿添加量呈正相關(guān)，其中，不動桿菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度顯著提高(P＜0.05)，而螺桿菌屬豐度明顯降低。通過韋恩圖分析腸道菌群相似性發(fā)現(xiàn)，隨著血根堿添加量的增加，腸道菌群相似性越低?？梢?，在飼料中添加血根堿能有效降低腸道中螺桿菌屬的含量，并提高不動桿菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的含量。

據(jù)報道，螺桿菌屬與人、動物的疾病有關(guān)，例如，螺桿菌(Helicobacter)與薄餅龜(Malacochersus tornieri)敗血癥有關(guān)(Stacy et al, 2010)。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是一種主要的水傳播病原體，能夠危害養(yǎng)殖和野生的羅非魚(Oreochromis mossambicus) (Abdel-Moein et al, 2015)。而乳桿菌和雙歧桿菌對幽門螺桿菌具有很好的抑制作用(Wang et al, 2013、2014)。在本研究中，螺桿菌屬含量在實(shí)驗(yàn)組均呈下降趨勢，且在RS3、RS4中顯著下降(P＜0.05)；而乳桿菌屬和雙歧桿菌屬含量在實(shí)驗(yàn)組中均明顯上升。推測血根堿在腸道菌群變化中起到重要的作用，可有效提高乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的含量，并抑制螺桿菌屬的增殖(Mahady et al,2003)，降低螺桿菌屬的致病性(胡守奎等, 2014)，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。此外，還發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬的豐度在實(shí)驗(yàn)組中呈規(guī)律性上升，而不動桿菌屬的生長與繁殖需要大量的O2，導(dǎo)致腸道中形成厭氧環(huán)境，給厭氧菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)的生長繁殖創(chuàng)造了有利的環(huán)境條件(湯菊芬等, 2016)。本研究中，不動桿菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的豐度在實(shí)驗(yàn)組均呈上升趨勢，與前人的研究結(jié)果相似，推測可能與內(nèi)環(huán)境的改變有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。乳桿菌屬是常見的有益菌屬，其中，乳酸菌作為飼料添加劑已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，被公認(rèn)為對宿主有益，已經(jīng)在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei) (Wang, 2007)和大黃魚(Larimichthys crocea) (何嬌嬌等, 2018)中得到很好的應(yīng)用。雙歧桿菌可在腸道形成生物學(xué)屏障，以阻止致病菌入侵(吳淑清等, 2007)，其代謝能產(chǎn)生甘氨酰水解酶，使結(jié)合的膽酸游離，從而達(dá)到抑制病原菌生長的作用。整體來看，血根堿對螺桿菌屬的生長繁殖起到有效的抑制作用，而對不動桿菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬增值起到一定的促進(jìn)作用。這種現(xiàn)象在RS3、RS4組中較為明顯。推測當(dāng)飼料中的血根堿添加量達(dá)到(100～150) mg/kg時，能有效改善中華鱉的腸道菌群，對于維護(hù)腸道健康具有重要意義。

4 結(jié)論

綜上所述，在飼料中添加(100～150) mg/kg 的血根堿能有效提高中華鱉腸道黏膜上皮菌群的復(fù)雜度及菌群的豐度，改善腸道黏膜上皮的菌群結(jié)構(gòu)。本研究獲得了血根堿對中華鱉腸道黏膜上皮菌群影響的重要信息，主要表現(xiàn)在血根堿能有效抑制螺桿菌屬增殖，同時，提高不動桿菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的豐度。本研究僅檢測到屬分類水平，種水平暫無分類，其功能機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。