脂滴在弓形蟲和艾美耳球蟲感染過程的動(dòng)力學(xué)及其功能

孫 霈 ， 王超越 ， 索 勛 ， 劉賢勇

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

頂復(fù)門原蟲(Phylum Apicomplexa)在宿主細(xì)胞的帶蟲空泡(Parasitophorous vacuole,PV)中完成增殖分裂時(shí)需要吸收宿主的營養(yǎng)物質(zhì)，而脂滴作為一類重要的營養(yǎng)來源參與宿主與病原之間的相互作用。本文以頂復(fù)門(Phylum Apicomplexa)原蟲中的龔地弓形蟲(Toxoplasmagondii)和艾美耳球蟲(Eimeriaspp.)為例，概述其在細(xì)胞內(nèi)寄生時(shí)的脂滴動(dòng)力學(xué)及其功能。

1 頂復(fù)門原蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收

頂復(fù)門原蟲是一類專性胞內(nèi)寄生的原蟲，包括龔地龔地弓形蟲(Toxoplasmagondii)、瘧原蟲(Plasmodium)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、艾美耳球蟲(Eimeria)等，能夠引起嚴(yán)重的人和動(dòng)物疾病。弓形蟲是一種能夠危害人畜健康的機(jī)會性原蟲，常以假包囊(速殖子)和包囊(緩殖子)的形式寄生于幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞，可引起動(dòng)物宿主流產(chǎn)以及視網(wǎng)膜炎癥等，并且是導(dǎo)致免疫功能缺陷患者死亡的主要病原體之一[1]。而目前已發(fā)現(xiàn)的艾美耳球蟲超過1 800種，其典型的球蟲生活史發(fā)育過程與弓形蟲相似。艾美耳球蟲感染造成的球蟲病給畜禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。弓形蟲及艾美耳球蟲一旦“主動(dòng)入侵”，會在胞內(nèi)建立非融合的區(qū)域，即帶蟲空泡，并在其內(nèi)完成生長增殖[2-5]。

頂復(fù)門原蟲的帶蟲空泡不與宿主細(xì)胞器融合，但其所需的營養(yǎng)物質(zhì)(如脂類物質(zhì))大多依賴于宿主細(xì)胞，而脂滴作為一類重要的營養(yǎng)來源參與宿主與病原之間的相互作用。關(guān)于這類寄生蟲如何攝取宿主細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)一直是研究的熱點(diǎn)。目前的研究證明，頂復(fù)門原蟲具有一套復(fù)雜的內(nèi)化機(jī)制用于吸收宿主細(xì)胞內(nèi)包括脂滴在內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)[6]。本篇綜述主要探討頂復(fù)門原蟲種的弓形蟲攝取宿主細(xì)胞脂滴內(nèi)化為自身營養(yǎng)物質(zhì)的機(jī)制，也概述宿主限制弓形蟲營養(yǎng)吸收的相關(guān)過程；同時(shí)還對艾美耳球蟲脂滴相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行闡述。

2 脂滴在寄生蟲感染期間的動(dòng)態(tài)變化

脂滴是一類球狀的動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的細(xì)胞器，存在于幾乎所有類型的細(xì)胞和生物體中，包括寄生蟲、白細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞[7]。其核心由中性脂質(zhì)組成，主要是甘油三酯、膽固醇磷脂；核心外由一層單層磷脂分子及各種蛋白包裹[8]。脂滴與其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、過氧化物酶體、核內(nèi)體等相互作用，能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，細(xì)胞信號傳導(dǎo)，膜運(yùn)輸以及能量穩(wěn)態(tài)等機(jī)體內(nèi)活動(dòng)；同時(shí)，脂滴活動(dòng)受機(jī)體調(diào)節(jié)并可能根據(jù)刺激、細(xì)胞類型、激活狀態(tài)和炎性環(huán)境而變化[7，9-12]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲在內(nèi)的一些病原微生物都能與脂滴相互作用。起初認(rèn)為，病原微生物主要是利用脂滴來獲得能量及脂質(zhì)等來源，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂滴也可以在病原微生物和宿主之間發(fā)揮媒介作用[7]。

弓形蟲作為一類營養(yǎng)缺陷型寄生蟲，它需要吸收宿主細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)并內(nèi)化為自身生長所需的營養(yǎng)，進(jìn)而完成生命周期。而同樣在帶蟲空泡內(nèi)寄生的艾美耳球蟲，也需要依賴宿主的營養(yǎng)物質(zhì)。但帶蟲空泡膜相當(dāng)于一個(gè)分子篩，只能允許小于1 300 Da的分子(如維生素、核苷酸、氨基酸以及糖類)進(jìn)入，這種結(jié)構(gòu)能夠直接限制寄生蟲對大分子物質(zhì)的攝取[13]。寄生蟲如何內(nèi)化脂滴這類分子量較大的物質(zhì)？圍繞這一問題，諸多科學(xué)家進(jìn)行了探究。

研究發(fā)現(xiàn)，寄生蟲在宿主細(xì)胞的寄生蟲帶蟲空泡中復(fù)制時(shí)，寄生蟲的增殖會誘發(fā)大量的脂滴生成[14]。弓形蟲完成復(fù)制、增殖等生命活動(dòng)需要脂類物質(zhì)參與，但其自身無法從頭合成膽固醇。研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲能夠?qū)⑺拗髦蝺?nèi)化到帶蟲空泡中，挽救脂質(zhì)含量以合成自身的膜結(jié)構(gòu)；或者在過量的情況下，將其存儲在蟲體自身的脂滴中以滿足自己的營養(yǎng)需求[9]。在弓形蟲感染期間，宿主細(xì)胞的脂滴數(shù)量會發(fā)生波動(dòng)。最初，宿主細(xì)胞中的脂滴會聚集在帶蟲空泡膜附近，隨著脂滴的數(shù)量逐漸增加，其峰值出現(xiàn)的時(shí)間與第1輪寄生蟲復(fù)制(入侵后約8 h)有關(guān)；但寄生蟲的高復(fù)制率需要該病原體能夠從哺乳動(dòng)物的內(nèi)吞細(xì)胞器中高效回收這類脂質(zhì)，隨感染時(shí)間的延長，脂滴逐漸從宿主細(xì)胞內(nèi)消失而內(nèi)化為弓形蟲體內(nèi)的物質(zhì)[15](圖1)。

圖1 弓形蟲感染宿主細(xì)胞期間脂滴的分布

牛艾美耳球蟲(E.bovis)體外培養(yǎng)時(shí)，通過免疫熒光能夠觀察到被感染的細(xì)胞內(nèi)有大量的脂滴積累[16]。目前尚未觀察艾美耳球蟲感染期間脂滴的具體動(dòng)態(tài)變化過程，但同屬頂復(fù)門原蟲的瘧原蟲、弓形蟲等的相關(guān)報(bào)道為后續(xù)開展艾美耳球蟲的脂滴研究工作建立了很好的平臺[17]。

3 脂滴參與代謝

脂滴不僅是甘油三酯貯存和分解、花生四烯酸代謝和前列腺素合成的主要場所,而且具有合成甘油三酯和磷脂的功能。宿主脂滴脂質(zhì)含量和脂解活性對于寄生蟲在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的發(fā)育非常重要[9，18]。

3.1 脂滴參與蟲體的脂肪酸代謝 研究顯示，脂滴為弓形蟲速殖子發(fā)育提供脂肪酸和中性脂質(zhì)[13]。但弓形蟲內(nèi)化宿主脂滴以及自身合成脂肪酸機(jī)制經(jīng)過長期探索才得以解析。弓形蟲能夠通過多種途徑利用宿主來源的脂肪酸。其中一部分脂肪酸能夠通過脂肪酸合酶(即FASI和FASII)途徑從宿主脂滴中獲取，在感染期間截獲宿主Rab7相關(guān)的脂滴并將其以胞吞途徑捕獲到帶蟲空泡中，使它們可被寄生蟲內(nèi)化吸收[7]。一旦脂滴由寄生蟲內(nèi)化，該寄生蟲可以修飾宿主衍生的脂質(zhì)，如膽固醇可以由2個(gè)?；o酶A酯化，通過膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)以存儲在胞質(zhì)脂滴[15]。在龔地弓形蟲中，F(xiàn)ASII負(fù)責(zé)合成超過80%的飽和長鏈脂肪酸(LCFA)，脂肪酸的合成和攝取對于寄生蟲的生長和發(fā)病機(jī)理具有重要作用，但由于 FASII途徑不是哺乳動(dòng)物細(xì)胞脂肪酸的主要來源，因此，開展弓形蟲FASII代謝酶功能研究將為新型抗蟲藥物的研制提供理論基礎(chǔ)。而另一部分脂肪酸則通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的脂肪酸延伸系統(tǒng)(ELO)，F(xiàn)ASII合成途徑中的一部分LCFA通過ELO途徑被合成超長鏈脂肪酸(VLCFA)前體。之后的研究也發(fā)現(xiàn)，弓形蟲可以利用其誘發(fā)的脂噬途徑來彌補(bǔ)脂肪酸的不足。

通過比較基因組發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲基因組中有7種涉及Ⅱ型脂肪酸合成的酶；進(jìn)一步利用免疫熒光以及電鏡定位柔嫩艾美耳球蟲脂肪酸生物合成酶(烯酰還原酶EtENR，Ⅱ型脂肪酸合酶的一種成分)，發(fā)現(xiàn)其定位于蟲體頂質(zhì)體[19-20]。目前的研究表明，EtENR可能是抗球蟲藥的特異性靶標(biāo)[19]。

我們通過ToxoDB數(shù)據(jù)庫比對以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)弓形蟲與艾美耳球蟲的脂肪酸合成途徑以及參與的相關(guān)酶相似(圖2、表1)。相關(guān)數(shù)據(jù)提示我們，未來對艾美耳球蟲脂肪酸合成及代謝的深入剖析可以參照弓形蟲已有的研究工作。

表1 弓形蟲脂肪酸合成和修飾的部分酶名稱及艾美耳球蟲基因號

圖2 龔地弓形蟲及球蟲中脂滴代謝的關(guān)鍵酶及其分布KCR:酮脂酰-CoA還原酶； HCD:羥酰-CoA還原酶； ECR:烯酰-CoA還原酶； ACP:酰基載體蛋白； KAR:酮脂酰ACP還原酶； HAD:羥?；鵆oA脫氫酶； ENR:烯醇還原酶； ACBP:?；鵆oA結(jié)合蛋白； PPTase:磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶； ATAC:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶； ELO:脂肪酸延長酶； G3PAT:甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶

3.2 脂滴參與蟲體的膽固醇代謝 有趣的是，不同的膽固醇營養(yǎng)缺陷性寄生蟲似乎遵循不同的膽固醇清除策略，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞膽固醇的代謝是寄生蟲特異性和/或宿主細(xì)胞特異性過程。眾所周知，龔地弓形蟲通過甲羥戊酸途徑在從頭合成膽固醇方面存在缺陷，它主要利用宿主細(xì)胞中的膽固醇(主要從低密度脂蛋白中獲取膽固醇)。在弓形蟲感染的細(xì)胞中，該過程獨(dú)立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，并且弓形蟲內(nèi)化的膽固醇能夠均勻分布在蟲體內(nèi)。但當(dāng)膽固醇過量時(shí)，寄生蟲利用膜相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白釋放膽固醇和磷脂酰膽堿。

迄今為止，還沒有針對任何艾美耳球蟲屬物種進(jìn)行膽固醇獲取的詳細(xì)分析。有學(xué)者分析了牛艾美耳球蟲對內(nèi)皮宿主細(xì)胞膽固醇代謝的影響，發(fā)現(xiàn)與其他球蟲存在顯著差異?？傮w而言，在牛艾美耳球蟲感染的宿主細(xì)胞中，游離膽固醇顯著積累。在對牛艾美耳球蟲的相關(guān)酶的研究中發(fā)現(xiàn)，最值得注意的是角鯊烯環(huán)氧酶(SQLE)的表達(dá)上調(diào)，已知其是甲羥戊酸途徑中的限制性關(guān)鍵酶之一，而且該酶也在弓形蟲感染的豬和人的宿主細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)。此外，在牛艾美耳球蟲感染的內(nèi)皮宿主細(xì)胞中，膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的2個(gè)關(guān)鍵分子(INSIG1和SCAP)上調(diào)表達(dá)可能指向弓形蟲中尚未描述的其他機(jī)制[21]。

有學(xué)者利用鐮形艾美耳球蟲(E.falciformis)為研究對象，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及脂質(zhì)組學(xué)等研究了鐮形艾美耳球蟲的磷脂組成和脂質(zhì)生物發(fā)生的酶促網(wǎng)絡(luò)，所述子孢子表達(dá)所有常見的甘油磷脂，如PtdCho、PtdEtn、PtdIns、PtdSer和PtdGro。鐮形艾美耳球蟲中某些脂類物質(zhì)以及酶與包括弓形蟲在內(nèi)的其他原蟲相似[17]。但目前尚未報(bào)道艾美耳球蟲誘導(dǎo)脂滴積累的細(xì)胞類型及其感染期間脂滴的動(dòng)態(tài)變化等內(nèi)容。

4 脂滴能夠限制寄生蟲生長

與可以在宿主細(xì)胞質(zhì)中自由擴(kuò)散的小分子代謝物不同，攝取宿主脂肪酸(FAs)對胞內(nèi)微生物構(gòu)成了獨(dú)特的挑戰(zhàn)，原因有2個(gè)：(1)脂肪酸大部分被隔離為膜結(jié)合的脂滴；(2)線粒體的活動(dòng)能夠限制弓形蟲脂肪酸的吸收。線粒體作為真核細(xì)胞的代謝中心，其是脂滴發(fā)生β-氧化生成脂肪酸的主要位置[14]。

作為類花生酸的主要來源，脂滴參與寄生蟲誘導(dǎo)的炎癥調(diào)控過程。在弓形蟲感染的肌肉細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，脂滴的形成與COX-2和PGE2高表達(dá)相關(guān)，這可能有助于細(xì)胞分泌IL-12和干擾素IFN-γ，其中，IFN-γ對于控制弓形蟲以及其他寄生蟲的感染至關(guān)重要[7,22-23]。

有研究報(bào)道稱，作為脂類降解的主場所——線粒體在人類多種疾病中都發(fā)揮作用[24]。專性的細(xì)胞內(nèi)病原體依賴于宿主細(xì)胞的營養(yǎng)來維持生存，限制其獲取特定營養(yǎng)素的能力會抑制其生長或誘發(fā)休眠狀態(tài)。形態(tài)學(xué)觀察顯示，在弓形蟲感染期間，宿主細(xì)胞線粒體會在帶蟲空泡附近伸長，而線粒體是脂滴發(fā)生β-氧化的場所，從而導(dǎo)致脂肪酸降解，這種途徑會大大降低弓形蟲對脂肪酸的吸收[24]。另有研究顯示，弓形蟲在自噬或甘油三酸酯貯庫基因缺陷的宿主細(xì)胞中，脂肪酸的吸收和生長受到抑制；相反，在正常的宿主細(xì)胞中，弓形蟲的脂肪酸攝取和增殖會相對增加[14]。由此我們猜測，宿主細(xì)胞可以通過影響線粒體的作用進(jìn)而抑制弓形蟲的生長，但其作用機(jī)理尚不清楚。另外，可以與胞內(nèi)寄生的病原體競爭營養(yǎng)的宿主細(xì)胞器還包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體等，但其通過何種機(jī)制限制弓形蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取仍是懸而未定的問題。

目前尚沒有宿主自身細(xì)胞器參與并限制艾美耳球蟲吸收及合成脂類物質(zhì)進(jìn)而影響其增殖的相關(guān)報(bào)道。但是通過外源加入一些能夠限制脂類物質(zhì)合成的化學(xué)試劑，如SOAT，ENR抑制劑等，能夠明顯限制艾美耳球蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖[25]。

5 展望

宿主的脂滴在代謝、信號傳導(dǎo)等過程中起主要作用，并積極參與先天免疫應(yīng)答。已有研究證實(shí)，脂滴在宿主—寄生蟲生物學(xué)中起著重要的作用，寄生蟲與宿主的相互作用調(diào)節(jié)了2種生物的脂質(zhì)代謝，這些研究為細(xì)胞生物學(xué)、免疫應(yīng)答和藥物開發(fā)提供了寶貴的知識。但目前脂滴的許多關(guān)鍵內(nèi)容尚不清楚，例如在感染期間脂滴儲存的脂類分子如何被調(diào)控？脂滴如何與其他細(xì)胞器相互作用？宿主通過什么機(jī)制限制寄生蟲對脂類物質(zhì)的攝?。克詫χ蔚纳钊胩剿?，不僅能夠彌補(bǔ)寄生蟲的對營養(yǎng)內(nèi)化吸收研究領(lǐng)域的短板，而且寄生蟲和宿主脂質(zhì)代謝的潛在差異可能為新型治療藥物的研發(fā)提供有希望的靶標(biāo)。