礦物質復合微量元素對嗜酸乳桿菌效能影響的初步研究

黃金珠， 樸金一， 姜成哲

（延邊大學農學院，吉林延吉133002）

自然界約存在70 多種在人體中含量極低的微量元素，其中一部分就分布在土壤礦物質中。微量元素在生物體中雖然含量極微小， 但對生物機體的正常運轉卻起著巨大的作用。它們參與酶、激素、維生素和核酸的代謝過程，缺少微量元素會導致各種疾病的發(fā)生。 微量元素對人和動物甚至微生物都能產生很大的影響， 在不同微量元素豐富的環(huán)境下培養(yǎng)的微生物會產生原有功能的提升或下降（王立芳，2019）。

乳酸菌是一類利用無氧呼吸將碳水化合物轉化為乳酸的細菌。乳酸菌在自然界分布極為廣泛，包含18 個種，200 多個屬， 是人體不可缺少的最重要的益生菌之一，其被廣泛運用在醫(yī)藥、食品、保健方面。 不同的微量元素對于乳酸菌的影響也不盡相同（王明玥等，2020； Feng 等，2016）。 目前富硒、鍺、鋅、銅的乳酸菌都已經有很多研究成果，但對于復合礦物微量元素對于乳酸菌功能影響的研究還比較缺少， 因此本試驗通過體內和體外試驗， 研究礦物復合微量元素對乳酸菌益生性能的影響，并為相關疾病治療提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料 嗜酸乳桿菌來自延邊大學微生物實驗室， 普通培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌組命名為C 組， 添加礦物微量元素培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌命名為K 組。本試驗中添加的礦物復合微量元素K 制劑為延邊某公司研制中的保密配方制品。

1.2 試驗動物與分組 試驗選取60 只6 周齡昆明鼠，雌雄各半。 采用隨機分組法將雌雄小鼠各分為3 組，每組10 只，分別為空白組、對照組、試驗組。其中空白組飼喂不添加任何物質的普通飲用水， 對照組飼喂添加2%濃度為108cfu/mL普通嗜酸乳桿菌的飲用水， 試驗組飼喂添加2%濃度108cfu/mL 礦物復合微量元素嗜酸乳桿菌的飲用水，共喂養(yǎng)28 d。

1.3 主要試驗試劑 無水葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、谷氨酸鈉、醋酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵、氯化鈉、鄰二氮菲、無水乙醇、磷酸二氫鉀、DPPH、過氧化氫、抗壞血酸、膽固醇、牛膽鹽、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉等為分析純試劑；MRS 培養(yǎng)基、胃蛋白酶、瓊脂、K 制劑、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒，長春匯力生物技術有限公司。

1.4 主要儀器 高速離心機，上海繼譜電子科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海捷呈試驗儀器有限公司；分光光度計，杭州俊升科學器材有限公司；紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；疲勞轉棒儀，成都泰盟軟件有限公司；電子天平，萬特電子有限公司。

1.5 體外試驗

1.5.1 耐膽鹽試驗 將活化的嗜酸乳桿菌以5%的接種量接種到已處理的培養(yǎng)基內， 培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時間為24 h，分別對以上濃度的培養(yǎng)基的OD 值在620 nm 加以測定，對嗜酸乳桿菌對膽鹽的耐受力進行運算，計算公式為：

嗜酸乳桿菌存活率/%=含膽鹽的培養(yǎng)基的OD 值/空白培養(yǎng)基的OD 值×100。

1.5.2 嗜酸乳桿菌降膽固醇能力的測定 按照試劑盒說明書測定膽固醇含量； 降解率換算如下：

膽固醇降解率/%=[膽固醇含量（空白）-膽固醇含量（測量）]/OD 空白×100。

1.5.3 羥自由基清除能力的測定 在536 nm 下分別測量各組混合溶液的吸光度值得As，以蒸餾水代替樣品作為空白組測吸光度值得Ab，以蒸餾水替代H2O2作為損傷組，測其吸光度值An，以抗壞血酸代替樣品作為陽性對照， 抗氧化劑的羥自由基清除率按以下公式計算：

羥 自 由 基 清 除 率/%=[（As-An）/（Ab-An）]×100。

1.5.4 DPPH 自由基清除率的計算 本試驗中選取了嗜酸乳桿菌C 組、K 組樣本進行DPPH 清除率的測定與比對。

試驗方法： 向2 mL 的1.5×10-4mol/L DPPH溶液中加人2 mL 試樣，總體積4 mL。搖勻后于室溫下放置30 min 后， 于光徑1 cm 比色皿中測定DPPH 混合溶液在517 nm 處的OD 值。

抑制率/%＝（Ai-Aj）/Ac×100%；

DPPH 清除率/%＝1-G%；

式中：Ai 為2 mL DPPH 液+2 mL 提取液的吸光度，Aj 為2 mL 提取液+2 mL 溶劑的吸光度，Ac為2 mL DPPH 液+2 mL 溶劑的吸光度。

1.6 體內試驗

1.6.1 抗疲勞測試 小鼠抗疲勞測試需運用疲勞轉棒儀，提前設定轉速為20 r/s，將小鼠放在轉棒上即可開始測試，小鼠掉落后會自動停止計時。每只小鼠重復三次。

1.6.2 丙二醛含量的測定 吸取2 mL 的提取液于刻度試管中， 加入0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3 mL，于沸水浴上加熱10 min，迅速冷卻， 于4500 r/min 離心10 min。 取上清液于532、600 nm 波長下， 以蒸餾水為空白調透光率100%，測定吸光度。

丙二醛含量/（nmol/g）=（A532-A600）×反應液總量（5 mL）×V1.55×10-1×植物樣品重量（0.5 g）×反應液中的提取液數量（2 mL）；

式中：A 為吸光度；1.55×10-1為丙二醛的微摩爾吸光系數（在1 L 溶液中含有1 μmol 丙二醛時的吸光度）。

1.6.3 超氧化物歧化酶含量的測定 樣品超氧化物歧化酶（SOD）比活力/（U/mg）= 單位體積活力（U/mL）/樣品的蛋白含量（mg/mL）。1.6.4 谷胱甘肽過氧化物酶含量的測定 將1 mL樣品和1 mL 0.1 mol/L 的四氧嘧啶溶液加入到測定管內混勻， 再向其中依次加入1 mL，0.5 mol/L的且pH 為7.5 的磷酸鹽緩沖液以及0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，混勻。 6 min 后，加入1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，混勻，用紫外分光光度計于305 nm處測量光密度，讀取各管讀數。以此計算得到谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）濃度。

1.6.5 血清膽固醇和甘油三酯的測定 根據試劑盒說明書進行膽固醇和甘油三酯的測定。

1.7 數據統(tǒng)計分析 所有數據均應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計算P值。 若P＞0.05，則統(tǒng)計學上無顯著差異，若0.01 ＜P＜0.05，則在統(tǒng)計學上具有顯著差異，若P＜0.01，則在統(tǒng)計學上具有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 體外試驗

2.1.1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng) 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色后鏡下觀察到典型的乳桿菌。

2.1.2 耐膽鹽 嗜酸乳桿菌在動物體內能否發(fā)揮其益生作用， 與嗜酸乳桿菌在動物體內的存活率有關。如果嗜酸乳桿菌不能具有一定的耐酸、耐膽鹽能力，即使有較強的降解膽固醇能力，由于其在體內存活率過低也無法發(fā)揮作用。 一般人體內膽鹽濃度為0.15% ～0.3%， 所以本試驗設定了0%～0.3%的膽鹽濃度來觀察復合礦物微量元素是否有提高嗜酸乳桿菌耐膽鹽功能的效果。 測定結果如表1。 在0% ～0.3%膽鹽濃度下，K 組存活率分別比C 組提高0.4%、0.4%、5.8%、20.8%， 試驗結果表明， 礦物復合微量元素對于嗜酸乳桿菌的耐膽鹽能力有所提升。

表1 不同濃度膽鹽環(huán)境下嗜酸乳桿菌的存活率比較%

2.1.3 降解膽固醇能力 由表2 可知，K 組的膽固醇降解能力比C 組提高27.9%。在體外環(huán)境中，嗜酸乳桿菌具有一定的膽固醇降解能力， 且礦物復合微量元素一定程度上提升了嗜酸乳桿菌的降解膽固醇能力。

表2 嗜酸乳桿菌降解膽固醇能力比較%

2.1.4 羥自由基清除率 C 組羥自由基清除率為33.00%，K 組自由基清除率為37.77%（圖1）。K 組較C 組對羥自由基的清除率有一定程度的提升。

2.1.5 DPPH 清除率 DPPH 法是一種過程簡單快速的測試樣品自由基清除能力的試驗方法。 由表3 可知，K 組對DPPH 清除率較C 組有所上升。即礦物復合微量元素使嗜酸乳桿菌的清除自由基能力有所提高。

圖1 嗜酸乳桿菌羥自由基清除率對比

表3 嗜酸乳桿菌對DPPH 的清除率%

2.2 體內試驗

2.2.1 抗疲勞試驗 由表4 可知， 公鼠組試驗組與對照組相比顯著提升了試驗時長， 可以說明礦物復合微量元素嗜酸乳桿菌相比普通嗜酸乳桿菌對于機體的抗疲勞能力有顯著的提高效果。 母鼠組空白組與對照組抗疲勞試驗的時長沒有顯著提升，但試驗組與空白組有極顯著差異，時長大幅提升， 說明復合礦物微量元素嗜酸乳桿菌相比普通嗜酸乳桿菌能起到提升耐力的作用。

表4 抗疲勞試驗結果對比

2.2.2 超氧化物歧化酶含量測定結果 鼠肝腎組織SOD 測定結果如表5。結果表明，試驗組和對照組公鼠肝腎SOD 含量對比空白組均有一定程度的提升，但差異均不顯著（P＞0.05）。 對照組和試驗組母鼠肝臟SOD 含量均顯著高于空白組，試驗組與對照組雖然無顯著差異，但SOD 仍有小幅度提升。 試驗結果表明嗜酸乳桿菌對于母鼠肝臟SOD 有顯著提升效果。

2.2.3 丙二醛含量測定結果 小鼠肝腎組織MDA 含量的測定結果如表6。 結果表明，使用嗜酸乳桿菌后公鼠的肝腎MDA 值沒有顯著差異，說明在昆明鼠公鼠體內氧化平衡穩(wěn)定，沒有產生自由基過量而帶來的氧化損傷。 對照組和試驗組母鼠肝臟MDA 較空白組極顯著降低，說明嗜酸乳桿菌對于提升機體抗氧化能力效果極好。 對照組和試驗組腎臟MDA 含量較空白組極顯著降低，試驗組與對照組對比MDA 含量顯著下降，表明復合礦物微量元素提升了嗜酸乳桿菌的抗氧化作用。

表5 肝腎組織SOD 含量U/mg

表6 肝腎組織MDA 含量μmol/mg pro

2.2.4 谷胱甘肽過氧化物酶含量測定結果 小鼠肝腎組織GSH-Px 含量測定結果如表7。 空白組、對照組、試驗組公鼠與母鼠肝腎組織的GSH-Px 含量并無明顯變化，試驗結果表明此嗜酸乳桿菌提高機體抗氧化能力并不是通過提升GSH-Px 含量實現(xiàn)的，而是通過其他機制。 而復合礦物微量元素對于嗜酸乳桿菌提升GSH-Px 的能力并無影響。

表7 肝腎組織GSH-Px 含量U/mg pro

2.2.5 血清總膽固醇測定結果 由表8 可知，對照組公鼠的膽固醇含量極顯著高于空白組， 說明此嗜酸乳桿菌對昆明公鼠使用時， 產生了使血清總膽固醇升高的效果。 對照組與試驗組雖然無明顯差異， 但數值上可見血清總膽固醇含量有一定幅度的降低。 可見加入復合礦物微量元素培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌相比加入普通嗜酸乳桿菌對于降低血清總膽固醇起到了一定的效果。

表8 膽固醇測定結果mg/mL

對照組和試驗組母鼠組血清總膽固醇含量較空白組顯著降低。 試驗組與對照組并無明顯的差異，都有很好的降低血清總膽固醇的效果。而公鼠組飲用了加入嗜酸乳桿菌的水后， 膽固醇反而比空白組要高，推測可能與性別差異有關。且本試驗結果與體外膽固醇降解的試驗結果相對應， 說明礦物復合微量元素確實提升了嗜酸乳桿菌降低膽固醇的能力。

2.2.6 甘油三酯測定結果 由表9 可知， 公鼠的對照組與空白組無顯著差異， 而加入礦物復合微量元素培養(yǎng)的試驗組甘油三酯含量較空白組顯著降低。 試驗組的甘油三酯含量較對照組極顯著降低， 表明復合礦物微量元素培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌對降低甘油三酯效果非常明顯。 說明復合礦物微量元素使嗜酸乳桿菌降低甘油三酯的能力極顯著的提高。而在母鼠組中，對照組和試驗組甘油三酯含量較空白組顯著降低，試驗組對比對照組，甘油三酯含量有一定程度降低。 總體來講復合礦物微量元素對嗜酸乳桿菌降低血清甘油三酯的能力是有一定提升的。

表9 甘油三酯含量測定結果mg/mL

3 討論

乳酸菌種類繁多， 大多數都具有很好的益生效果，目前對于嗜酸乳桿菌功能性的研究有很多。趙瑞香等（2014）在對嗜酸乳桿菌同化吸附膽固醇作用機理的研究中發(fā)現(xiàn)， 嗜酸乳桿菌能夠有效地降低血清及培養(yǎng)介質中的膽固醇含量， 其作用機制主要是菌體吸收同化膽固醇于自身細胞內，從而使自身脂肪酸的組成發(fā)生改變， 達到降低膽固醇的作用。 張雅茹等（2017）在嗜酸乳桿菌對高脂模型小鼠影響的試驗研究中發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌能有效降低小鼠血清總膽固醇和甘油三酯的含量。羅波文等（2020）在研究中發(fā)現(xiàn)，當嗜酸乳桿菌濃度高于1.0×108cfu/mL 時， 能有效促進IPEC-J2的生長，并在一定程度上緩解H2O2導致的IPECJ2 氧化損傷， 使細胞的抗氧化能力得到顯著提升，并且能夠降低IPEC-J2 氧化損傷時胞漿內緊密連接蛋白的表達量， 使細胞緊密連接的屏障作用得到有力保障， 從而實現(xiàn)對細胞活力的提升。本試驗對于這些嗜酸乳桿菌主要具有的益生功能做出了常規(guī)培養(yǎng)嗜酸乳桿菌與添加復合礦物微量元素培養(yǎng)嗜酸乳桿菌的比較。 通過試驗發(fā)現(xiàn)復合礦物微量元素對于嗜酸乳桿菌的多種益生功能具有提升的效果， 且在小鼠雌雄性別中使用存在一定的差異性。 本試驗不單單使用一種微量元素作為培養(yǎng)基添加劑， 復合微量元素具有一次性補足多種微量元素的效果， 使得嗜酸乳桿菌的功能性提升幅度更大，涉及到能提升功能的范圍更廣。

4 結論

通過試驗結果可知， 添加礦物復合微量元素培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌，在抗氧化，降低膽固醇和甘油三酯，抗疲勞，提升飼料利用率等功能上較普通的嗜酸乳桿菌均有一定程度提升的效果。