2020年寧波市主養(yǎng)海水魚流行病學(xué)調(diào)查與藥敏試驗(yàn)

徐勝威, 葛明峰, 許昊川, 王雯瓊, 沈偉良

2020年寧波市主養(yǎng)海水魚流行病學(xué)調(diào)查與藥敏試驗(yàn)

徐勝威, 葛明峰*, 許昊川, 王雯瓊, 沈偉良

（寧波市海洋與漁業(yè)研究院, 浙江 寧波 315042）

為了解寧波地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種病害發(fā)生情況, 本研究于2020年通過(guò)定期抽檢與應(yīng)急檢測(cè)相結(jié)合方式, 開展了地區(qū)性的主要海水魚流行病學(xué)調(diào)查工作. 從大黃魚、小黃魚、七星鱸魚、銀鯧等海水魚上共分離到細(xì)菌19株, 主要菌株為哈維氏弧菌和美人魚發(fā)光桿菌; 檢測(cè)出病毒陽(yáng)性26批次, 主要為傳染性脾腎壞死病毒和真鯛虹彩病毒; 鏡檢觀察到寄生蟲2例, 分別為東方魚虱和梅氏新本尼登蟲. 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示: 從魚體分離得到的致病菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹敏感2種藥物的最小抑菌濃度(MIC)普遍＜0.1mg·L-1, 因此其可作為優(yōu)選藥物進(jìn)行細(xì)菌病的治療. 另外發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)間段, 大黃魚上分離到的同種細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性并不一致. 藥敏試驗(yàn)結(jié)果將有助于養(yǎng)殖戶做到科學(xué)、精準(zhǔn)用藥, 同時(shí)也能為本地水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌的耐藥性普查工作提供理論基礎(chǔ).

海水魚; 病害; 流行病學(xué); 藥敏試驗(yàn)

每年水生動(dòng)物病害的頻繁發(fā)生, 給寧波市漁業(yè)帶來(lái)了約占養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)7%~8%的重大經(jīng)濟(jì)損失[1], 還帶來(lái)了水產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患, 嚴(yán)重制約了漁業(yè)的快速發(fā)展. 近年來(lái), 不少水產(chǎn)領(lǐng)域?qū)W者對(duì)本地區(qū)水生動(dòng)物主要病害進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查與研究, 以期了解相關(guān)病害對(duì)魚蝦貝藻等養(yǎng)殖品種的危害程度、流行特點(diǎn)和發(fā)病規(guī)律, 從而制定防控措施, 保障漁業(yè)積極向上發(fā)展[2-4].

盡管如此, 但相關(guān)研究并不全面, 水生動(dòng)物病害已成為制約我市水產(chǎn)養(yǎng)殖健康、持續(xù)、快速發(fā)展的主要原因之一. 鑒于此, 本文開展了2020年寧波市主養(yǎng)海水魚流行病學(xué)調(diào)查, 以期做好相關(guān)病害防治工作, 提高水產(chǎn)養(yǎng)殖效益. 同時(shí), 對(duì)分離到的主要致病菌開展藥物敏感性試驗(yàn), 為養(yǎng)殖戶病害早期診斷和藥物合理施用提供一定的科學(xué)依據(jù), 減少病害帶來(lái)的損失. 同時(shí), 藥敏試驗(yàn)結(jié)果也能為本地水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌的耐藥性普查工作提供理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 調(diào)查動(dòng)物與取樣方法

本次調(diào)查動(dòng)物以大黃魚()為主, 同時(shí)也涵蓋小黃魚()、七星鱸魚()、銀鯧()、赤點(diǎn)石斑魚()等品種. 調(diào)查工作包括定期抽檢與應(yīng)急檢測(cè). 4~10月每月從象山、奉化、寧海監(jiān)測(cè)點(diǎn)采樣1次. 挑選臨床癥狀明顯的活體或?yàn)l臨死亡的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物, 現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行細(xì)菌劃線分離和寄生蟲鏡檢, 同時(shí)取疑似病灶組織置于95%乙醇中固定, 送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒檢測(cè). 對(duì)于突發(fā)病害的養(yǎng)殖動(dòng)物, 按上述步驟進(jìn)行取樣檢測(cè).

1.2 試劑耗材

DNA的提取采用OMEGA E.Z.N.A.?Tissue DNA Kit, PCR試劑選用康為世紀(jì)2×Taq Master Mix(含染料), 相關(guān)引物由北京六合華大基金科技股份有限公司合成. 動(dòng)物用藥敏檢測(cè)分析試劑盒、試劑板由南京菲恩醫(yī)療科技公司提供.

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 細(xì)菌分離與鑒定

無(wú)菌條件下, 取魚肝、脾、腎、腦等組織劃線接種于腦心浸出液瓊脂(BHI)平板上, 28℃培養(yǎng)24~72h, 挑取單菌落于28℃條件下純化培養(yǎng). 細(xì)菌DNA提取參照OMEGA試劑盒說(shuō)明, 根據(jù)16S rDNA序列合成引物, 建立PCR擴(kuò)增體系[5]. PCR產(chǎn)物測(cè)序交由北京六合華大基金科技股份有限公司完成, 測(cè)序結(jié)果經(jīng)Genbank Blast比對(duì)進(jìn)行細(xì)菌鑒定. 同時(shí), 挑選純化好的單菌落用于后續(xù)的藥敏試驗(yàn).

1.3.2 藥敏試驗(yàn)

參照南京菲恩醫(yī)療科技公司的藥敏分析試劑板說(shuō)明書. 將純化后的單菌落先于生理鹽水中制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙? 之后稀釋成5×105cfu?mL-1, 以每孔200μL分別加到8種不同濃度梯度(0.1~200mg?mL-1)藥物內(nèi). 接著, 將藥敏分析試劑板置于28℃環(huán)境, 培養(yǎng)24~48h后讀取結(jié)果.

1.3.3 病毒檢測(cè)

魚類傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)檢測(cè)分別參照SC/T 7211-2011、GB/T 36191-2018提供的檢測(cè)方法進(jìn)行病毒檢測(cè).

1.3.4 寄生蟲檢測(cè)

利用水浸片法鏡檢. 取魚鰓絲、體表附著物或粘液置于載玻片上, 滴加無(wú)菌生理鹽水, 用鑷子將組織分散, 蓋上蓋玻片, 稍加壓平, 置于顯微鏡下觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 病原檢出統(tǒng)計(jì)

2020年4~10月采集的水生動(dòng)物中共分離到細(xì)菌19株. 其中, 大黃魚體內(nèi)分離出12株細(xì)菌, 占總菌株數(shù)的63.2%. 銀鯧、鯔魚、小黃魚上各分離出2株, 七星鱸魚分離出1株. 共檢測(cè)病毒34批次, 檢出病毒陽(yáng)性共計(jì)26批次, 其中檢出ISKNV 17批次、RSIV 9批次, 同時(shí)檢出ISKNV和RSIV 7批次, 這兩類病毒主要感染大黃魚、七星鱸魚、赤點(diǎn)石斑魚和銀鯧. 另外, 從大黃魚和鯔魚體表上分別檢出1例梅氏新本尼登蟲()和1例東方魚虱(,Gussev). 病原具體檢出情況見(jiàn)表1.

表1 水生動(dòng)物各類病原檢出情況統(tǒng)計(jì)

2.2 細(xì)菌分離統(tǒng)計(jì)

表2 采樣月份和菌株數(shù)統(tǒng)計(jì) 株

注: “-”為未分離到病菌.

表3 各致病菌對(duì)抗菌藥物的敏感性 mg?L-1

2.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

對(duì)上述分離到的細(xì)菌經(jīng)種屬鑒定后, 進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn), 檢驗(yàn)原理為微量肉湯稀釋法. 根據(jù)南京菲恩醫(yī)療科技公司提供的藥敏分析試劑板,得出的MIC值可為后期科學(xué)用藥提供有力依據(jù). 藥敏具體結(jié)果見(jiàn)表3.

表4 大黃魚不同時(shí)間段分離的哈維氏弧菌對(duì)藥物的敏感性 mg?L-1

2.4 病毒檢出統(tǒng)計(jì)

ISKNV和RSIV是目前已發(fā)現(xiàn)存在于大黃魚內(nèi), 且攜帶率較高, 對(duì)其機(jī)體影響較大的2種病毒. 此次在海水魚上共檢出26批次病毒陽(yáng)性, 其中ISKNV檢出17批次, RSIV檢出9批次(表5). 前者主要感染大黃魚、七星鱸魚、銀鯧、赤點(diǎn)石斑魚等海水魚, 尤以大黃魚和七星鱸魚上檢出批次較多, 分別為6批次和5批次; 后者從大黃魚上檢出批次最多, 同時(shí)也可感染赤點(diǎn)石斑魚和銀鯧.

采集的患病魚癥狀為脾腎腫大, 部分魚鰓絲發(fā)白, 肝腫大, 發(fā)黃甚至發(fā)白. 傳染性脾腎壞死病毒和真鯛虹彩病毒雖然本身對(duì)海水魚致死性不高, 但會(huì)破壞魚體免疫系統(tǒng), 往往引起魚免疫力下降,從而繼發(fā)細(xì)菌性疾病. 如8月5日, 象山黃避岙養(yǎng)殖銀鯧發(fā)病, 臨床癥狀為魚頭部、鰭條基部出血, 解剖發(fā)現(xiàn)其脾腎腫大, 經(jīng)PCR技術(shù)檢測(cè)到病魚同時(shí)感染ISKNV和RSIV. 同時(shí), 從該魚肝、腎組織中分離出大量的美人魚發(fā)光桿菌. 這可能是由于病毒感染導(dǎo)致魚體免疫力下降, 從而作為海水中常見(jiàn)的條件致病菌, 美人魚發(fā)光桿菌感染魚體, 從而發(fā)生病害.

表5 海水魚病毒檢出統(tǒng)計(jì)

本次調(diào)查在4~8月都有檢出上述病毒, 應(yīng)引起養(yǎng)殖戶高度重視. 養(yǎng)殖戶在前期應(yīng)選擇健康無(wú)病毒的魚苗進(jìn)行放養(yǎng), 并控制一定的放養(yǎng)密度, 同時(shí)定期在飼料中添加多種微生物、抗病毒中草藥和低聚糖等免疫增強(qiáng)劑來(lái)提高魚體抗病能力, 防止病害的發(fā)生和流行.

2.5 寄生蟲觀測(cè)統(tǒng)計(jì)

5月11日在寧海大佳何鎮(zhèn)養(yǎng)殖鯔魚中檢出東方魚虱1例. 患病鯔魚鱗片脫落嚴(yán)重, 鰭條、鰓絲明顯斷裂, 并伴有體表出血; 在鱗片、鰓蓋邊緣、鰭條等處觀察到大量東方魚虱.隨著蟲體不斷繁殖, 體表創(chuàng)傷愈加嚴(yán)重, 水體條件使致病菌亦乘虛侵染魚體, 并局部繁殖引起魚體炎癥反應(yīng). 而后, 致病菌隨血液循環(huán)感染肝、脾、腎等組織, 最終導(dǎo)致魚體從體表潰爛到全身組織受損. 通過(guò)平板劃線分離, 在患病鯔魚組織中分離到2株哈維氏弧菌, 表明魚體因東方魚虱寄生引起的細(xì)菌繼發(fā)感染.

9月14日于象山石浦網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚上觀察到梅氏新本尼登蟲. 患病大黃魚頭部磨損呈蜂窩狀裸露, 眼球突出變白, 似白內(nèi)障癥狀, 體表分泌大量粘液并伴有炎癥. 本尼登蟲的大量寄生引起魚體瘙癢, 病魚焦躁不安, 不斷狂游與網(wǎng)箱等硬物摩擦致使體表擦傷出血, 引起繼發(fā)性感染, 導(dǎo)致體表肌肉潰瘍. 該病的流行主要在秋季, 最適蟲群增長(zhǎng)水溫為25~26℃, 而當(dāng)時(shí)采樣環(huán)境條件恰是本尼登蟲感染的高發(fā)期.

寄生蟲病在不同養(yǎng)殖區(qū)域也有病害發(fā)生的報(bào)道[10-11], 如刺激隱核蟲、微孢子蟲等寄生蟲對(duì)大黃魚及其他海水魚的危害愈加嚴(yán)重, 會(huì)引起魚體繼發(fā)細(xì)菌感染和缺氧. 但從2020年調(diào)查分析可知, 寧波周邊養(yǎng)殖場(chǎng)大黃魚刺激隱核蟲病的防控措施做得較好, 發(fā)生病害的范圍也較少.

2.6 其他病害

由于養(yǎng)殖環(huán)境日趨復(fù)雜化, 許多原因不明的疾病和綜合癥也不斷突顯. 7月21日, 象山一網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚發(fā)現(xiàn)了白鰓病, 病魚體表完好無(wú)損, 未見(jiàn)鱗片脫落或充血潰爛等癥狀, 鰓絲完整, 但失血呈蒼白色, 脾臟大多數(shù)充血或腫大變黑, 腸道多數(shù)有炎癥. 但白鰓病究竟是病毒引起, 還是粘孢子蟲感染所致, 亦或?yàn)榧?xì)菌性疾病, 有待進(jìn)一步深入研究[12-13]. 從發(fā)病季節(jié)來(lái)看, 作為大黃魚“三白之一”的白鰓病主要流行于高溫季節(jié), 低溫環(huán)境不易爆發(fā), 但不代表不存在該病原, 也不能說(shuō)明低溫環(huán)境不存在傳播的可能性.

3 總結(jié)與討論

大黃魚是寧波地區(qū)的主要養(yǎng)殖品種, 于20世紀(jì)80年代開始養(yǎng)殖[14]. 開展以大黃魚為主的海水魚流行病學(xué)調(diào)查對(duì)探索養(yǎng)殖動(dòng)物主要病害的流行規(guī)律, 提前預(yù)警和防控具有重要的意義. 本研究顯示, 哈維氏弧菌是引起海水魚發(fā)病的主要致病菌. 其致病途徑一方面是由于魚體感染傳染性脾腎壞死病毒、真鯛虹彩病毒或寄生蟲后, 魚體免疫力降低或體表受創(chuàng), 導(dǎo)致條件致病菌繼發(fā)性感染; 另一方面由于水質(zhì)環(huán)境惡化, 有害細(xì)菌繁衍迅速, 加上氣候多變, 使得養(yǎng)殖品種更易感染病菌, 特別是在高溫、臺(tái)風(fēng)、梅雨等惡劣天氣狀況下.

雖然通過(guò)藥敏試驗(yàn), 可以在細(xì)菌性疾病發(fā)生時(shí)采用對(duì)癥藥物進(jìn)行治療, 但有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果服用漁藥效果不好的情況. 究其原因, 一方面, 市面上漁藥魚龍混雜, 很多養(yǎng)殖戶對(duì)漁藥缺乏科學(xué)的認(rèn)知和辨別. 一旦購(gòu)買了假藥、劣藥進(jìn)行投喂, 不但魚病得不到及時(shí)治療, 還會(huì)加重魚體代謝負(fù)荷, 使病情進(jìn)一步惡化. 另一方面, 某些養(yǎng)殖戶投藥方法不當(dāng), 導(dǎo)致療效不明顯. 對(duì)于濃度依賴性及時(shí)間依賴性漁藥, 藥物濃度必須達(dá)到一定峰值及持續(xù)一定時(shí)間, 才足以殺滅致病菌[16]. 而如果養(yǎng)殖戶每天低劑量拌料, 即使達(dá)到一定濃度但持續(xù)天數(shù)不足, 都會(huì)影響藥性的發(fā)揮.

在寧波市主要養(yǎng)殖品種流行病學(xué)調(diào)查工作的基礎(chǔ)上, 對(duì)常見(jiàn)病原菌進(jìn)行耐藥性分析, 初步了解重要病原菌的耐藥性及其變化規(guī)律, 為規(guī)范使用漁用抗菌藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 促進(jìn)水產(chǎn)品質(zhì)量安全水平的逐步提高. 通過(guò)藥敏試驗(yàn)等技術(shù)手段達(dá)到精準(zhǔn)用藥, 減少用藥, 促進(jìn)漁業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)和高質(zhì)量綠色發(fā)展.

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Epidemiology and drug sensitivity test of main aquaculture marine fish in Ningbo city in 2020

XU Shengwei, GE Mingfeng*, XU Haochuan, WANG Wenqiong, SHEN Weiliang

( Ningbo Ocean and Fisheries Research Institute, Ningbo 315042, China )

In order to understand the disease occurrence of aquaculture species in Ningbo city, this study carried out an epidemiological study about local main marine fish via regular sampling and emergency testing in 2020. A total of nineteen strains of bacteria were separated from,,,and other marine fish. The main strains wereand. A total of twenty-six batches of viruses were tested positive. The vast majority of virus was infectious spleen and kidney necrosis virus and Red sea bream iridovirus. Two cases of parasites were observed by microscope. They wereGussev andrespectively. The results of drug susceptibility test showed that the majority of the pathogenic bacteria isolated from fish were sensitive to doxycycline hydrochloride and flumequine. The minimum inhibitory concentration of these two drugs was generally lower than 0.1mg?L-1, so they are suggested to be used as preferred drugs for the treatment of bacterial diseases. In addition, it showed that the susceptibility to drugs of the same bacteria isolated fromin different time was inconsistent. The results of drug susceptibility test will help fishermen to apply drug scientifically and accurately. At the same time, the results can provide theoretical basis for the general survey of drug susceptibility of pathogens in local aquaculture animals.

marine fish; disease; epidemiology; drug susceptibility test

S917.1

A

1001-5132（2021）02-0109-06

2020?10?29.

寧波大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版）網(wǎng)址: http://journallg.nbu.edu.cn/

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)基金（CARS-47-Z08）.

徐勝威（1983－）, 男, 浙江蘭溪人, 碩士/工程師, 主要研究方向: 水生動(dòng)物病害防控. E-mail: 546207546@qq.com

葛明峰（1988－）, 男, 浙江寧波人, 碩士, 主要研究方向: 水生動(dòng)植物病害防治. E-mail: 910342950@qq.com

（責(zé)任編輯 章踐立）