外周血Th1、Th17細(xì)胞比值與布氏桿菌性脊柱炎術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性

賈永利，楊新明，張培楠，孟憲勇，胡長(zhǎng)波

布氏桿菌性脊柱炎是由布氏桿菌侵襲脊柱引發(fā)椎體或椎間盤炎性反應(yīng)改變的一種感染性疾病[1]。臨床病理特征為肉芽腫性炎[2]。其最先累及軟骨組織，繼而累及椎間盤，引起骨質(zhì)破壞和椎間盤形態(tài)改變，最終導(dǎo)致椎間盤發(fā)生功能及形態(tài)的改變[3]。布氏桿菌性脊柱炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體免疫功能可能與脊柱炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；CD4+T細(xì)胞包括Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞等，是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要部分[4]。Th17細(xì)胞是產(chǎn)生白介素-17(IL-17)等細(xì)胞因子的輔助性T細(xì)胞，IL-17可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生并導(dǎo)致組織器官發(fā)生炎性損傷和組織損傷[5]。目前，Th1、Th17細(xì)胞在布氏桿菌性脊柱炎中的作用尚不清楚。現(xiàn)分析布氏桿菌性脊柱炎患者外周血中Th1、Th17細(xì)胞比值水平，并從免疫學(xué)角度為布氏桿菌性脊柱炎發(fā)病機(jī)制及臨床診斷提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月—2020年3月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科收治布氏桿菌性脊柱炎患者68例作為研究對(duì)象(脊柱炎組)，男44例，女24例，年齡42～70(56.94±7.78)歲；病程3～26(6.18±1.14)個(gè)月；感染原因：因飼養(yǎng)、放牧而受污染30例，接觸病畜的尿糞及其污染物15例，飲用未經(jīng)消毒乳制品或吃生羊肉11例，處理病畜生產(chǎn)而受污染8例，屠宰病畜或分離內(nèi)臟而受污染4例；發(fā)病部位：1個(gè)椎體受累8例，2個(gè)椎體受累37例，3個(gè)椎體受累23例；病灶部位腰椎多于胸椎。選取同期醫(yī)院體檢健康者70例為健康對(duì)照組，男44例，女26例，年齡42～70(57.64±8.28)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①以腰腿痛為主要癥狀就診；②磁共振成像檢查發(fā)現(xiàn)脊柱存在感染性病變；③經(jīng)血清學(xué)或病理活檢，確診感染菌為布氏桿菌；④病例資料齊全，術(shù)后同意接受隨訪。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①近6個(gè)月使用糖皮質(zhì)激素等激素類藥物；②合并其他類型自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等)；③妊娠期或哺乳期女性；④合并慢性炎性反應(yīng)疾??；⑤合并嚴(yán)重肝、腎功能異常。(3)布氏桿菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：①有明確的流行病學(xué)接觸史(如家畜、野生動(dòng)物)；②實(shí)驗(yàn)室虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性；③細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)結(jié)果為陽性。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 Th1和Th17細(xì)胞百分比率檢測(cè)：患者于術(shù)前及術(shù)后3 d、體檢者當(dāng)日清晨空腹采集肘靜脈血5～6 ml，平均分成2份，一份置于普通采血管中，4℃離心留取上清，凍存于-80℃冰箱中，待測(cè)；另一份置于含乙二胺四酸二鉀采血管中，-80℃冰箱保存。上述直接凍存的靜脈血解凍，離心分離出上層血漿，向試管中加入等體積的PBS稀釋液，再加入淋巴細(xì)胞分離液，繼續(xù)梯度離心，獲取外周血單核細(xì)胞。加入藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD8單抗20 μl和PE-Cy5標(biāo)記的CD3單抗10 μl，4℃避光孵育20 min，加入溶血素1 ml，室溫靜置15 min，離心棄上清后，PBS清洗1次。加入破膜劑500 μl，離心棄上清后進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色;然后加入IFN-γ(FITC標(biāo)記)抗體和IL-17A(FITC標(biāo)記)進(jìn)行胞漿染色，4℃避光溫育20 min，PBS清洗1次，重懸細(xì)胞，置于Accurl C6型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)中檢測(cè)分析Th1、Th17細(xì)胞比例，CD3+CD8-IFN-γ+即為Th1細(xì)胞，CD3+CD8-IL-17+即為Th17細(xì)胞。

1.3.2 血清炎性因子檢測(cè)：取上述凍存血清解凍。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定血清白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-17、IL-23、IL-6；IL-2、IL-6 ELISA試劑盒購自(上海晶抗生物工程有限公司)，IFN-γ ELISA試劑盒購自(上海廣銳生物科技有限公司)，IL-17 ELISA試劑盒購自(北京百奧萊博科技有限公司)，IL-23 ELISA試劑盒購自(南京賽泓瑞生物科技有限公司)。均嚴(yán)格參照操作說明書進(jìn)行。

1.3.3 隨訪：術(shù)后對(duì)布氏桿菌性脊柱炎患者隨訪3個(gè)月，根據(jù)患者恢復(fù)情況分為未復(fù)發(fā)亞組60例和復(fù)發(fā)亞組8例。

2 結(jié) 果

2.1 2組術(shù)前外周血單核細(xì)胞Th1、Th17細(xì)胞百分率比較 與健康對(duì)照組比較，脊柱炎組患者外周血單核細(xì)胞Th17細(xì)胞比例升高，Th1細(xì)胞比例降低(P均<0.01)，見表1。

表1 2組術(shù)前外周血單核細(xì)胞Th1、Th17細(xì)胞比較

2.2 2組術(shù)前血清炎性因子比較 與健康對(duì)照組比較，脊柱炎組患者血清IL-17、IL-6、IL-23水平升高，IL-2、IFN-γ水平降低(P均<0.01)，見表2。

表2 2組術(shù)前血清炎性因子水平比較

2.3 脊柱炎患者2亞組外周血單核細(xì)胞Th1、Th17細(xì)胞百分率比較 與未復(fù)發(fā)亞組比較，復(fù)發(fā)亞組患者術(shù)后外周血單核細(xì)胞Th17細(xì)胞比例升高，Th1細(xì)胞比例降低(P均<0.01)，見表3。

表3 術(shù)后2亞組外周血單核細(xì)胞Th1、Th17細(xì)胞比較

2.4 脊柱炎患者2亞組血清炎性因子水平比較 與未復(fù)發(fā)亞組比較，復(fù)發(fā)亞組患者術(shù)后血清IL-17、IL-6、IL-23水平升高，IL-2、IFN-γ水平降低(P均<0.01)，見表4。

表4 術(shù)后2亞組血清炎性因子水平比較

2.5 影響布氏桿菌性脊柱炎術(shù)后復(fù)發(fā)因素分析 以布氏桿菌性脊柱炎術(shù)后是否復(fù)發(fā)為因變量，術(shù)后Th1細(xì)胞百分比、Th17細(xì)胞百分比、IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ為自變量，多因素Logistic回歸分析顯示，術(shù)后Th1、Th17細(xì)胞百分比及IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ均是布氏桿菌性脊柱炎術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析影響布氏桿菌性脊柱炎術(shù)后復(fù)發(fā)因素

3 討 論

布氏桿菌病是人畜共患的地區(qū)性流行病，屬于乙類傳染病。人類患病的主要原因是與攜帶或感染布氏桿菌的牛、豬、羊等牲畜有接觸，主要通過呼吸道、皮膚及消化道途徑進(jìn)入人體，寄生在人血液中，會(huì)引發(fā)人體發(fā)熱及多器官損傷，如骨骼肌、肝臟、脾臟等，但對(duì)脊柱的損傷最為常見[7-8]。正常人脊柱布氏桿菌感染的幾率為2%～77%，多發(fā)生在50歲左右的人群中，尤其以男性患病居多，且與患者職業(yè)相關(guān)性較大[9]。本病以腰背疼痛為常見臨床癥狀，其可能原因是脊柱周圍軟組織及椎間盤的炎性反應(yīng)導(dǎo)致脊神經(jīng)受壓[10]。

檢測(cè)外周血中Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞數(shù)量，有助于判斷布氏桿菌性脊柱炎病情及預(yù)后評(píng)估。CD4+T細(xì)胞在機(jī)體免疫中扮演重要角色。Th1細(xì)胞可分泌促炎細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2等參與機(jī)體細(xì)胞免疫過程。研究顯示，若Th1細(xì)胞異?；钴S，可能會(huì)引起機(jī)體組織或器官損傷，或?qū)е伦陨硇悦庖呒膊“l(fā)生[11]。IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子可清除外來細(xì)菌和病毒，在局部炎性反應(yīng)中發(fā)揮著促炎作用。IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎性反應(yīng)，從而參與關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程[12]。王翠玲等[13]研究顯示，發(fā)作期的強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血中Th1細(xì)胞百分比率比穩(wěn)定期低，血清中IFN-γ、IL-2水平顯著降低，可能因炎性反應(yīng)作用向關(guān)節(jié)內(nèi)遷移導(dǎo)致Th1細(xì)胞向關(guān)節(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致外周血中Th1細(xì)胞百分比率降低。另有研究顯示，宿主(如小鼠)體內(nèi)Th2細(xì)胞水平增高，從而抑制Th1細(xì)胞的免疫反應(yīng)，使Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞失衡，也會(huì)導(dǎo)致布氏桿菌病發(fā)生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，脊柱炎組患者術(shù)前外周血Th1細(xì)胞比例、血清IL-2、IFN-γ水平顯著低于健康對(duì)照組，與龐盼等[15]研究結(jié)果相一致，提示Th1細(xì)胞比例可能與布氏桿菌性脊柱炎的發(fā)生有關(guān)，猜測(cè)外周血中Th1細(xì)胞比例下降可能是由于Th1細(xì)胞集中于脊關(guān)節(jié)部位，加重病情。術(shù)后復(fù)發(fā)亞組患者外周血Th1細(xì)胞比例及血清IL-2、IFN-γ水平顯著低于未復(fù)發(fā)亞組，提示Th1細(xì)胞比例變化可能與布氏桿菌性脊柱炎患者術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

Th17細(xì)胞是近年研究發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞亞群，可參與機(jī)體局部微環(huán)境炎性反應(yīng)。Th17細(xì)胞可分泌IL-17、IL-6、IL-23等促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，與組織器官特異性免疫反應(yīng)發(fā)病具有密切聯(lián)系。Th17細(xì)胞與自身免疫性疾病的發(fā)生有緊密聯(lián)系，若減弱Th17細(xì)胞的分化，降低IL-17、IL-23水平，可能會(huì)減輕自身免疫性疾病病情嚴(yán)重程度[16]。IL-17可通過作用于巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，進(jìn)一步促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并募集活化的中性粒細(xì)胞遷移至炎性反應(yīng)部位和組織損傷部位[17]。IL-23可刺激Th17細(xì)胞的增殖，并延長(zhǎng)細(xì)胞的生存期[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-23可通過與白介素-23受體(IL-23R)特異性結(jié)合，激活蛋白酪氨酸激酶，隨后磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子，激活I(lǐng)L-17的產(chǎn)生，IL-17、IL-23共同參與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病機(jī)制[19-20]。孟珊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血中Th17細(xì)胞百分比率較健康者高，且血清IL-17、IL-23、IL-6水平也顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，脊柱炎組患者術(shù)前外周血Th17細(xì)胞比例及血清IL-17、IL-6、IL-23水平顯著高于健康對(duì)照組，提示Th17細(xì)胞比例增大可能會(huì)促進(jìn)布氏桿菌性脊柱炎的發(fā)生。術(shù)后復(fù)發(fā)亞組患者外周血Th17細(xì)胞比例及血清IL-17、IL-6、IL-23水平顯著高于未復(fù)發(fā)亞組，提示Th17細(xì)胞比例及IL-17、IL-23等細(xì)胞因子水平變化可能影響布氏桿菌性脊柱炎患者術(shù)后復(fù)發(fā)，猜測(cè)Th17細(xì)胞影響術(shù)后復(fù)發(fā)可能與Th17細(xì)胞具有促炎作用有關(guān)。但當(dāng)前針對(duì)布氏桿菌性脊柱炎的研究結(jié)果甚少，且納入研究對(duì)象僅有68例，可能使結(jié)果有所偏倚，對(duì)于其具體機(jī)制尚需深入探究。此外，Logistic回歸分析顯示，術(shù)后Th1細(xì)胞百分比、Th17細(xì)胞百分比、IL-17、IL-6、IL-23、IL-2、IFN-γ均是布氏桿菌性脊柱炎術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，提示監(jiān)測(cè)布氏桿菌性脊柱炎患者外周血Th1細(xì)胞及Th17細(xì)胞百分比，對(duì)預(yù)估患者術(shù)后是否會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)可能具有重大意義。

綜上所述，布氏桿菌性脊柱炎術(shù)后復(fù)發(fā)患者外周血Th17細(xì)胞百分率較高、Th1細(xì)胞百分率較低，可能參與布氏桿菌性脊柱炎患者術(shù)后復(fù)發(fā)。但本研究未深入研究Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞水平與布氏桿菌性脊柱炎術(shù)后復(fù)發(fā)機(jī)制的關(guān)系，后續(xù)還需進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

賈永利：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；楊新明：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；張培楠：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；孟憲勇：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；胡長(zhǎng)波：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫