三疣梭子蟹14-3-3 基因的克隆及其在低鹽和病原脅迫后的表達(dá)分析*

題興斌 呂建建 宋 柳 閻德平 孫東方 劉 萍①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹(戴愛云等, 1977)。鹽度是三疣梭子蟹養(yǎng)殖中的重要環(huán)境因子，直接影響其生長、發(fā)育和存活(隋延鳴等, 2012)。夏季暴雨多發(fā)，養(yǎng)殖水體鹽度急劇下降，使得三疣梭子蟹體內(nèi)滲透壓失衡，導(dǎo)致其生長緩慢、成活率較低(孫東方等, 2018)。病害發(fā)生也是影響三疣梭子蟹養(yǎng)殖的重要問題，其中，對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是導(dǎo)致三疣梭子蟹死亡的主要病原(Marques et al, 2011; Sullivan et al, 2017)。耐低鹽和抗病性狀是三疣梭子蟹重要的育種性狀，深入研究其低鹽適應(yīng)和免疫防御的分子機(jī)制對培育三疣梭子蟹耐低鹽及抗病良種具有重要意義。

14-3-3 基因是一種廣泛分布于所有真核生物中的高保守基因(Chaudhri et al, 2003)，編碼一組酸性可溶的多功能蛋白，由Moore 等(1967)首次在牛腦細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。14-3-3 基因的功能具有多樣性，參與生物細(xì)胞應(yīng)激、免疫、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝酶合成、細(xì)胞凋亡等多種生理過程的調(diào)控(Koskinen et al, 2004; Angrand et al, 2006; Neal et al, 2009; Matta et al, 2012; Rehman et al, 2014; Gómez-Suárez et al,2016; Lu et al, 2017; Yang et al, 2017)。由于其功能的重要性，該基因在擬穴青蟹(Scylla paramamosain)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)等多種經(jīng)濟(jì)甲殼類動物中已被克隆，比如在鹽度脅迫過程中，斑節(jié)對蝦中14-3-3 基因大量表達(dá)(Kaeodee et al, 2011)；在病原感染過程中，凡納濱對蝦中14-3-3 基因呈顯著上調(diào)表達(dá)(Wang et al, 2007)，初步證明了該基因在抗逆、抗病過程中具重要作用。至今尚未見該基因在三疣梭子蟹中的相關(guān)研究報道。

本研究以三疣梭子蟹為對象，通過本實(shí)驗(yàn)室三疣梭子蟹轉(zhuǎn)錄組測序得到三疣梭子蟹14-3-3 基因片段，對14-3-3 基因在不同組織、低鹽和病原脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行研究。本研究利用RACE 技術(shù)，首次克隆三疣梭子蟹14-3-3 基因，通過qRT-PCR 分析其在三疣梭子蟹不同組織中的表達(dá)水平，并對其在鹽度脅迫和病原脅迫下的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行研究，以此探討Pt14-3-3 在三疣梭子蟹鹽度適應(yīng)和免疫反應(yīng)中的功能，為三疣梭子蟹耐低鹽和抗病品種培育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所需三疣梭子蟹均取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)基地濰坊昌邑海豐水產(chǎn)有限公司，體重為(5.78±1.11) g。暫養(yǎng)于4 m×5 m×1.5 m的室內(nèi)水泥池中，每池90 只，共10 池，暫養(yǎng)7 d。養(yǎng)殖水溫為(25±1)℃，鹽度為33，pH 8.7，持續(xù)充氧，每天換水1/3，于18:00 定時投喂藍(lán)蛤(Potamocorbula laevis)。隨機(jī)選取9 只暫養(yǎng)后健康有活力的三疣梭子蟹，分別取其血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、肌肉和眼柄，存于液氮，設(shè)3 個平行，每個平行3 只，用于組織表達(dá)分布分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹽度脅迫實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)挑取暫養(yǎng)7 d 的三疣梭子蟹，分為2 組，對照組(33)和低鹽組(11)(72 h 半致死鹽度)(Han et al, 2014; 隋延鳴等, 2012)，每個處理組設(shè)3 個平行，每個平行60 只。使用自然海水和淡水配制低鹽度實(shí)驗(yàn)用水，使用YSI 鹽度儀進(jìn)行鹽度校準(zhǔn)，具體方法見隋延鳴等(2012)。各組分別于脅迫后0、3、6、12、24、48 和72 h 取鰓和肝胰腺組織，液氮速凍保存，用于RNA 的提取，每個時間點(diǎn)取3 只。

1.2.2 病原脅迫實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)挑取暫養(yǎng)7 d 后體表完整、活力旺的三疣梭子蟹，分成副溶血弧菌注射組和WSSV 注射組，每組50 只，設(shè)3 個平行。分別于梭子蟹的游泳足第一關(guān)節(jié)基膜處注射濃度為3.8×108CFU/ml副溶血弧菌和7.6×107CFU/ml WSSV(謝建軍等, 2011;Ren et al, 2017)。在人工感染后的0、3、6、12、24、48 和72 h 取血細(xì)胞和肝胰腺組織，于液氮中速凍保存，用于RNA 提取，每個時間點(diǎn)取3 只。

1.3 Pt14-3-3 基因全長cDNA 的克隆及測序

取三疣梭子蟹鰓、肝胰腺、肌肉等組織樣品，采用TRIzol?Reagent(Invitrogen 公司)方法進(jìn)行總RNA提取，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(NanoDrop 2000, Thermo)對所提RNA 檢測質(zhì)量和濃度，將各組織的高質(zhì)量RNA 均勻混合，使用SmartTMRACE Amplification Kit (TaKaRa 公司)進(jìn)行3′和5′RACE cDNA 模板的合成。根據(jù)從三疣梭子蟹cDNA文庫中獲得的Pt14-3-3 基因的EST 序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計3′RACE 和5′RACE 特異性引物及RACE 通用引物UPM(表1-1)。使用Advantage 2 PCR Kit(Clontech 公司)進(jìn)行3′和5′末端的擴(kuò)增。將獲得的PCR 產(chǎn)物回收純化、連接轉(zhuǎn)化，挑取陽性單克隆，利用M13-47/48 引物進(jìn)行菌落PCR 鑒定，篩選目的菌液進(jìn)行測序。

1.4 序列生物信息學(xué)分析

利用Vector NTI 11.0 軟件對測序后的序列進(jìn)行冗余序列去除和再拼接，通過DNAStar 的EditSeq 程序進(jìn)行開放閱讀框(ORF)的預(yù)測和氨基酸的翻譯。三疣梭子蟹Pt14-3-3 基因的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列使用 BLAST(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對。利用ProtParam tool 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測，使用InterproScan 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析，TMHMM 2.0 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析。使用ClustalX 軟件對三疣梭子蟹Pt14-3-3 基因的氨基酸序列與其他物種的14-3-3 氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，在此基礎(chǔ)上采用MEGA 4.0軟件，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 Pt14-3-3 的組織表達(dá)及各實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)特征

利用Trizol 試劑提取不同實(shí)驗(yàn)組三疣梭子蟹鰓和肝胰腺組織的總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)已獲得的三疣梭子蟹內(nèi)參基因β-actin 和Pt14-3-3 基因全長序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計 2 對正反引物(β-actin-F 和β-actin-R；Q14-3-3-F 和Q14-3-3-R)(表1)，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑在ABI 7500 Real Time PCR 儀上對不同處理組獲得的Pt14-3-3 基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量檢測。熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20 μl：10 μl SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (2×)，0.8 μl 10 μmol/L 的引物Q14-3-3-F，0.8 μl 10 μmol/L 的引物Q14-3-3-R，0.4 μl ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，2.0 μl cDNA 模板，6.0 μl 無菌ddH2O。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，95℃5 s，60℃ 34 s，40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。采用2-ΔΔCt計算Pt14-3-3 基因的相對表達(dá)量，使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析。

表1 本研究中所用引物序列Tab.1 The sequence of primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 Pt14-3-3 基因cDNA 全長克隆及序列分析

獲得的三疣梭子蟹基因全長為2510 bp，包括93 bp的5′端非編碼區(qū)，1676 bp 的3′非編碼區(qū)和744 bp 的開放閱讀框(ORF)(圖1)。3′端含有PolyA 尾，具有AATAAA 多聚腺苷酸加尾信號。氨基酸序列分析可知，Pt14-3-3 基因編碼一個由247 個氨基酸組成，理論等電點(diǎn)為4.65，分子量為27.98 kDa 的蛋白。由于其較高的不穩(wěn)定系數(shù)(41.28)和較低的GRAVY(Grand average of hydropathicity) (–0.657)，推斷其為不穩(wěn)定的親水蛋白。

2.2 Pt14-3-3 基因的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 4.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，所有物種的14-3-3 共聚為兩大類群：脊椎動物和無脊椎動物；在無脊椎動物中，三疣梭子蟹與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)緊密聚為一支，同源性為94%，之后的聚類順序依次為與脊尾白蝦(Palaemon carinicauda)、日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)、擬穴青蟹、斑節(jié)對蝦、墨吉明對蝦(Fenneropenaeus merguiensis)。在脊椎動物和無脊椎動物中，14-3-3 基因在氨基酸序列上都具有高度的保守性，表明該基因在物種間非常保守。

2.3 Pt14-3-3 基因的組織表達(dá)

利用實(shí)時熒光定量 PCR 分析了三疣梭子蟹Pt14-3-3 基因在不同組織中的表達(dá)分布特征，結(jié)果顯示，Pt14-3-3 基因在鰓、肝胰腺、肌肉、眼柄、血細(xì)胞和心臟中均有表達(dá)。其中，在肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次為肌肉、鰓、心臟和眼柄，而在血淋巴中的表達(dá)量最低(圖4)。

2.4 Pt14-3-3 基因在低鹽脅迫中的表達(dá)

Real-time PCR 檢測了三疣梭子蟹在低鹽脅迫后不同時間點(diǎn)的鰓和肝胰腺中Pt14-3-3 基因的相對表達(dá)情況(圖5)。低鹽脅迫后，Pt14-3-3 基因在鰓中的相對表達(dá)量與對照組相比，于3～24 h 呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)，48～72 h 為顯著上調(diào)表達(dá)，分別于6 h 和48 h達(dá)到最小值和最大值，為對照組的0.24 倍(P＜0.05)和1.34 倍(P＜0.05)。低鹽脅迫后，Pt14-3-3 基因在肝胰腺中的相對表達(dá)量與對照組相比，除6 h 外，整體呈上調(diào)表達(dá)，表達(dá)趨勢為先上升、下降后再上升、下降，于12 h 達(dá)到最大值，為對照組的7.54 倍(P＜0.05)。

圖1 三疣梭子蟹14-3-3 基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of P. trituberculatus 14-3-3 gene

2.5 Pt14-3-3 基因在病原脅迫中的表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR 檢測了三疣梭子蟹在病原脅迫后不同時間點(diǎn)的肝胰腺和血細(xì)胞中Pt14-3-3 基因的相對表達(dá)情況(圖6)。感染副溶血弧菌后，Pt14-3-3基因在肝胰腺中相對表達(dá)量與對照組相比，整體呈顯著上調(diào)表達(dá)，分別于12 h 和48 h 達(dá)到最大值和最小值，為對照組的17.52 倍(P＜0.05)和1.77 倍(P＜0.05)；在血細(xì)胞中的相對表達(dá)量與對照組相比，除6 h 外，整體呈下調(diào)表達(dá)，分別于6 h 和12 h 達(dá)到最大值和最小值，為對照組的1.68 倍(P＜0.05)和0.04(P＜0.05)倍。感染W(wǎng)SSV 后，Pt14-3-3 基因在肝胰腺和血細(xì)胞中的相對表達(dá)量與對照組相比，除24 h 外，整體均呈上調(diào)表達(dá)，分別于72 h 和3 h 達(dá)到最大值，為對照組的13.35 倍(P＜0.05)和3.25 倍(P＜0.05)，均于24 h 降至最小值，分別為對照組的0.52 倍(P＜0.05)和0.42 倍(P＜0.05)。

3 討論

圖2 三疣梭子蟹Pt14-3-3 氨基酸序列與其他物種14-3-3 氨基酸序列比對Fig.2 Amino-acid sequences alignment of P. trituberculatus with different animals′ 14-3-3 genes

圖3 利用MEGA 4.0 軟件構(gòu)建的基于14-3-3 氨基酸序列的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 NJ tree based on 14-3-3 gene amino acid sequences using MEGA 4.0

圖4 三疣梭子蟹Pt14-3-3 基因在各組織中的表達(dá)Fig.4 Distribution of Pt14-3-3 gene expression in different tissues of P. trituberculatus

本研究克隆得到三疣梭子蟹14-3-3cDNA 全長序列，編碼由247 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。14-3-3 基因具有高度的保守性，將本研究克隆得到的三疣梭子蟹14-3-3 基因與其他進(jìn)行比對，Pt14-3-3 基因與中華絨螯蟹14-3-3 基因同源性最高，達(dá)到100%；聚類分析顯示，三疣梭子蟹14-3-3 基因氨基酸序列與中華絨螯蟹緊密聚為一支，之后依次與脊尾白蝦、日本對蝦、擬穴青蟹、斑節(jié)對蝦、墨吉明對蝦聚在一起，同源性均在95%以上。研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 基因在哺乳動物中存在β、γ、ε、η、σ、ζ 和θ 7 種亞型(Hermeking, 2003)。根據(jù)NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹和氨基酸比對結(jié)果，對Pt14-3-3基因進(jìn)行分析，推測該基因?qū)儆讦?亞型，三疣梭子蟹是否存在14-3-3 基因的其他亞型有待進(jìn)一步研究。

本研究采用熒光定量RT-PCR 方法對三疣梭子蟹14-3-3 基因mRNA 組織表達(dá)進(jìn)行分析。顯示14-3-3基因在多種組織中都有表達(dá)，暗示該基因功能的多樣性。在肝胰腺中的表達(dá)量最高，推測肝胰腺為三疣梭子蟹14-3-3 基因發(fā)揮作用的重要器官，而肝胰腺是機(jī)體參與免疫防御的重要組織，暗示了該基因具有免疫功能。該結(jié)果與擬穴青蟹14-3-3 基因表達(dá)的研究結(jié)果基本一致(舒妙安等, 2012)。血細(xì)胞是三疣梭子蟹重要的免疫細(xì)胞，Pt14-3-3 基因在血細(xì)胞中有少量表達(dá)，同樣說明其具有免疫功能(Kaimin et al, 2017)。例如，Chongsatja(2010)等研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦病原感染后14-3-3 基因在血細(xì)胞中大量表達(dá)，證明了該基因的免疫功能。另外，在鰓中也有較多表達(dá)，鰓組織與滲透壓調(diào)節(jié)密切相關(guān)(Lü et al, 2013; Genovese et al,2004)，暗示其可能的在鹽度適應(yīng)中發(fā)揮一定的功能。例如，Kaeodee 等(2011)發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦從高滲到低滲的適應(yīng)中14-3-3 基因大量表達(dá)，證明該基因參與機(jī)體滲透壓的調(diào)節(jié)。

圖5 Pt14-3-3 基因在低鹽脅迫下鰓和肝胰腺中的表達(dá)情況Fig.5 Expression of Pt14-3-3 gene in gill and hepatopancreas under low salt stress

圖6 Pt14-3-3 基因在病原脅迫下肝胰腺以及血細(xì)胞中的表達(dá)Fig.6 Expression of Pt14-3-3 gene in hepatopancreas and blood cells under pathogen stress

為了探究Pt14-3-3 基因在三疣梭子蟹鹽度適應(yīng)中是否具有一定功能，本研究分析了該基因在低鹽脅迫下鰓和肝胰腺中的表達(dá)規(guī)律。發(fā)現(xiàn)低鹽脅迫后，Pt14-3-3 基因在鰓組織中0～24 h 呈顯著下調(diào)表達(dá)，推測原因可能是低鹽脅迫導(dǎo)致鰓組織產(chǎn)生應(yīng)激損傷，最終間接干擾或抑制了Pt14-3-3 基因的表達(dá)；48 h 后基因表達(dá)上調(diào)，暗示了三疣梭子蟹通過顯著上調(diào)鰓組織中Pt14-3-3 基因的表達(dá)量來應(yīng)對低鹽脅迫。Kammerer等(2009)研究認(rèn)為，鹽度脅迫下羅非魚鰓上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量隨時間的延長而增加。Pt14-3-3 基因?qū)儆讦?亞型，具有凋亡抑制的功能(陳惠華等, 2005)。以上研究表明，三疣梭子蟹可能通過上調(diào)Pt14-3-3 基因的表達(dá)來抑制鰓組織中細(xì)胞凋亡的過程。低鹽脅迫后，Pt14-3-3 基因在肝胰腺中于3 h 后呈上調(diào)表達(dá)，暗示三疣梭子蟹通過上調(diào)肝胰腺中Pt14-3-3 基因的表達(dá)量來抑制肝胰腺中的細(xì)胞凋亡進(jìn)程，來參與環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。

注射副溶血弧菌和 WSSV 病毒后，肝胰腺中Pt14-3-3 基因的表達(dá)量整體上調(diào)，基本呈先上升后下降再上升的表達(dá)趨勢，上升趨勢表明Pt14-3-3 基因可能參與了三疣梭子蟹的免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過增加Pt14-3-3 基因的表達(dá)協(xié)助清除受損細(xì)胞，來維持其正常生理功能(Chang et al, 2008)。下降趨勢表明，機(jī)體可能處于感染后的恢復(fù)期，而再次的上升趨勢則可能是三疣梭子蟹恢復(fù)期后繼續(xù)清除殘留的副溶血弧菌和WSSV 病毒的表現(xiàn)。2 種致病病原導(dǎo)致的Pt14-3-3基因在肝胰腺中的表達(dá)到達(dá)最大值的時間不同，可能是由于三疣梭子蟹對于2 種病原的敏感程度和耐受程度不同。感染副溶血弧菌后，三疣梭子蟹14-3-3基因在血細(xì)胞中的表達(dá)量呈先下降再上升再下降的趨勢，該趨勢與脊尾白蝦感染W(wǎng)SSV 病毒后14-3-3基因(王有昆等, 2016)在血細(xì)胞中的變化趨勢及凡納濱對蝦感染桃拉病毒后14-3-3 蛋白(Chongsatja et al,2010)的變化趨勢相一致，表明三疣梭子蟹可能通過上調(diào)14-3-3 基因的表達(dá)來抑制肝胰腺和血細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡進(jìn)程，來參與三疣梭子蟹的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

本研究成功克隆了三疣梭子蟹14-3-3 基因cDNA全長，初步探究了該基因在三疣梭子蟹低鹽適應(yīng)中鰓和肝胰腺中的表達(dá)模式以及感染副溶血弧菌和WSSV 病毒后在肝胰腺和血細(xì)胞中的表達(dá)模式，證明Pt14-3-3 基因在三疣梭子蟹低鹽適應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮了作用，為進(jìn)一步研究三疣梭子蟹14-3-3基因在低鹽適應(yīng)中的分子機(jī)制及其免疫機(jī)制研究和病害防治提供了理論依據(jù)。