Cx26在D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷中的表達(dá)

王 斌，賴碩林，宋豫皎，何欣然，王燁婷，趙釤妤

（1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

縫隙連接（gap junction，GJ）也叫間隙連接或通訊連接，是細(xì)胞間直接通訊的方式之一。GJ是一種特殊的膜結(jié)構(gòu)，由相鄰兩個(gè)細(xì)胞間的連接通道排列而成，其基本單位是連接子，每個(gè)連接子由6個(gè)縫隙連接蛋白（connexin，Cx）環(huán)繞排列成中空的半通道而成，即跨膜蛋白通道〔1〕。GJ 有細(xì)胞連接的機(jī)械作用，亦能促進(jìn)鄰近細(xì)胞間電信號(hào)及化學(xué)信號(hào)的傳遞，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、增殖分化、機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定等生理過程起著重要的調(diào)控作用〔2〕。GJ 細(xì)胞間信號(hào)交流對(duì)于肝臟的生物學(xué)性能具有重要作用，可參與血漿蛋白的合成等〔3〕。目前所發(fā)現(xiàn)的Cx 有20 多種，根據(jù)分子量的大小對(duì)其命名。在肝臟中主要表達(dá)有Cx26、Cx32、Cx37、Cx40、Cx43〔4-5〕，有研究表明，在急性肝損傷中，連接蛋白有不同的表達(dá)及變化格局〔6〕，而研究主要集中于脂多糖、四氯化碳等誘導(dǎo)的急性肝損傷中Cx26、Cx32 及Cx43 的表達(dá)。D-半乳糖胺亦可引起急性肝損傷，但機(jī)理與其他因素不同，D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷，并不直接損傷肝細(xì)胞，但可干擾肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷。D-半乳糖胺進(jìn)入體內(nèi)后與磷酸尿苷結(jié)合，形成磷酸尿苷-半乳糖胺復(fù)合物，致磷酸尿苷耗竭，使依賴其生物合成的核酸、糖蛋白、脂糖等的合成受到抑制，限制細(xì)胞器及酶的生成和補(bǔ)充，細(xì)胞器、生物膜受損、鈣離子內(nèi)流，從而造成肝細(xì)胞損傷〔7〕。在D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷中，Cx26 的表達(dá)如何，尚未見報(bào)道。因此，本研究建立D-半乳糖胺誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型，觀察其肝功能情況、肝組織病理改變、Cx26 的蛋白及mRNA 表達(dá)情況，旨在闡明Cx26在D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用。聯(lián)苯雙酯是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷的常用藥物，本研究采用聯(lián)苯雙酯作為陽性對(duì)照藥，以期闡明其治療肝損傷的機(jī)制與Cx26的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD 大鼠15 只，體質(zhì)量150～180 g，由昆明艾尼莫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 主要藥物、試劑及儀器D-半乳糖胺鹽酸鹽（MACKLIN 公司，批號(hào)：D810561）；聯(lián)苯雙酯（MACKLIN公司，批號(hào)：D843898）；Cx26（Bioss公司，批號(hào)：bs-1715R）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，Servicebio公司，批號(hào)：GB12002）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Servicebio 公司，批號(hào)：G2003）；動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒（離心柱型）（天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：DP431）；FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒（去基因組）（天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：KR116）；SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑（增強(qiáng)版）（SYBR Green）（天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：FP205）；β-actin 內(nèi)參基因（生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號(hào)：B661202）。DT5-3型低速臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；生化分析儀（型號(hào)：7180，日立公司）；Real-Time PCR 儀（Applied Biosystems 公司）；顯微鏡（型號(hào)：E100，NiKon公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型建立 將15 只大鼠隨機(jī)分為3 組，其中正常對(duì)照組（Con 組）、D-半乳糖胺組（D 組）、D-半乳糖胺-聯(lián)苯雙酯組（D-聯(lián)組）各5 只。 所有動(dòng)物按照實(shí)驗(yàn)室大鼠飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，室溫保持在（25±1）℃。飼養(yǎng)2 d適應(yīng)環(huán)境后，給藥。Con組：腹腔注射0.5 mL 無菌0.9%氯化鈉溶液；D 組：用0.9%氯化鈉溶液將D-半乳糖胺鹽酸鹽配成10%溶液，再用1 mol∕L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，按400 mg∕kg 體質(zhì)量一次性給予腹腔注射〔7〕；D-聯(lián)組：在注射D-半乳糖胺前1 h 腹腔注射聯(lián)苯雙酯20 mg∕kg〔7〕。給藥24 h后麻醉老鼠，取其靜脈血，處死老鼠，取其肝臟。

1.3.2 標(biāo)本處理方式 取出肝臟組織后迅速稱重，并計(jì)算肝體比指數(shù)（肝體比指數(shù)=肝濕重∕體質(zhì)量×100%）。選取2塊肝組織，其一放于4%多聚甲醛中固定48 h，用于石蠟切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylineosin，HE）染色；其二放于樣本保護(hù)液中，便于提取RNA 或蛋白，用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time qPCR）實(shí)驗(yàn)或蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB）。

1.3.3 血清指標(biāo)檢測(cè) 每只大鼠取血后，3 000 r∕min離心5 min，取上清液，采用速率法測(cè)定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的含量。

1.3.4 病理改變觀察 肝臟組織進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟與包埋、切片、脫蠟、染色、封固等處理后，在顯微鏡下觀察肝臟病變情況。

1.3.5 WB 檢測(cè)Cx26 蛋白的含量 肝臟組織加入裂解液研磨提取總蛋白，加入蛋白緩沖液沸水煮15 min 進(jìn)行蛋白變性，蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)（一抗1：500，5%脫脂奶粉；二抗1：3 000），化學(xué)發(fā)光。采用Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值（Cx26含量=Cx26條帶灰度值∕GAPDH內(nèi)參條帶灰度值）。

1.3.6 Real-time qPCR 法 檢 測(cè)Cx26 的mRNA 含 量各組組織按動(dòng)物組織總RNA 提取試劑盒操作步驟進(jìn)行RNA 的提取，測(cè)濃度，按FastKing cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA，嚴(yán)格按照SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。其中引物由生工生物合成，Cx26基因序列在NCBI上查找（正向引物：CTACACCACCAGCATCTTCTTCCG，反向引物：CCAGGCGTTACACTTCACCAGAC）。以β-actin 為內(nèi)參基因。采用2-△△Ct法對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝體比指數(shù)與D組相比，D-聯(lián)組肝體比指數(shù)稍增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 大鼠肝體比指數(shù)（xˉ± s，n=5）

2.2 大鼠血清中AST、ALT 含量與Con 組相比，D組及D-聯(lián)組血清中AST、ALT 含量均明顯增高（P＜0.05）；AST∕ALT值均明顯降低（P＜0.05）。而D組與D-聯(lián)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 大鼠血清中AST、ALT含量測(cè)定結(jié)果（xˉ± s，n=5）

2.3 各組間病理改變情況Con 組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞正常；D 組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，明顯的肝細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，肝血竇變窄；D-聯(lián)組情況同D組相似，但炎癥細(xì)胞浸潤更為明顯。見圖1。

2.4 Cx26 蛋白含量與Con 組（0.405 8 ± 0.162 5）相比，D 組（0.635 4±0.114 9）Cx26 蛋白含量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D-聯(lián)組（0.473 1±0.219 7）稍有增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與D 組相比，D-聯(lián)組Cx26 含量下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 Cx26蛋白的表達(dá)

2.5 Cx26 的mRNA 含量 與Con 組相比，D 組及D-聯(lián)組中Cx26 的mRNA 含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與D 組相比，D-聯(lián)組Cx26 的mRNA含量降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 Cx26的mRNA含量（xˉ± s，n=5）

3 討論

肝臟是體內(nèi)重要的臟器，也是各種疾病常侵襲的器官，代謝、中毒、微生物、循環(huán)障礙及腫瘤等均可造成肝臟的損傷。本研究結(jié)果表明，在D-半乳糖胺引起的肝損傷中，血清中AST、ALT 顯著升高，提示模型復(fù)制成功。ALT 分布于細(xì)胞漿，對(duì)肝臟疾病最為敏感；AST分布于肝細(xì)胞漿和線粒體中，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AST∕ALT 值比Con 組降低，提示由D-半乳糖胺誘導(dǎo)的急性肝損傷，損傷了肝細(xì)胞的細(xì)胞膜，但是對(duì)細(xì)胞器的損傷可能還不嚴(yán)重。

GJ 通道允許電、化學(xué)信號(hào)及代謝產(chǎn)物通過，GJ信號(hào)交流受細(xì)胞因子、生長因子、一氧化氮等的調(diào)控，使其對(duì)于細(xì)胞損傷比較敏感〔6〕。肝臟中主要表達(dá)5 種連接蛋白，其中肝細(xì)胞主要表達(dá)Cx26、Cx32，非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞主要表達(dá)Cx37、Cx40 和Cx43〔4-5〕。研究表明，Cx26、Cx32 及Cx43 與藥物、脂多糖及缺血再灌注損傷相關(guān)的肝急性損傷及炎癥密切相關(guān)〔6〕。以往對(duì)Cx 在急性肝損傷中的研究主要集中于脂多糖、四氯化碳，對(duì)乙酰氨基酚等造成的急性肝損傷則主要針對(duì)Cx32 和Cx43〔6〕，對(duì)Cx26 的研究較少。在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中，抑制Cx26 和Cx32 可減少由對(duì)乙酰氨基酚引起的細(xì)胞死亡〔9〕；封閉Cx26 和Cx43，阻礙Cx43的過表達(dá)可能是減少急性毒性引起的肝損傷的潛在治療靶點(diǎn)〔6〕。脂多糖引起的SD 大鼠肝損傷中，Cx26 和Cx32 減少，Cx43 增加，這跟炎癥反應(yīng)密切相關(guān)〔10-11〕。有研究〔12〕認(rèn)為，這些Cxs 在基因水平上表達(dá)的下調(diào)是通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制形成的。本研究結(jié)果表明，D-半乳糖胺可引起SD 大鼠肝細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，Cx26 的蛋白含量明顯增加，而mRNA 含量卻明顯降低。Cx26 蛋白表達(dá)增加可能跟炎癥反應(yīng)相關(guān)，或許是適應(yīng)D-半乳糖胺的刺激，為致細(xì)胞損傷的因子進(jìn)行細(xì)胞間的交流提供方便。由此可推測(cè)，抑制Cx26 的表達(dá)，也許是治療由于D-半乳糖胺引起的急性肝損傷的潛在靶點(diǎn)。Cx26 的蛋白及mRNA 含量不一致，可能是mRNA 半衰期短或者是存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的問題，有待進(jìn)一步研究。

本研究中采用聯(lián)苯雙酯作為陽性對(duì)照藥，結(jié)果顯示聯(lián)用聯(lián)苯雙酯組大鼠血清AST 及ALT 并未降低，肝細(xì)胞壞死依然明顯，這可能源于給藥時(shí)間短及次數(shù)少。但聯(lián)苯雙酯在一定程度上逆轉(zhuǎn)了Cx26的表達(dá)，可推測(cè)聯(lián)苯雙酯治療肝損傷的機(jī)制可能跟細(xì)胞間直接的信號(hào)交流有關(guān)。

通過對(duì)Cx26 在D-半乳糖胺引起的大鼠急性肝損傷中的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)升高，提示若抑制Cx26 的表達(dá)，或許可減少與D-半乳糖胺致病機(jī)理類似的藥物性損傷的細(xì)胞間的信號(hào)交流，為新藥研究提供一定的實(shí)驗(yàn)支持，為藥物治療機(jī)制的闡明提供一定的佐證。Cx26 受何調(diào)控，為何其在基因、蛋白水平表達(dá)不一致等問題，有待進(jìn)一步研究。