改良Hale膠體鐵組合染色用于杯狀細(xì)胞染色效果

丁桂齡，鄭建明，劉艷芳，蔣 慧

腸道是人體內(nèi)極為重要的器官，不僅具有消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)生多種激素的作用，還具有重要的免疫屏障功能。腸道黏膜表面覆蓋著一層保護(hù)性黏液凝膠，該凝膠及其周邊的多種細(xì)胞通過病理生理機(jī)制共同參與維持腸道穩(wěn)態(tài)。杯狀細(xì)胞是腸道黏膜免疫屏障功能中產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要細(xì)胞，其分化和分泌功能的改變可導(dǎo)致黏液凝膠成分的改變，在腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色。作者經(jīng)過實踐，采用改良Hale膠體鐵組合染色法，可較好地顯示腸道組織中的杯狀細(xì)胞，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院病理科存檔的十二指腸和結(jié)腸手術(shù)切除標(biāo)本合計10例，所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定后取材，行常規(guī)流程制成3 μm厚石蠟切片，75 ℃烤臺烤片20 min。

1.2 試劑及配制(1)膠體鐵原液：30%氯化鐵5 mL，蒸餾水250 mL。先將盛有250 mL蒸餾水的加蓋燒杯置于電磁爐上加熱使液體沸騰，然后向燒杯內(nèi)滴加30%氯化鐵5 mL，待溶液變成磚紅色后停止加熱，最后將燒杯轉(zhuǎn)移至磁力攪拌器上，直至溶液變成混勻且均一的磚紅色，待液體冷卻后，將其存放于棕色試劑瓶中于室溫下保存。(2)膠體鐵染液：膠體鐵原液20 mL，乙酸5 mL，蒸餾水15 mL。為顯示實驗效果，本實驗采取染液臨用前新配制，其pH值調(diào)整為1.4。(3)乙酸液：乙酸3 mL，蒸餾水100 mL。(4)亞鐵氰化鉀鹽酸液：5%亞鐵氰化鉀水溶液15 mL，5%鹽酸15 mL，臨用前新配制。(5)麗春紅苦味酸染色液：0.5%麗春紅S水溶液10 mL，苦味酸飽和水溶液90 mL。

1.3 方法組織切片經(jīng)脫蠟至水，入乙酸液浸洗2 min。先直接浸入盛有膠體鐵染液的立式染色缸中40 min，再浸入乙酸液浸洗3 min，而后浸入盛有亞鐵氰化鉀鹽酸液的立式染色缸中10 min。自來水洗2 min，0.5%麗春紅苦味酸S水溶液滴染3 min，無水乙醇脫水，冷風(fēng)干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結(jié)果

染色后腸道黏膜中分布數(shù)量不等的杯狀細(xì)胞，呈藍(lán)色或深藍(lán)色；頂部胞質(zhì)內(nèi)的黏蛋白呈淡藍(lán)色或深藍(lán)色；膠原纖維呈粉紅色；染色鮮明，鏡下易辨認(rèn)，背景色理想(圖1～3)。

圖1 乙狀結(jié)腸杯狀細(xì)胞(紅箭頭)呈藍(lán)色或深藍(lán)色，膠原纖維(黑箭頭)呈紅褐色，改良Hale膠體鐵組合染色 圖2 乙狀結(jié)腸杯狀細(xì)胞(紅箭頭)呈藍(lán)色或深藍(lán)色，改良Hale膠體鐵組合染色 圖3 十二指腸杯狀細(xì)胞(紅箭頭)呈藍(lán)色或深藍(lán)色，頂部胞質(zhì)內(nèi)的黏蛋白呈淡藍(lán)色(黃箭頭)，吸收細(xì)胞(紫箭頭)呈亮白色，改良Hale膠體鐵組合染色

3 討論

杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白可與水、無機(jī)鹽等結(jié)合形成附著在腸黏膜表面的黏液層，黏液層與腸上皮細(xì)胞、腸道微生態(tài)和宿主的免疫系統(tǒng)相互作用，共同維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1]，并參與多種腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展。臨床病理工作中多數(shù)工作者首選杯狀細(xì)胞的染色方法多為PAS染色或阿爾辛藍(lán)染色。對于PAS染色，作者實際操作中發(fā)現(xiàn)該染色法著染的成分較多，不僅對于基膜、真菌、糖原、十二指腸腺等均能著色，還會在操作欠妥下造成組織整體一片紅染，該染色法的特異性和對比度有待再實踐。對于阿爾辛藍(lán)染色，雖實際操作簡單且也可顯示杯狀細(xì)胞，但作者及部分同行在實際操作中發(fā)現(xiàn)，其對杯狀細(xì)胞的著色較淡，這不排除不同單位采購試劑質(zhì)量和濃度的差異。改良Hale膠體鐵組合染色能較好地顯示杯狀細(xì)胞，這可能與杯狀細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)及其分泌物的成分有關(guān)。杯狀細(xì)胞是一種典型的黏液細(xì)胞，其主要成分黏蛋白在酸性條件下能吸附膠體鐵染液中的Fe3+而形成穩(wěn)定的聚合物，再與亞鐵氰化鉀鹽酸結(jié)合而牢固著色[2]。改良法有以下特色：(1)膠體鐵原液配置的過程，更改了不僅費時費力、還有液體飛濺可能的手動搖晃方式，借助磁力攪拌器，即節(jié)省了人力、又保證了實驗安全、還能較好地混勻液體。(2)將原始方法中3%亞鐵氰化鉀和3%鹽酸的濃度均提高到5%，可以更快地激活杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白物質(zhì)，促進(jìn)染色反應(yīng)的進(jìn)行，染色后的杯狀細(xì)胞清晰可見。這可能是因為杯狀細(xì)胞的分泌物黏蛋白包含的酸性黏多糖物質(zhì)作為反應(yīng)基礎(chǔ)，在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下能吸附膠體鐵染液中的Fe3+而形成穩(wěn)定的、有較高電子密度的聚合物[3]，再與5%亞鐵氰化鉀鹽酸作用，杯狀細(xì)胞內(nèi)的酸性黏多糖物質(zhì)被牢固結(jié)合，從而能對杯狀細(xì)胞較好地著色。(3)組合染色選用0.5%麗春紅苦味酸S水溶液，既可以區(qū)分膠原纖維和肌纖維、增強(qiáng)整體染色的色澤度，又可以較好地觀察杯狀細(xì)胞與其毗鄰組織的形態(tài)關(guān)系，還可以輔助臨床病理中有關(guān)腸壁纖維化等疾病的診斷。染色過程中：切片需處于酸性條件下，乙酸液浸洗必須充分；為保證有足夠的染色液反應(yīng)和切片著色均勻，膠體鐵染液和亞鐵氰化鉀鹽酸液必須現(xiàn)用現(xiàn)配，該步驟的染色反應(yīng)建議在干凈的立式染色缸中進(jìn)行。

綜上所述，改良Hale膠體鐵組合染色法對于杯狀細(xì)胞的顯示，特異性強(qiáng)，敏感性高，定位準(zhǔn)確，結(jié)果易于判讀。