異構(gòu)酶在生物制造中的研究進(jìn)展

徐錚，徐愷，陳昱金，李麗，付銘洋

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，211816)

異構(gòu)酶(isomerase)是七大酶類中的第五種，以EC5分類號命名，催化分子內(nèi)的幾何或者結(jié)構(gòu)重排。可細(xì)分為差向異構(gòu)酶(epimerase)、消旋酶(racemase)、互變異構(gòu)酶(tautomerase)、變位酶(mutase)和順反異構(gòu)酶(cis-transisomerase)等。自然界常見的物質(zhì)如氨基酸和糖類都可能存在同分異構(gòu)體，其分子質(zhì)量相同，僅僅是原子空間排布不一致。它們彼此間?？赏ㄟ^異構(gòu)酶來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，異構(gòu)酶催化的反應(yīng)即異構(gòu)反應(yīng)(isomerization)，這類反應(yīng)往往是受到熱力學(xué)影響的可逆反應(yīng)，即酶對底物和產(chǎn)物都具有催化能力，在達(dá)到化學(xué)平衡后產(chǎn)物比例不再發(fā)生變化。異構(gòu)反應(yīng)最為人熟知的是果葡糖漿的生產(chǎn)過程，即利用葡萄糖異構(gòu)酶(也稱木糖異構(gòu)酶、GIase)催化D-葡萄糖獲得D-果糖，轉(zhuǎn)化率一般為42%[1]。由于D-果糖的甜度較蔗糖高而D-葡萄糖又較之低，因此兩者的混合物甜度與蔗糖接近(10%糖度下，55型果葡糖漿甜度與蔗糖一致、42型甜度為蔗糖的90%左右)。美國盛產(chǎn)玉米，因此大量的玉米淀粉可以水解為D-葡萄糖，進(jìn)一步可以轉(zhuǎn)化為果葡糖漿,果葡糖漿的推廣解決了美國玉米產(chǎn)業(yè)的過剩問題，大型飲料企業(yè)如可口可樂在產(chǎn)品中廣泛添加了果葡糖漿并為人熟知。早在2006年全球果葡糖漿產(chǎn)能就達(dá)到1 000萬t，被譽(yù)為一項(xiàng)劃時代的發(fā)明。果葡糖漿的成功證明了異構(gòu)酶是具有重要產(chǎn)業(yè)價值的工業(yè)酶，然而許多異構(gòu)酶催化的反應(yīng)還沒有得到深入的研究與重視，異構(gòu)酶在工業(yè)酶中的占比仍比較低(約3%)。針對異構(gòu)酶的挖掘改造以及應(yīng)用研究還需要更加深入的總結(jié)與思考。本文結(jié)合自身的研究經(jīng)歷，綜述了異構(gòu)酶在生物制造領(lǐng)域尤其是食品、藥品、藥物中間體方向的研究現(xiàn)狀并展望了未來發(fā)展方向，為異構(gòu)酶的開發(fā)研究提供借鑒。

1 異構(gòu)酶與生物制藥

乳果糖(lactulose)也叫乳酮糖,是D-半乳糖基和D-果糖基通過β-1,4糖苷鍵連接而成的還原性二糖,具有治療便秘、肝性腦病、調(diào)節(jié)腸道菌群等功效，是人類最早使用的益生元之一[2]。乳果糖在一百多個國家作為非處方藥銷售，2009年全球需求量就已突破5萬t。乳果糖是乳糖的同分異構(gòu)體，乳糖在堿性加熱的條件下就可以自發(fā)異構(gòu)為乳果糖。乳果糖的化學(xué)合成方法簡單，使用硼酸或偏鋁酸鈉在堿性條件下催化即可得到且轉(zhuǎn)化率較高(一般>75%)[3]。然而硼有毒性、鋁是重金屬，因此必須完全去除才可以作為食藥產(chǎn)品銷售[4]。但徹底去除較為困難，且食藥領(lǐng)域?qū)Ξa(chǎn)品中硼含量的監(jiān)管非常嚴(yán)格，因此實(shí)際產(chǎn)業(yè)化難度很大；相關(guān)技術(shù)被國外企業(yè)如蘇威集團(tuán)、雅培制藥、韓美藥業(yè)等公司壟斷。近來發(fā)現(xiàn)乳果糖可以通過纖維二糖差向異構(gòu)酶(cellobiose 2-epimerase，EC 5.1.3.11，CE酶)直接催化乳糖得到，另有一定的副產(chǎn)物依匹乳糖(epilactose)產(chǎn)生(圖1)[5]。

圖1 CE酶催化乳糖產(chǎn)生乳果糖和依匹乳糖的示意圖Fig.1 Schematic diagram of CE enzyme catalyzing lactose to produce lactulose and epilose

此后，生物法制備乳果糖的技術(shù)路線得到了廣泛重視，已發(fā)表文獻(xiàn)中十多種不同來源的CE酶獲得了研究。其中2012年報道的CE酶來源于極端嗜熱纖維素降解菌Caldicellulosiruptorsaccharolyticus菌株(CSCE酶)，CSCE對乳糖的催化溫度為80 ℃、pH 7.5，產(chǎn)率為58%，生產(chǎn)效率204 g/(L·h)；依匹乳糖產(chǎn)率15%，生產(chǎn)效率54 g/(L·h)，這項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)使得生物異構(gòu)制造乳果糖成為可能[6]。除了CSCE，已報道的其他CE酶還包括：Caldicellulosiruptorobsidiansis、Dictyoglomusturgidum、Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum、Ruminococcusalbus、Rhodothermusmarinus、Spirochaetathermophila、Bacteroidesfragilis等[7]。然而其中多數(shù)來源的酶只產(chǎn)依匹乳糖，如R.albus、R.marinus、B.fragilis等，轉(zhuǎn)化率約30%[8]，而僅有幾種高溫型CE酶在催化底物數(shù)小時內(nèi)產(chǎn)生乳果糖。以乳糖和硼酸的摩爾比1∶1來添加硼酸，CE酶對乳糖的底物轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到88%，副產(chǎn)物含量也較少，其中依匹乳糖不到2%[9]。然而硼酸的用量仍然偏高，徹底去除硼酸的難度很大。現(xiàn)有催化技術(shù)仍以大腸桿菌為主，大腸桿菌可產(chǎn)內(nèi)毒素，因此不符合食品安全需求，對食品級或GRAS級宿主的開發(fā)是下一步努力的方向。WU等[10]成功將CE酶基因在食品級的枯草芽孢桿菌WB800中表達(dá)并制備了固定化酶反應(yīng)器，結(jié)果表明該系統(tǒng)在表達(dá)量上能夠達(dá)到較高水平；將CE酶固定化為酶膜反應(yīng)器(enzyme membrane reactor，EMR)后可以重復(fù)催化10個批次。由于各國藥典對乳果糖產(chǎn)品中依匹乳糖的含量有嚴(yán)格限定，因此如何控制依匹乳糖比例極為重要，實(shí)際操作難度很大。有研究表明依匹乳糖也能調(diào)節(jié)腸道菌群，是一種潛在的腸道益生元而對人體無害；這為放寬藥典標(biāo)準(zhǔn)提供了可能，因此有必要對依匹乳糖進(jìn)行充分的研究。這類研究的困難在于如何獲取高純度依匹乳糖：其在色譜分離過程中的出峰時間與乳糖極為接近，因此難以通過色譜法將兩者分離。利用β-半乳糖苷酶可以水解未反應(yīng)完的乳糖為D-半乳糖和葡萄糖，再通過酵母除去這些單糖；經(jīng)色譜分離可以得到91.1%純度的依匹乳糖，其缺點(diǎn)在于β-半乳糖苷酶的專一性不強(qiáng)，導(dǎo)致依匹乳糖有16%的損耗[11]。依匹乳糖在動物體內(nèi)的初步驗(yàn)證表明：依匹乳糖對雙歧桿菌的增值效果明顯，但對厭氧菌和乳酸菌則一般，總體效果略遜于低聚果糖(fructooligosaccharides，F(xiàn)OS)[12]。

L-核糖(L-ribose)是D-核糖的同分異構(gòu)體，它是可以通過異構(gòu)酶制造的藥物中間體[13]。天然的L-型單糖在自然界中含量很低，僅L-阿拉伯糖可以通過生物質(zhì)大量獲得，因此L-型單糖一直比較昂貴。L-核糖是非天然的L-型五碳糖，只在實(shí)驗(yàn)室中通過合成能夠獲得。L-核糖可以用作已上市的抗乙肝藥替比夫定(telbivudine)的合成砌塊，也可以作為其他幾種尚未上市抗病毒藥物的中間體，如：Clevudine、Levovirin、Maribavir等[14]。其中,英國制藥商夏爾(Shire)宣布美國FDA已授予實(shí)驗(yàn)性抗病毒藥物Maribavir(SHP620)治療移植患者巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染的突破性藥物資格，表明了較好的應(yīng)用前景。利用L-核糖還可以進(jìn)一步制備得到2-脫氧-L-核糖，后者可用于生產(chǎn)多種核苷類似物藥物，產(chǎn)品附加值較高。L-核糖的生物制備需要兩步反應(yīng)，出發(fā)底物為L-阿拉伯糖，中間產(chǎn)物為L-核酮糖(L-ribulose)。第一步反應(yīng)由L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化L-阿拉伯糖為L-核酮糖，轉(zhuǎn)化率低于30%[15]。但由于酮糖可與硼酸結(jié)合形成絡(luò)合物，因此可以在反應(yīng)體系中加入硼酸，使得剛生成的L-核酮糖即與硼酸絡(luò)合，脫離反應(yīng)體系，造成化學(xué)平衡持續(xù)向生成L-核酮糖的方向移動；最終轉(zhuǎn)化率可以提升至75%，生產(chǎn)強(qiáng)度375 g/(L·h)[16]。L-核酮糖-硼酸絡(luò)合物可以通過樹脂除去大部分的硼而釋放出L-核酮糖，后者通過甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶(mannose-6-phosphate isomerase，MPI)或L-核糖異構(gòu)酶(L-ribose isomerase，L-RI)催化為L-核糖[17]。這步反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率一般為70%，因此兩步反應(yīng)的最大理論轉(zhuǎn)化率約為52.5%，高于大多數(shù)化學(xué)工藝。值得注意的是，L-核酮糖的穩(wěn)定性與pH值和溫度關(guān)系密切，在堿性和高溫條件下L-核酮糖的損失很大[18]，因此L-核酮糖在制造工藝中的穩(wěn)定性需要考慮。比較第二步反應(yīng)的2種酶，MPI多為嗜熱酶，而L-RI均為常溫酶，因此就穩(wěn)定性而言，MPI用于工業(yè)催化的潛力更大，可與嗜熱型L-AI搭配使用。XU等[19]利用固定化的Paenibacilluspolymyxa來源的L-AI酶實(shí)現(xiàn)L-阿拉伯糖到L-核酮糖的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率為61.8%。玉米芯是玉米產(chǎn)業(yè)中常見的低值副產(chǎn)物，其中的半纖維素組分主要包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖三種單糖，L-阿拉伯糖占比可達(dá)35%。玉米芯常被水解后用于提取D-木糖制備木糖醇或低聚木糖，剩余廢液中的L-阿拉伯糖完全可以用于制備L-核酮糖，這樣的技術(shù)路線原料成本很低。即可通過濃縮先將水解液中含量較高的D-木糖結(jié)晶出來，剩下的L-阿拉伯糖用L-AI酶催化。由于大腸桿菌等宿主中含有阿拉伯糖操縱子，能夠消耗一定比例的L-核酮糖，因此使用全細(xì)胞催化需要敲除阿拉伯糖操縱子相關(guān)基因。

2 異構(gòu)酶與功能糖制造

肥胖可以導(dǎo)致多種衍生疾病，包括糖尿病、心腦血管病、呼吸系統(tǒng)疾病、癌癥等，造成肥胖的主要原因在于糖和脂肪攝入過量以及缺乏運(yùn)動。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)顯示,全球超重和肥胖的人數(shù)已超21億，而中國的肥胖人口超越美國排在首位。低熱量的蔗糖替代品將具有無比廣闊的市場，功能糖是指一類具有低熱量、調(diào)控血糖以及腸道益生功效的單糖、寡糖或糖醇，備受市場和研究者的關(guān)注。通過生物異構(gòu)法能夠制造的功能糖包括D-塔格糖(D-tagatose)、D-阿洛酮糖(D-psicose或D-allulose)、異麥芽酮糖(isomaltulose)或異麥芽酮糖醇(isomaltitol)、赤蘚糖醇(erythritol)等。D-塔格糖通過L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase，L-AI)催化D-半乳糖獲得，其甜度為蔗糖的92%，口感則相差無幾，熱量僅為蔗糖的38%[20]。D-塔格糖在烘焙中可以發(fā)生美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生引發(fā)食欲的焦糖色與香味，能夠改善腸道微生物菌群進(jìn)而促進(jìn)益生菌生長[21]。由于大部分代糖甜味劑的口感與蔗糖有較大差異，因此在市場中常不受歡迎，而D-塔格糖是目前最適合替代蔗糖的天然甜味劑之一。D-塔格糖曾作為糖尿病藥物進(jìn)入三期臨床實(shí)驗(yàn)，盡管最終失敗(有研究者認(rèn)為實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)錯誤導(dǎo)致了失敗)，但顯示出在降血糖方面具有一定效果，這對糖尿病患者十分有利。至今已有數(shù)十種L-AI酶得到解析研究，包括常溫、嗜熱、超嗜熱型L-AI。其中超嗜熱酶AnoxybacillusflavithermusL-AI的催化溫度能夠達(dá)到95 ℃，ThermotogamaritimaL-AI催化溫度達(dá)到90 ℃[22]。超嗜熱L-AI的穩(wěn)定性非常好，不容易失活。但過高的反應(yīng)溫度或偏堿性的催化條件都會造成底物和產(chǎn)物的褐變反應(yīng)，產(chǎn)生復(fù)雜的色素和副產(chǎn)物，因此嗜熱型(最適反應(yīng)溫度60～70 ℃)條件下的L-AI酶更適于應(yīng)用。例如Alicyclobacillusacidocaldarius、LactobacillusplantarumNC8、Geobacillusstearothermophilus等來源[23]。而偏堿性條件也會帶來褐變，最適反應(yīng)pH偏微酸性(pH 6～7)最為有利。XU等[24]篩選到LactobacillusfermentumCGMCC2921來源L-AI酶的最適反應(yīng)溫度為65 ℃、最適反應(yīng)pH 6.5，恰好在這一范圍內(nèi)，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的潛力。幾乎所有的L-AI酶都是金屬酶(metalloenzyme)，在EDTA處理后會喪失酶活性，金屬離子尤其是二價陽離子對酶活性和熱穩(wěn)定性有很大的提高作用。添加Mn2+和Co2+都能夠起到效果，其中Co2+的效果最好。但由于食品工業(yè)禁用Co2+，故添加Mn2+更為合適[25]。也有研究表明某些L-AI酶不需要額外添加金屬離子，或添加量很小(<1 mmol/L)[26]，可能的原因是活性中心與金屬離子的結(jié)合能力較強(qiáng)，故金屬離子不易脫落。D-塔格糖生物制備工藝的缺點(diǎn)在于底物D-半乳糖較為昂貴，由于通過乳糖水解可以獲得D-半乳糖，因此開發(fā)乳糖至D-塔格糖的一步法工藝較有前途。XU等[27]通過共表達(dá)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，實(shí)現(xiàn)了從乳糖到D-塔格糖的一步生物法制備[27]。使用食品級宿主也是D-塔格糖生產(chǎn)亟待解決的問題，例如利用pEKEx2質(zhì)粒可將L-AI基因在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)，結(jié)果取得了較高的表達(dá)量[28]。D-塔格糖的純化需要色譜分離，回收的D-半乳糖可以再利用以降低成本，回收工藝一般使用模擬移動床色譜法(simulated moving bed chromatography，SMBC)。由于D-半乳糖是醛糖而D-塔格糖是酮糖，這種差異使其分離效果相對較好，D-塔格糖可以達(dá)到很高純度并能夠結(jié)晶成為晶體[29]。又由于D-塔格糖的酮糖性質(zhì)，它可以與硼酸結(jié)合形成絡(luò)合物，然后脫離反應(yīng)體系。這會打破反應(yīng)平衡，使得反應(yīng)繼續(xù)朝產(chǎn)物生成方向進(jìn)行，顯著提升終產(chǎn)物含量[30]。

D-塔格糖于2014年在我國被批準(zhǔn)為新食品原料，而早在2001年美國FDA即給予它普遍公認(rèn)安全的GRAS(generally recognized as safe)認(rèn)證[31]。因此D-塔格糖的應(yīng)用前景光明，但國內(nèi)目前僅見數(shù)家公司有相關(guān)產(chǎn)品且產(chǎn)能很低。其主要限制因素在于成本問題，蔗糖替代品一定是大宗產(chǎn)品，因此必須盡可能降低成本。由于D-半乳糖的產(chǎn)能較小，作為原料使用價格偏高，導(dǎo)致成品D-塔格糖的價格居高不下，達(dá)每公斤數(shù)百元人民幣。就目前工藝來看，擴(kuò)大D-半乳糖產(chǎn)能是一條有效的途徑。D-半乳糖的制備一般通過乳糖酶水解乳糖(β-半乳糖苷酶處理)，所得D-半乳糖和葡萄糖通過模擬移動床色譜分離，也可以培養(yǎng)不能消耗D-半乳糖但可以利用葡萄糖的微生物處理水解液獲得高純度的D-半乳糖。除此以外，近期也有報道通過合成生物學(xué)方法構(gòu)建D-塔格糖的直接合成途徑。例如LIU等[32]將2種外源性的氧化還原酶(XR和GDH)和一種乳糖酶gh1-1構(gòu)建到釀酒酵母中，實(shí)現(xiàn)了乳糖直接轉(zhuǎn)化為D-塔格糖。但這種方法所得D-塔格糖濃度不是特別高(37.7 g/L)，發(fā)酵周期長(300 h)，經(jīng)濟(jì)性還有待進(jìn)一步考察。

D-阿洛酮糖(D-allulose或D-psicose)是D-果糖的C-3位差向異構(gòu)體，天然的D-阿洛酮糖可見于無花果中，食用后熱量近乎為零[33]。D-阿洛酮糖可以抑制脂肪肝酶和腸道α-糖苷酶，從而降低體內(nèi)脂肪的積累和抑制血糖濃度的上升。2014年FDA認(rèn)證D-阿洛酮糖為GRAS食品，標(biāo)志其產(chǎn)業(yè)化前景光明。通過D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose-3-epimerase，DTE)或D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(D-psicose-3-epimerase，DPE)催化D-果糖都可得到D-阿洛酮糖。D-果糖一般由D-葡萄糖經(jīng)過葡萄糖異構(gòu)酶催化后再分離獲得，最高可達(dá)到90%純度(F90型果葡糖漿)；它的價格低于結(jié)晶果糖，作為底物具有成本優(yōu)勢。迄今已有十多種DTE被研究，包括Agrobacteriumtumefaciens、Clostridiumsp.、Clostridiumcellulolyticum、Rhodobactersphaeroides、Pseudomonascichorii等，對高濃度D-果糖的最高轉(zhuǎn)化率有32.9%(D-果糖質(zhì)量濃度700 g/L)[34]。DTE酶已在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)成功，利用20 mg/L青霉素和10%甲苯透性化處理重組谷氨酸棒桿菌，反應(yīng)40 min對750 g/LD-果糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到31%，實(shí)現(xiàn)了食品級宿主制備D-阿洛酮糖的應(yīng)用[35]。目前的技術(shù)瓶頸在于D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶催化D-果糖的轉(zhuǎn)化率低，由于該反應(yīng)是可逆反應(yīng)，受化學(xué)平衡限制轉(zhuǎn)化率難以提高。解決的方法是篩選具有不同反應(yīng)機(jī)制的新酶，這存在很大的運(yùn)氣成分；或開發(fā)高效的底物—產(chǎn)物分離方法，使得未反應(yīng)底物以高收率再利用，降低生產(chǎn)成本。D-阿洛酮糖還可以進(jìn)一步催化獲得D-阿洛糖，該催化反應(yīng)使用L-鼠李糖異構(gòu)酶，轉(zhuǎn)化率30%[36]。通過模擬移動床技術(shù)可以將D-阿洛糖分離得到，純度可達(dá)95%[37]。由于轉(zhuǎn)化率較低，底物過于昂貴，D-阿洛糖的產(chǎn)業(yè)化還需要更多的研究。

異麥芽酮糖(isomaltulose)是蔗糖的同分異構(gòu)體，它經(jīng)過化學(xué)加氫后可制得異麥芽酮糖醇，也稱帕拉金糖(商品名Palatinose)，是FDA認(rèn)證的GRAS級食品[38]。異麥芽酮糖通過蔗糖異構(gòu)酶(sucrose isomerase，SI)催化蔗糖獲得，該催化過程伴有副產(chǎn)物形成，包括海藻酮糖(trehalulose)、少量的單糖D-葡萄糖和D-果糖[39]。有趣的是某些SI酶催化蔗糖產(chǎn)物中海藻酮糖占主要成分，例如P.mesoacidophilaMX-45和A.radiobacterMX-232來源[40-41]；目前還沒有發(fā)現(xiàn)海藻酮糖的用途，因此限制海藻酮糖的產(chǎn)生有實(shí)際意義。XU等[42]通過解析SI酶的高分辨率蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)活性口袋附近的一段無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)對產(chǎn)物比例有較大影響。在這段loop區(qū)進(jìn)行氨基酸殘基的替換可以改變終產(chǎn)物中異麥芽酮糖與海藻酮糖的比例，由87%∶13%(海藻酮糖)變?yōu)?4%∶56%。分子動力學(xué)模擬研究表明無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)發(fā)生氨基酸殘基替換后，殘基R333與E428形成氫鍵，削弱了R333與呋喃型果糖基的作用。這將導(dǎo)致游離的呋喃型果糖基可以發(fā)生互變異構(gòu)，形成吡喃型果糖后重新與葡萄糖基團(tuán)結(jié)合產(chǎn)生海藻酮糖，使其比例大幅提升。表面展示是提升催化效率的有效方法，釀酒酵母表面展示技術(shù)可用于SI酶的應(yīng)用，而且釀酒酵母是食品級宿主，因而更具有工業(yè)化前景；LEE等[43]將Enterobactersp.FMB-1來源SI酶通過GPI型壁蛋白錨定在細(xì)胞表面，并通過FACS技術(shù)篩選高活力的細(xì)胞株，經(jīng)過表面展示的SI酶還具有更好的熱穩(wěn)定性。

3 異構(gòu)酶與小品種氨基酸制造

自然界常見的氨基酸均為L-構(gòu)型、D-構(gòu)型的氨基酸(包括D-與L-混合的DL-型)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，較為罕見，因此具有特殊用途。DL-丙氨酸是L-丙氨酸的消旋產(chǎn)物，甜度較大可用做食品調(diào)味劑或營養(yǎng)強(qiáng)化劑；也可用于合成維生素B6或用作農(nóng)藥與醫(yī)藥中間體等。DL-丙氨酸可通過異構(gòu)酶反應(yīng)生產(chǎn)，利用丙氨酸消旋酶(L-alanine racemase)催化部分L-丙氨酸為D-丙氨酸(轉(zhuǎn)化率50%)，所獲得產(chǎn)品即旋光度為零的DL-丙氨酸。已報道的丙氨酸消旋酶來源于Streptoccocusfaecalis、Salmonellatyphimurium、Bacillussubtilis等微生物[44]，但利用食品級宿主表達(dá)丙氨酸消旋酶才能用于食品工業(yè)，DL-丙氨酸經(jīng)微生物降解后還可以獲得純的D-丙氨酸可用于其他用途。與之類似，DL-谷氨酸也可以通過谷氨酸消旋酶(glutamate racemase)催化L-谷氨酸獲得，DL-谷氨酸再經(jīng)過谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD酶)作用產(chǎn)生γ-氨基丁酸(GABA)和D-谷氨酸，經(jīng)過下游分離可以將兩者分開[45]；由于DL-和D-谷氨酸的價格昂貴，故由此工藝可以提高L-谷氨酸的產(chǎn)品附加值。以上研究表明，異構(gòu)酶可以提升氨基酸的產(chǎn)品附加值，為小品種氨基酸的產(chǎn)業(yè)化制備提供了途徑。

4 工業(yè)用異構(gòu)酶的改造研究

學(xué)者們針對前述各類異構(gòu)酶展開了大量研究，主要目的在于改造它們從而獲得更好的催化性能和熱穩(wěn)定性(如表1總結(jié))，下面列舉有代表性的案例。對CE酶的改造包括酶活力的提升、熱穩(wěn)定性增強(qiáng)、副產(chǎn)物降低等幾個方面。對RuminococcusalbusCE的研究表明保守殘基R52、H243、E246、W249、W304、E308和H374影響酶活力，其丙氨酸突變體均完全失活，F(xiàn)114和W303也對活性有很大影響。晶體結(jié)構(gòu)研究表明，H243、W249、H374、H377和M378位于活性中心入口處，R52和F114在活性中心的底部，2個組氨酸H374和H243作為廣義酸堿執(zhí)行催化反應(yīng)；活性口袋的整體疏水性較強(qiáng)，確保底物不被水解[46]。對CSCE的研究表明，雙點(diǎn)突變E161D/N365P酶活性半衰期延長了4倍，最適反應(yīng)溫度由80 ℃上升到87.5 ℃，對乳糖的催化效率kcat/Km上升了29%[47]。通過4輪基于隨機(jī)突變的定向進(jìn)化篩選，SHEN等[48]又將CSCE的酶活性和催化效率分別提升了2.8和3倍，突變體酶有5個位點(diǎn)改變(R5M/I52V/A12S/K328I/F231L)。令人意外的是突變體酶不產(chǎn)依匹乳糖，使得乳果糖產(chǎn)率上升到76%。由于R5、A12、K328和F231都是位于CSCE酶表面的殘基，因此它們對產(chǎn)物選擇性的影響尚無法闡述。而I52距離活性中心仍然較遠(yuǎn)，因而需要晶體結(jié)構(gòu)研究進(jìn)一步揭示這些殘基對催化產(chǎn)生的影響。對L-AI酶的改造包括酶活力提升、最適溫度和pH改造等，G.thermonitrificansL-AI的突變體F280 N/C450S/N475K具有更高的轉(zhuǎn)換數(shù)kcat值，達(dá)到6 245 min-1，催化效率kcat/Km達(dá)到4.7 L/(mmol·min)[49]。對MPI酶的改造包括定點(diǎn)突變獲得R142 N突變體，其kcat值達(dá)到81 063 s-1，是野生型的1.6倍[50]?？偨Y(jié)以上研究可得出結(jié)論，異構(gòu)酶普遍缺乏高通量的突變體篩選方法，產(chǎn)物檢測依賴高效液相色譜，因此常使用基于理性設(shè)計(jì)的定點(diǎn)突變方法以減少樣品數(shù)量。

表1 針對工業(yè)異構(gòu)酶的部分改造研究Table 1 Summary of modifications on industrial isomerases

5 異構(gòu)酶在生物制造中的前景展望

異構(gòu)酶是生物異構(gòu)反應(yīng)的關(guān)鍵，因此挖掘性能更好的異構(gòu)酶或?qū)ΜF(xiàn)有酶源進(jìn)行改造是研究的重點(diǎn)。異構(gòu)酶多具有寬泛的底物譜，但對每一種底物的轉(zhuǎn)化率可能都不高，篩選到優(yōu)異的新酶常有賴于“運(yùn)氣”；盲目性比較大。因此基于定向進(jìn)化或理性設(shè)計(jì)改造現(xiàn)有酶庫是更加可行的手段，這需要建立一個簡便的具有普適性的高通量篩選方法。近年來,基于流式細(xì)胞儀的熒光激活細(xì)胞分選術(shù)成功應(yīng)用于多種工業(yè)酶的高通量篩選，該技術(shù)對于異構(gòu)酶也應(yīng)具有良好的效果，但設(shè)計(jì)異構(gòu)產(chǎn)物相應(yīng)的高特異性指示探針是先決條件。另一方面，由于工業(yè)化過程的環(huán)境較為苛刻，因此對酶的穩(wěn)定性提出很高要求。解決這一問題的思路分以下幾種：(1)篩選嗜熱酶，嗜熱酶具有較高的反應(yīng)溫度(一般達(dá)到60～90 ℃)，這類酶在常溫或低溫下的穩(wěn)定性十分優(yōu)異，適合儲存也適合重復(fù)利用；催化中一般采用略低于最適反應(yīng)溫度的條件，同時延長反應(yīng)時間，可以達(dá)到最優(yōu)效果并大幅提升活性半衰期，顯著降低制備或購買酶帶來的成本。(2)開發(fā)固定化酶技術(shù)，將新型材料與異構(gòu)酶結(jié)合，近年來較熱門的材料包括金屬有機(jī)框架材料、磁性納米微粒、無機(jī)雜化納米花等。已發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)酶多數(shù)屬于金屬酶，需要金屬離子參與反應(yīng)或幫助穩(wěn)定酶的三維構(gòu)象，因此在反應(yīng)或貯存過程中添加一定濃度的金屬離子有助于提高酶的活性和穩(wěn)定性。然而，離子的選擇應(yīng)當(dāng)考慮到產(chǎn)品的應(yīng)用場景，例如許多離子在食品行業(yè)中是禁止的，研發(fā)時應(yīng)優(yōu)先考察金屬離子濃度需求較低的酶源。異構(gòu)反應(yīng)的一個優(yōu)勢在于很少需要輔因子或輔酶的介入，因此不需要添加非常昂貴的輔因子或輔酶，也無需使用完整細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)催化，這在很大程度上增加了異構(gòu)酶產(chǎn)業(yè)化的可能性。當(dāng)然我們要看到，異構(gòu)反應(yīng)也有其缺陷的一面，例如異構(gòu)反應(yīng)一般是可逆反應(yīng)，底物在催化過程中無法實(shí)現(xiàn)全部轉(zhuǎn)化；未得到利用的殘留底物一方面降低了生產(chǎn)效率，另一方面增加了產(chǎn)物分離提取的難度。此外，異構(gòu)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率受熱力學(xué)影響很大，許多反應(yīng)要在較高溫度下才能獲得滿意的轉(zhuǎn)化率，這對酶的來源(是否為嗜熱酶)、酶的熱穩(wěn)定性、底物和產(chǎn)物的穩(wěn)定性、高溫是否產(chǎn)生副產(chǎn)物等都提出了一定要求。前述也提到可用兩步氧化還原反應(yīng)替代一步異構(gòu)反應(yīng)，并取得不錯的效果。因此我們在生物制造的路線選擇中應(yīng)當(dāng)靈活選用，以追求更低成本和更高效率作為最根本的標(biāo)準(zhǔn)?？偟膩碚f，異構(gòu)酶在生物制造中的應(yīng)用領(lǐng)域逐年拓寬，近十年來的技術(shù)積累已厘清了技術(shù)革新的方向，相信異構(gòu)酶在新一代生物制造技術(shù)中將占有一席之地。