篤斯越桔組織培養(yǎng)體系的建立

常 婧， 程彥博

(1.遼寧省森林經營研究所，遼寧 丹東 118002；2.遼寧省林業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧 沈陽 110036)

篤斯越桔，又稱越桔、藍漿果，為多年生落葉或常綠灌木[1]。我國篤斯越桔大多分布在東北三省以及內蒙古地區(qū)[2]。近年來，因篤斯越桔果實含豐富氨基酸、礦質元素以及花青甙，低糖、低脂肪，抗氧化能力強，鮮美可口，無污染，深受人們的青睞[3]。篤斯越桔屬于野生酸性植物，果實小不易采摘，且產量不穩(wěn)定，導致篤斯越桔資源的稀缺，在市場上出現了供不應求的現象[4]。工廠化育苗是快速增加篤斯越桔資源的途徑之一。近年來，隨著微體快繁技術的迅速發(fā)展，篤斯越桔的組織培養(yǎng)有了一定的研究基礎，如外植體、培養(yǎng)基的篩選，激素種類及質量濃度的確定等，但是缺乏系統(tǒng)化的研究[5-9]。為此本論文建立了完善的篤斯越桔組織培養(yǎng)體系，可為篤斯越桔資源的保護與利用，工廠化繁殖提供一定的科技支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過對沈陽市渾南區(qū)高坎街道皇冠藍莓寶石莊園的15個無性系篤斯越桔綜合評定，篩選出優(yōu)良無性系篤斯越桔，對此無性系的150株篤斯越桔品質進行綜合評價，篩選出優(yōu)良單株2015-Z。

1.2 方 法

1.2.1 外植體選擇

選取篤斯越桔2015-Z優(yōu)良單株2～5節(jié)處成熟、健康且無病蟲害葉片和帶芽莖段，進行不定芽誘導。先將外植體清洗潔凈，用0.1%HgCl2浸泡4 min，用無菌水沖洗3次。在葉片的遠軸面靠近中脈處橫切兩刀，然后將葉片遠軸面向上接種。帶芽莖段剪成長0.5～1.0 cm。

將滅菌后的兩種外植體均接種到改良的WPM+ZT 1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂粉6.5 g·L-1上培養(yǎng)，pH值調至6.0。各接種10瓶，3次重復，30 d后調查誘導結果。

1.2.2 滅菌方法篩選

將帶芽莖段剪成長1.0～2.0 cm的小段，清水沖洗后，采用9種處理進行滅菌(表1)。將滅菌后的帶芽莖段用無菌水沖洗3次，接種至改良WPM培養(yǎng)基上。每個處理10個莖段，3次重復，2周后觀察外植體存活以及感染情況。

表1 帶芽莖段的滅菌處理

初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基均添加蔗糖25 g·L-1、瓊脂粉6.5 g·L-1，pH值調至6.0。

1.2.3 篤斯越桔初代誘導

將1.0～1.5 cm的帶芽莖段接種于添加玉米素ZT(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)的改良WPM培養(yǎng)基上，每個處理接種10瓶，每瓶5個莖段，3次重復，接種后20 d觀測記錄芽苗誘導情況。

1.2.4 篤斯越桔增殖培養(yǎng)

腋芽伸長至2 cm左右時，將試管苗轉接于添加不同激素的改良WPM培養(yǎng)基中。不同激素配比分別為：IBA 0.5 mg·L-1；ZT 0.5 mg·L-1； IBA 1.0 mg·L-1；ZT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1；ZT 1.5 mg·L-1；IBA 0.5 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1； IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1+ZT 1.5 mg·L-1；IBA 0.5 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1；IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1+ ZT 1.5 mg·L-1+ KT 1.5 mg·L-1。每個處理接種10瓶，每瓶5個帶芽莖段，3次重復，培養(yǎng)30 d后記錄增殖結果。

1.2.5 光照強度對試管苗增殖影響

將初代培養(yǎng)的試管苗轉移到改良的WPM+IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中，采用太陽光+2 000 lx(處理Ⅰ)、2 000 lx(處理Ⅱ)、3 000 lx(處理Ⅲ)三種光照條件進行組織培養(yǎng)。每個處理10瓶，每瓶轉5個單芽莖段，3次重復。30 d后調查苗高、增殖率、增殖系數等。

1.2.6 篤斯越桔生根培養(yǎng)

剪取2.0 cm左右的篤斯越桔試管苗，轉接到生根培養(yǎng)基上。以1/2WPM(改良)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加激素和培養(yǎng)方式見表2。每個處理接種10瓶，每瓶5個單芽莖段，3次重復，50 d后調查生根情況。

表2 篤斯越桔生根培養(yǎng)正交試驗水平和因素

1.3 數據處理

采用Excel軟件進行數據整理，SPSS軟件進行方差分析及多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同外植體對愈傷組織誘導的影響

接種10 d后，莖段底部開始有淡綠色的愈傷組織產生，接種20 d后，愈傷組織開始形成，部分莖段出現不定芽。葉片誘導的愈傷組織為白色或淡黃色，生長遲緩，其中一小部分愈傷組織能分化出不定芽，有些則褐化致死。接種30 d后，葉片褐化率較高，誘導率較低；莖段褐化率相對較低，誘導率較高(表3)。因此，選用帶芽莖段作為篤斯越桔組培的外植體。

表3 不同外植體對愈傷組織誘導的影響

2.2 不同滅菌方法比較

從表4可以看出，75%乙醇和2%次氯酸鈉混合處理的滅菌效果均不理想，污染率極高。而用75%乙醇浸泡20 s，再用0.1%HgCl2浸泡3 min，外植體污染率較低，出芽率最高。

表4 不同滅菌方法的滅菌效果

2.3 篤斯越桔初代培養(yǎng)基的篩選

接入初代培養(yǎng)基10 d，個別莖段已經呈現出淺綠色愈傷組織。從表5可以看出，培養(yǎng)20 d后，添加ZT的培養(yǎng)基均能誘導芽苗分化。其中，ZT質量濃度為1.0 mg·L-1時，篤斯越桔試管苗分化系數和分化率最高，生長速度較快，苗高且壯。所以，篤斯越桔最適初代培養(yǎng)基為WPM(改良)+ZT 1.0 mg·L-1。

表5 ZT對篤斯越桔試管苗誘導的影響

2.4 篤斯越桔增殖培養(yǎng)基的篩選

篤斯越桔試管苗經過30 d增殖培養(yǎng)后，所有處理的篤斯越桔苗均有不同程度的增殖。從增殖率及增殖系數可以看出，ZT對篤斯越桔增殖影響最大，起到了決定性作用，其次是IBA。由表6可知，IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1的增殖率和增殖系數均最高，且苗木粗壯，生長較旺盛，木質化程度高。因此，篤斯越桔最佳增殖培養(yǎng)基為WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1。

表6 篤斯越桔試管苗增殖培養(yǎng)結果

2.5 不同光照強度對試管苗增殖的影響

從表7可以看出，不同光照強度的組培苗，在前2周培育時，各生長性狀沒有顯著差異，但從第3周開始，在不同光強的培養(yǎng)下，幼苗生長逐漸呈現不同，培養(yǎng)第5周，處理Ⅰ繁育的苗木分化數最多，且莖稈粗壯，葉片綠色并富有光澤，有效地克服了玻璃化現象。雖然在苗高上遜于處理Ⅲ，但差異不顯著。因此處理I，即太陽光+2 000 lx光照條件，更適宜篤斯越桔試管苗的增殖培養(yǎng)。

表7 不同光照強度試管苗生長狀況

2.6 篤斯越桔生根培養(yǎng)基的篩選

正交試驗表中K值越大，因子水平越高；R值越高(即極差范圍)，因子間差距越大。由表8可以看出，激素類型和激素質量濃度對生根率有顯著影響，培養(yǎng)方式對生根率影響不顯著。在1/2WPM(改良)培養(yǎng)基中添加激素NAA，篤斯越桔試管苗生根效果普遍不好，而在添加IBA的培養(yǎng)基中，篤斯越桔試管苗生根率普遍較高。另外，激素質量濃度也很重要，激素質量濃度為1.0 mg·L-1的試管苗生根率均高于同種激素的其它質量濃度。綜上所述，篤斯越桔最適生根培養(yǎng)基為1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1，最適生根培養(yǎng)方式為接種后首先放置于暗培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)10 d，隨后轉移到光照強度2 000 lx下培養(yǎng)30 d，生根率72%，且苗木生長旺盛、根系粗壯。

表8 篤斯越桔試管苗生根培養(yǎng)正交試驗

3 結論與討論

在本研究中篤斯越桔優(yōu)良單株2015-Z的最佳外植體為帶芽莖段，不僅可以節(jié)省材料，且褐化率低、誘導率高，可在短時間內繁育出大批的優(yōu)良苗木，同時可加速繁育效率，這與李冰[10]的結果一致。

掌握外植體的滅菌方法是獲得無菌苗的基礎，滅菌時間過短可致使細菌、霉菌滋生，出現大面積污染；滅菌時間太長可造成酚污染，使試管苗生長發(fā)育受限，嚴重可死亡。用清水將篤斯越桔外植體洗凈，然后用75%乙醇浸泡20 s、0.1%升汞浸泡3 min，用無菌水沖刷3次的滅菌效果最佳。這與邢玉春[11]對沉水植物所用的滅菌方法一致。

玉米素(ZT)質量濃度為1.0 mg·L-1的改良WPM培養(yǎng)基誘導分化效果最佳，篤斯越桔試管苗分化系數10.8，分化率38%，試管苗生長速度較快，苗高且壯。這與劉淑英[11]的研究結果一致。從篤斯越桔試管苗增殖率、增殖系數可以得出，玉米素對篤斯越桔增殖影響最大，起到了決定性作用?？梢?，最佳增殖培養(yǎng)基應為WPM(改良)+ IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1，增殖率92%，增殖系數20.40，此時幼苗健壯，生長較旺盛，木質化程度高。李冰[10]在篤斯越桔的研究中也得出質量濃度為1.0 mg·L-1的ZT可以使不定芽莖變粗，葉片增大，增加體系的穩(wěn)定性。

強光照條件會抑制細胞增長，進而增進細胞分化，試管苗株型緊湊，葉片為綠色；而弱光條件有助于細胞的增長，同時延緩細胞分化，株高增加，出現徒長現象。通過對試管苗不同光照強度培養(yǎng)效果分析，發(fā)現利用太陽光與日光燈混合的方式可以有效地促進篤斯越桔試管苗增殖分化，并能控制苗木的徒長。

篤斯越桔屬于較難生根的植物，通過對生根試驗的結果分析，激素種類是影響篤斯越桔生根率的最大因素，起決定性作用，其次就是激素質量濃度。最適生根培養(yǎng)基為1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1，適宜的生根方式是暗培養(yǎng)10 d，然后轉移到光照下(光照強度2 000 lx)培養(yǎng)30 d，試管苗的生根率達72%，且苗木生長旺盛、根系粗壯。這與蘭士波[13]對野生篤斯越桔的研究一致，生根培養(yǎng)基都為1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1。