鐵氨基黏土-葡萄糖氧化酶納米復(fù)合催化劑的構(gòu)筑及多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)研究

李 柳，孫仕勇，呂 瑞，GOLUBEV Yevgeny Aleksandrovich，王 可，董發(fā)勤，段 濤，KOTOVA Olga Borisovna，KOTOVA Elena Leonidovna

（1.西南科技大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,綿陽(yáng)621000；2.俄羅斯科學(xué)院烏拉爾分院科米科學(xué)中心尤什金地質(zhì)研究所,瑟克特夫卡爾167982,俄羅斯；3.西南科技大學(xué)國(guó)防科學(xué)技術(shù)學(xué)院,綿陽(yáng)621000；4.圣彼得堡國(guó)立礦業(yè)大學(xué),圣彼得堡199106,俄羅斯）

酶是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生，具有高催化活性和特異性的蛋白質(zhì)或RNA，廣泛參與機(jī)體中的各種代謝反應(yīng)［1，2］.由于體內(nèi)的眾多代謝反應(yīng)通常需要多酶協(xié)同/級(jí)聯(lián)催化，因此，體外構(gòu)筑多酶協(xié)同/級(jí)聯(lián)催化體系將有助于深入研究體內(nèi)生化反應(yīng)，并為新型生物催化劑的構(gòu)筑提供幫助［3，4］.但是，天然酶在體外易受到高溫、極端pH和高離子強(qiáng)度等影響而失活，而且天然酶成本高，使用后難以回收利用［5，6］，因此限制了其規(guī)?；瘧?yīng)用.酶固定化技術(shù)是提高其穩(wěn)定性和重復(fù)利用性的有效手段［7～9］.將天然酶通過(guò)吸附［10，11］、包埋［12，13］和交聯(lián)［14，15］等方法負(fù)載到載體上，可以提高其在環(huán)境中的耐受性，從而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍.Pandey等［16］將葡萄糖氧化酶（GOx）共價(jià)固定在硫醇化的金納米顆粒上，測(cè)試結(jié)果表明，固定后的GOx對(duì)pH和溫度的耐受性均有所提高.Kim等［17］分別通過(guò)吸附和戊二醛交聯(lián)將α-胰凝乳蛋白酶和脂肪酶固定在介孔二氧化硅（HMMS）中，儲(chǔ)存14 d后酶活性無(wú)明顯降低.

納米酶是一類蘊(yùn)含酶學(xué)特性的納米材料［18，19］，與天然酶一樣，能夠在溫和條件下催化底物轉(zhuǎn)化，且比天然酶更加穩(wěn)定，即使在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和高溫等極端環(huán)境下也能保持較高的催化活性［20，21］.以納米酶為載體固定天然酶，不僅可以提高天然酶在極端環(huán)境下的穩(wěn)定性，還可以利用納米酶的催化活性與天然酶結(jié)合進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)［22］.近年來(lái)，碳基材料［23］、金屬納米粒子［24，25］和金屬氧化物［26，27］等納米材料已被廣泛用于構(gòu)建多酶級(jí)聯(lián)催化體系.Zhong等［28］將葡萄糖氧化酶（GOx）固定在金屬有機(jī)骨架［MOF-545（Fe）］上得到GOx@MOF-545（Fe），構(gòu)建了一種模擬辣根過(guò)氧化物酶-葡萄糖氧化酶（HRP-GOx）的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系，研究發(fā)現(xiàn)，該體系不僅表現(xiàn)出了優(yōu)異的催化穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，還能作為快速檢測(cè)葡萄糖的比色傳感器，對(duì)葡萄糖的檢測(cè)限低至0.28μmol/L.Jung等［29］將尿酸氧化酶（UOX）與金納米顆粒（AuNP）結(jié)合進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該UOX-AuNP級(jí)聯(lián)系統(tǒng)可利用AuNP的過(guò)氧化物酶活性消除具有潛在細(xì)胞毒性的H2O2，并對(duì)尿酸的降解速度比單獨(dú)使用UOX快5倍以上，從而可用于高尿酸血癥的治療.

氨基黏土是一類人工合成的具有層狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)黏土礦物［30］，其最大特點(diǎn)是能夠通過(guò)氨基質(zhì)子化在水中自主剝落成單片，而在乙醇等極性較小的溶劑中又可恢復(fù)為堆疊狀態(tài)［30，31］.剝落的單片可進(jìn)一步通過(guò)超聲處理獲得納米級(jí)黏土單元，并具有很強(qiáng)的與生物分子（脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA）相互作用的能力，可用于制備高穩(wěn)定性的功能化雜化材料［32，33］.由于氨基黏土易于制備且毒性低，目前已廣泛用作載體材料和吸附劑［34，35］.Kim等［36］制備了鎂氨基黏土并用于吸附紡織品陰離子染料活性紅120（RR120），結(jié)果表明，其吸附動(dòng)力學(xué)遵循準(zhǔn)二級(jí)Langmuir等溫方程模型，最大吸附量可達(dá)229.9 mg/g，是目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高值.Liu等［37］將葡萄糖氧化酶固定在鎂氨基黏土納米片基質(zhì)中得到葡萄糖氧化酶/鎂氨基黏土（GOD/AMP）復(fù)合物，再與納菲薄膜結(jié)合構(gòu)建了葡萄糖生物傳感器，研究結(jié)果表明，固定在AMP中的GOD保持了生物活性，并促進(jìn)了GOD在玻碳電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移，GOD/AMP復(fù)合修飾電極對(duì)溶解氧和葡萄糖均表現(xiàn)出靈敏的電催化響應(yīng).2013年，Lee等［38］首次報(bào)道了鐵氨基黏土（FeAC）具有優(yōu)異的類過(guò)氧化物酶活性，其能夠催化過(guò)氧化氫氧化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），與天然HRP相比，F(xiàn)eAC在較寬的pH范圍內(nèi)具有更高的催化活性.

本文以FeAC為載體，通過(guò)固定葡萄糖氧化酶構(gòu)筑了FeAC-GOx納米結(jié)構(gòu)酶.FeAC的存在不僅可以保護(hù)葡萄糖氧化酶的催化活性，而且能利用其本征的類過(guò)氧化物酶活性與葡萄糖氧化酶構(gòu)成級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系，從而直接將葡萄糖轉(zhuǎn)化為羥自由基并觸發(fā)顯色反應(yīng).該納米結(jié)構(gòu)酶不僅穩(wěn)定性良好，而且具有優(yōu)異的催化活性和重復(fù)利用性，為新型葡萄糖傳感器的開發(fā)奠定了基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，純度98%）購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O，純度99%）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，純度98%）、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，純度＞99%）和葡萄糖購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖氧化酶（GOx，100 U/mg）和辣根過(guò)氧化物酶（HRP，250 U/mg）購(gòu)于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)G250（純度＞90%）購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠；其它試劑均為分析純.

X′Pert PRO型X射線衍射（XRD）儀，荷蘭帕納科公司；Spectrum One型傅里葉變換紅外光譜（FTIR）儀，美國(guó)PE儀器公司；ULTRA 55型200 kV場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），德國(guó)蔡司儀器公司；UV-2800A型紫外-可見（UV-Vis）分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；Zetasizer Nano ZS 90型馬爾文激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司，

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 FeAC的合成 室溫下，將FeCl3·6H2O（8.4 g，31.08 mmol/L）溶于200 mL乙醇溶液中，超聲分散10 min；逐滴加入13 mL APTES溶液（58.3 mmol/L），APTES與FeCl3·6H2O的摩爾比約為2∶1，形成棕色沉淀漿液；以600 r/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌12 h；反應(yīng)結(jié)束后，以6000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，用乙醇溶液清洗2次，除去多余的FeCl3·6H2O，烘干得到FeAC，備用.

1.2.2 FeAC固定葡萄糖氧化酶 將EDC（25 mg）溶于10 mL磷酸鹽緩沖液（100 mmol/L，pH=7.0）中，配制成EDC溶液（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.25%）.將0.3 g FeAC加入10 mL EDC溶液中，室溫下置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中活化1 h，離心，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，除去殘余的EDC.

向活化后的FeAC中加入10 mL葡萄糖氧化酶溶液（3 mg/mL），置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩反應(yīng)3 h，于6000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，所得沉淀用PBS緩沖液清洗3次，除去未結(jié)合或結(jié)合不完全的酶；將制得的FeAC-GOx置于4℃冰箱中冷藏備用.FeAC-GOx的制備過(guò)程如Scheme 1所示.

Scheme 1 Schematic of the preparation of FeAC-GOx composite

1.2.3 酶固定化率的測(cè)定 采用Bradford法測(cè)定離心所得上層清液中蛋白質(zhì)的濃度，以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品上層清液中的蛋白含量，按下式計(jì)算酶固定化率E（%）.

式中：m0（mg）為固定化前酶蛋白總含量；m1（mg）為固定化后上層清液中酶蛋白的含量.

1.2.4 酶活性的測(cè)定 采用H2O2-TMB顯色反應(yīng)測(cè)定FeAC-GOx和游離酶的活性.首先，將TMB（20 mg）溶于10 mL無(wú)水乙醇中，配制TMB溶液（2 mg/mL）.將0.2 mL TMB溶液加入到1.8 mL PBS緩沖液（100 mmol/L，pH=7.0）中，再依次加入0.5 mL的葡萄糖溶液（100 mmol/L）和0.5 mL酶溶液（1 mg/mL）；將混合物在37℃下溫育1 h，于8000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，取上層清液用紫外-可見分光光度計(jì)在655 nm測(cè)量吸光度，每個(gè)樣品測(cè)量2～3次，取平均值；將每分鐘氧化1μmol葡萄糖為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫的酶量定義為1個(gè)酶活（U/mg）單位.

1.2.5 pH和溫度穩(wěn)定性測(cè)定 將FeAC-GOx和游離酶體系（GOx+HRP）分別在不同pH的磷酸緩沖液（pH=3.0～9.0，100 mmol/L）中放置5 h測(cè)定酶活性，考察其pH穩(wěn)定性.將FeAC-GOx和游離酶體系（HRP+GOx）在不同溫度（30～90℃）下溫育1 h，測(cè)定其酶活性，考察其溫度穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

2.1.1 XRD及FTIR分析 由FeAC和FeAC-GOx的XRD譜圖［圖1（A）］可知，F(xiàn)eAC在2θ=5.3°［d（001）=1.65 nm］處出現(xiàn)衍射峰，這是層狀有機(jī)黏土結(jié)構(gòu)的典型特征峰；在2θ=26.6°［d（020）=d（110）=0.34 nm］，2θ=34.6°［d（020）=d（110）=0.26 nm］處的平面內(nèi)反射寬峰強(qiáng)度很弱，是1∶1層狀硅酸鹽礦物（［H2N（CH2）3］4·［Si4Fe6O8（OH）2］，由1個(gè)硅氧四面體片和1個(gè)鐵氧八面體片結(jié)合而成）的特征峰［39］.固定化GOx后，部分酶蛋白分子進(jìn)入到FeAC的層間，層間距相應(yīng)增加［d（001）=2.13 nm］；通過(guò)Bradford法測(cè)得離心所得上層清液中GOx含量為7.6 mg，由式（1）計(jì)算出酶固定化率為76.4%，因此結(jié)合酶固定化率和FTIR表征結(jié)果可以推斷，GOx已固定在FeAC上.

Fig.1 XRD patterns(A)and FTIR spectra(B)of FeAC(a)and FeAC-GOx(b)

由FTIR圖［圖1（B）］可知，F(xiàn)eAC的譜線存在特征吸收峰Fe—O（697 cm-1），Si—O—Si（1040 cm-1），Si—O—C（1116 cm-1），—CH2彎曲振動(dòng)峰（1489 cm-1），—NH2彎曲振動(dòng)峰（1611 cm-1），—CH2（3042 cm-1）和—OH（3392 cm-1），與文獻(xiàn)［38］報(bào)道結(jié)果一致.FeAC在水溶液中剝落為單片后，片層上大量的—NH3+會(huì)與GOx上的—COOH基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的酰胺鍵（—CO—NH—）.對(duì)于FeAC-GOx，酰胺Ⅰ鍵位于1653 cm-1處，主要來(lái)自C=O的伸縮振動(dòng)，證實(shí)GOx以共價(jià)酰胺鍵負(fù)載到FeAC上［9，40，41］.

2.1.2Zeta電位及納米粒度分析Zeta電位是考察材料分散性與穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，分散粒子越小，Zeta電位絕對(duì)值越高，體系越穩(wěn)定.當(dāng)pH=7.0時(shí)，F(xiàn)eAC，GOx和FeAC-GOx的Zeta電位分別為15.6，-4.23和-31.9，GOx的電位為負(fù)值，而FeAC由于具有高密度帶正電荷的氨基，電位為正值.當(dāng)GOx固定到FeAC上后，F(xiàn)eAC-GOx的電位為負(fù)值，且絕對(duì)值大于FeAC，表明FeAC表面固定了帶負(fù)電的GOx，導(dǎo)致電位發(fā)生變化，并且Zeta電位絕對(duì)值的增大表明FeAC-GOx在水溶液中比游離酶更加穩(wěn)定.以上結(jié)果表明，F(xiàn)eAC-GOx在水溶液中表現(xiàn)出良好的分散性，不易發(fā)生聚集沉淀，有助于其類酶活性的發(fā)揮.由圖2可見，當(dāng)pH=7.0時(shí)，F(xiàn)eAC，GOx和FeAC-GOx的平均粒度分別為258.10，162.44和485.06 nm.通過(guò)粒度分析可知，固定GOx以后，F(xiàn)eAC-GOx的平均粒度增大，進(jìn)一步說(shuō)明GOx與FeAC形成了納米結(jié)構(gòu)復(fù)合物.

Fig.2 Particle size distribution of Fe-aminoclay,GOx and FeAC-GOx dispersed in aqueous solution

Fig.3 SEM images of FeAC(A)and FeAC-GOx(B)

2.1.3 形貌分析 圖3示出了FeAC（A）和FeAC-GOx（B）的結(jié)構(gòu)和形貌特征，可見，F(xiàn)eAC表面平滑，具有明顯的片層結(jié)構(gòu)［圖3（A）］，固定葡萄糖氧化酶后，F(xiàn)eAC表面變得粗糙［圖3（B）］，說(shuō)明其表面均勻負(fù)載了GOx顆粒.

2.2 FeAC-GOx的酶學(xué)特性

2.2.1 溫度和pH對(duì)酶活性的影響 首先，考察了30～90℃下FeAC-GOx的催化穩(wěn)定性.由圖4（A）可見，當(dāng)溫度低于60℃時(shí)，游離酶（GOx+HRP）活性較高；但隨著溫度的升高，游離酶活性逐漸降低，當(dāng)溫度升高至70℃時(shí)，游離酶活性小于20%，而FeAC-GOx在70℃時(shí)仍保留了近60%的活性；當(dāng)溫度升高至90℃時(shí)，游離酶已經(jīng)失去活性，而FeAC-GOx依然保持了40%的活性.由此說(shuō)明，F(xiàn)eAC-GOx的熱穩(wěn)定性高于游離酶.由于高溫會(huì)破壞酶的三維結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致酶催化活性降低，而GOx與FeAC共價(jià)結(jié)合后，增加了酶三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而使FeAC-GOx的熱穩(wěn)定性提高［42］.在30～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，底物與酶的碰撞幾率也會(huì)增大，進(jìn)而提高了固定酶的催化活性，但進(jìn)一步升高溫度會(huì)破壞酶蛋白的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致酶活性降低［40］.

Fig.4 Relative activity at different temperatures(A)and pH(B)for free GOx+HRP and FeAC-GOx

圖4 （B）示出了游離酶（GOx+HRP）和FeAC-GOx在pH=3.0～9.0范圍內(nèi)的酶活性.與FeAC-GOx相比，游離酶在極酸和極堿條件下的活性均有所下降，尤其在pH=9.0時(shí)游離酶活性下降至20%，而FeAC-GOx在pH=3.0～8.0范圍內(nèi)均保持了較高的活性，即使在pH=9.0時(shí)酶活性也保持在約70%.以上結(jié)果表明，F(xiàn)eAC作為載體顯著降低了環(huán)境pH對(duì)GOx的影響，致使FeAC-GOx表現(xiàn)出更高的pH耐受性［43，44］.

2.2.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性及重復(fù)使用性 從實(shí)用和經(jīng)濟(jì)角度看，酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)使用性均是其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵，因此，構(gòu)建具有高儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)利用性的多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系對(duì)于實(shí)際應(yīng)用極為重要［45］.實(shí)驗(yàn)測(cè)定了在4℃下儲(chǔ)存7 d后游離酶（GOx+HRP）和固定酶（FeAC-GOx）的催化活性.由圖5（A）可見，在儲(chǔ)存7 d后FeAC-GOx納米復(fù)合物的催化活性大于80%，而游離酶的酶活卻小于40%，說(shuō)明FeAC-GOx具有優(yōu)異的儲(chǔ)存穩(wěn)定性.此外，F(xiàn)eAC-GOx在重復(fù)使用6次以后，催化活性仍大于90%［圖5（B）］.

Fig.5 Storage stability at 4℃of free GOx+HRP and FeAC-GOx(A)and cycle numbers for FeAC-GOx(B)

以上結(jié)果表明，GOx通過(guò)共價(jià)相互作用固定到FeAC上以后，提高了催化穩(wěn)定性.與游離酶相比，F(xiàn)eAC-GOx在高溫、強(qiáng)酸堿環(huán)境下均有更高的耐受性，并且具有良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，在實(shí)際應(yīng)用中具有廣闊的前景.

2.2.3 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù) 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax（mmol·L-1·min-1）是指最大反應(yīng)速率，即當(dāng)酶的活性位點(diǎn)完全被底物占據(jù)時(shí)的反應(yīng)速率；Km（mmol/L）是指反應(yīng)速率達(dá)Vmax值一半時(shí)所需的底物濃度，表示酶對(duì)底物的親和力，Km值越小，則酶與底物之間的親和力越強(qiáng).Km和Vmax都是酶固有的特性，與其自身性質(zhì)有關(guān)，酶固定化前后可能會(huì)發(fā)生動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化.在pH=4.0和37℃條件下，分別以不同濃度的葡萄糖和TMB為底物，測(cè)定了游離酶（GOx+HRP）和FeAC-GOx的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以底物濃度倒數(shù)（c-1）橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速度倒數(shù)（V0-1）為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk曲線（圖6），動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果列于表1.

Fig.6 Lineweaver-Burk plots of the free GOx+HRP and FeAC-GOx with glucose(A)and TMB(B)as substrate,respectively

Table 1 Kinetic parameters of the free GOx+HRP and FeAC-GOx

由表1可知，以葡萄糖或TMB為底物時(shí)，F(xiàn)eAC-GOx的Km值均大于游離酶（GOx+HRP），說(shuō)明游離酶與葡萄糖或TMB的親和力要優(yōu)于FeAC-GOx.這是因?yàn)槊概cFeAC的結(jié)合增大了GOx的空間位阻，使酶與底物的親和能力下降.而FeAC-GOx的最大反應(yīng)速率大于游離酶，表明在溫度、pH、葡萄糖和TMB濃度及游離酶和固定酶濃度均相同的情況下，F(xiàn)eAC-GOx具有更高的催化能力，這主要?dú)w因于“納米尺度鄰近效應(yīng)”最小化了中間體的分解［22，46］.

Scheme 2 Schematic of the cascade reaction catalyzed by FeAC-GOx

2.2.4 催化機(jī)理 FeAC-GOx多級(jí)酶聯(lián)催化體系的催化機(jī)理如Scheme 2所示.葡萄糖通過(guò)GOx的作用被氧化為葡萄糖酸和H2O2，生成的H2O2又在FeAC的催化下生成羥自由基（·OH），從而將無(wú)色的TMB氧化為典型的藍(lán)色氧化態(tài)TMB（ox-TMB）.

3 結(jié) 論

以鐵氨基黏土為載體，通過(guò)共價(jià)固定葡萄糖氧化酶得到鐵氨基黏土-葡萄糖氧化酶（FeAC-GOx）納米復(fù)合催化劑，整合了納米酶的穩(wěn)定性和天然酶的高催化活性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)eAC-GOx表現(xiàn)出良好的分散性，與游離酶相比，F(xiàn)eAC-GOx不僅具有高催化活性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性，而且對(duì)溫度、酸和堿都具有更高的耐受性.該研究為新型葡萄糖傳感器的開發(fā)奠定了基礎(chǔ).