ALA對菊花抗氧化酶系統(tǒng)光照脅迫效應(yīng)的緩解作用

何培磊　葉自慧　孫延軍　周厚高

摘要：以切花菊品種D3為試驗(yàn)材料，研究噴施0、100、200mg/L3種濃度ALA對0%、25%、50%3種光照脅迫菊花的逆境環(huán)境下抗氧化酶系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，隨著遮陽程度的增加，菊花葉片內(nèi)SOD、POD和CAT活性在降低，其中POD和CAT活性隨著遮陽時間的延長而降低。ALA的噴施能夠緩解逆境環(huán)境給菊花抗氧化酶系統(tǒng)帶來的部分影響。

關(guān)鍵詞：菊花;光照脅迫;抗氧化酶系統(tǒng)

中圖分類號：S682.1+10.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0107-05

作者簡介：何培磊（1989—），男，河南信陽人，碩士，講師，研究方向?yàn)閳@藝花卉學(xué)。E-mail：hplstiven@163.com。

通信作者：周厚高，博士，教授，主要從事花卉學(xué)研究。E-mail：zhouhougao@163.com。

菊花（Chrysanthemum×morifoliumRamat.）是典型的陽性植物，生產(chǎn)中需要良好的光照條件，在溫室設(shè)施栽培中可能存在光照不足的問題，或在某些生長階段，如在切花采切之前需要適當(dāng)遮陰以提高花色的質(zhì)量。本研究旨在探討光照脅迫下菊花重要抗逆生理反應(yīng)以及噴施ALA（5-氨基乙酰丙酸，5-aminolevulinicacid）處理對此類抗逆反應(yīng)的緩解效應(yīng)。

ALA是所有卟啉類化合物合成的關(guān)鍵前體，早已引起研究者們的重視[1]。ALA能夠直接啟動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[2]和間接啟動光氧化反應(yīng)[3]。ALA是一種α-氨酮，在有氧和微堿性條件下可自動烯醇化并生成O-2[KG-*3]·、H2O2和·OH等活性氧自由基[2，4]。ALA在提高植物的抗冷、耐鹽性、耐弱光性上有很大的應(yīng)用前景[5-6]。關(guān)于逆境對植物抗氧化酶系統(tǒng)方面的影響研究和報道已經(jīng)有很多[7-11]，如水脅迫[7]，重金屬砷、鋁脅迫[8，11]，干旱脅迫對抗氧化酶系統(tǒng)的影響。

ALA可顯著提高植物的抗逆性，緩解各種非生物逆境脅迫對植物生長、生理生化和光合作用的影響，在ALA緩解各類脅迫效應(yīng)方面，近年學(xué)者們做了不少的研究，取得了一些進(jìn)展[12-17]。ALA能緩解鹽脅迫對喜樹幼苗[12]、花椰菜幼苗[13]、黃瓜幼苗[14]抗氧化酶活性的影響，能改善NaCl脅迫下酸棗幼苗光合特性[15]，對春玉米衰老的延緩[16]，以及改善干旱脅迫下山定子[17]、早熟禾[18]葉綠素及生理狀態(tài)。ALA對菊花的光合作用和生理特性的影響及對非生物逆境的緩解效應(yīng)研究很少[19]，尚無對設(shè)施生產(chǎn)的光照逆境緩解效應(yīng)的研究。本研究主要探討菊花噴施外源ALA對光照脅迫下抗氧化酶活性的緩解效應(yīng)，以期為ALA在園藝產(chǎn)業(yè)以及在植物抗逆性上的應(yīng)用提供更多的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以切花菊品種D3（Chrysanthemum×morifoliumD3）為試驗(yàn)材料，選用健壯、無病蟲害、均勻一致的扦插種苗。試驗(yàn)于2018年9月下旬進(jìn)行，試驗(yàn)實(shí)施位于廣州市白云區(qū)落潭鎮(zhèn)菊花生產(chǎn)基地內(nèi)。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用3個遮陽梯度，分別為正常光照100%（CK）、中度遮陽為正常光照的50%（T1）、重度遮陽為正常光照的25%（T2）;3個ALA的噴施濃度分別為B1（0mg/L）、B2（100mg/L）、B3（200mg/L），共9個處理組處理試驗(yàn)菊花。將菊花苗定植于裝有泥炭土和珍珠巖的花盆中（泥炭土與珍珠巖的體積比為3∶[KG-*3]1），每盆4株，每個處理組9盆。定植后正常光照恢復(fù)5d取第1次樣品（d0），并測量3種抗氧化酶活性指標(biāo)。在遮陽5d后，進(jìn)行連續(xù)3d的噴施ALA處理，之后每10d取樣1次，共取3次樣（分別d10、d20、d30），并進(jìn)行3種抗氧化酶活性指標(biāo)的測定。

1.2.1超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（NBT法）

（1）試劑藥品：0.05mol/L磷酸緩沖液（pH值7.8）;130mmol/L甲硫氨酸（Met）;750μmol/L氮藍(lán)四唑（NBT）;100μmol/LEDTA-2Na;20μmol/L核黃素。

（2）將1支暗對照管置于暗處，其余樣品日光下（4000lx）反應(yīng)20min（時間可自行調(diào)節(jié)，反應(yīng)體系顏色變化即可）。以暗對照作空白調(diào)零，測定光對照及樣品560nm處吸光度。

（3）計(jì)算SOD活性（U/g）=[（DCK-DE）·VT·D]/（0.5·DCK·W·VR）。式中：DCK為光對照管吸光度;DE為樣品管吸光度;VT為酶提取液總體積，mL;VR為測定時酶液用量，mL;W為樣品鮮質(zhì)量，g;D為稀釋倍數(shù)。SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活性單位。

1.2.2過氧化物酶（POD）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）

（1）試劑藥品：0.05mol/L磷酸緩沖液（pH值5.5）;0.2%愈創(chuàng)木酚溶液;0.3%H2O2。

（2）3mL反應(yīng)體系：1.0mLPBS（pH值5.5），0.95mL0.2%愈創(chuàng)木酚溶液，1.0mL0.3%H2O2，1.0mL0.3%H2O2，50μL酶液（酶液用量可自行調(diào)節(jié)，以吸光度在0.1～0.9間即可），最后加入H2O2或愈創(chuàng)木酚啟動反應(yīng)，可使反應(yīng)體系混合更均勻。

（3）以PBSpH值5.5為對照調(diào)零，記錄470nm處吸光度（以每1min增加0.01定義為1個酶活性單位）。

（4）POD活性[U/（g·min）]=（ΔD470nm·VT·D）/（0.01·W·VR·t）。式中：ΔD470nm為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化;VT為總的酶液提取液體積，mL;D為稀釋倍數(shù);VR為測定時的酶液體積，mL;W為樣品鮮質(zhì)量，g;t為反應(yīng)時間，min。

1.2.3過氧化氫酶（CAT）活性測定

（1）試劑配制：0.15mol/L磷酸緩沖液（pH值7.0）：取A母液（Na2HPO4）457.5mL和B母液（NaH2PO4）292.5mL混合后用蒸餾水定容至1000mL。

（2）反應(yīng)液配制：取200mLPBS（0.15mol/L，pH值7.0），加入0.3092mL30%的H2O（原液）搖勻即可。

（3）樣品測定：取3mL反應(yīng)液加入0.1mL酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定D240nm（紫外）（測定40s）。

（4）酶活性計(jì)算：以1minD值減少0.01為1個酶活性單位。

CAT活性[U/（g·min）]=[ΔD240nm×Vt]/（W×Vs×0.01×t）。式中：ΔD240nm為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化;W為樣品鮮質(zhì)量，g;t為反應(yīng)時間，min;Vt為提取酶液總體積，mL;Vs為測定時取用酶液體積，mL。

2結(jié)果與分析

2.1ALA對遮陽下菊花葉片SOD活性的影響

由表1可知，在正常光照條件下，ALA的噴施對其葉片中SOD活性的影響不大。光照脅迫對SOD活性的影響是顯著的，考察d10、d20、d30遮陽但未噴施ALA的處理其SOD活性隨著遮陽的強(qiáng)度和遮陽的時間長度的增加逐步下降，效應(yīng)達(dá)到極顯著差異。在d10天，中度遮陽、重度遮陽處理其SOD活性分別降低24.81%、39.51%，d20分別降低28.62%、37.29%，d30分別降低30.74%、40.83%。在中度遮陽處理未使用ALA（T1）情況下，處理10、20、30d其SOD活性分別降低22.63%、26.27%、24.83%;在重度遮陽處理未使用ALA（T2）情況下，處理10、20、30d其SOD活性分別降低39.85%、37.40%、37.93%。在同等光照脅迫強(qiáng)度下，SOD活性比不遮陽的對照明顯下降（表1中T1B1、T2B1），但不同脅迫時間長度之間差異不顯著。

對光照脅迫下的菊花噴施外源ALA處理，仍然導(dǎo)致菊花葉片SOD活性明顯下降（表1中T1B2、T1B3、T2B2、T2B3）。處理10d時快速下降，中度遮陽下噴施ALA100、200mg/L，SOD活性分別下降17.39%、9.22%，重度遮陽下分別下降34.60%、31.11%。重度遮陽處理的SOD活性下降比中度遮陽處理幅度大得多，由此可見SOD活性下降的幅度與光照脅迫的強(qiáng)度密切相關(guān)。觀察d10、d20、d30，其中重度遮陽T2下的各時間點(diǎn)的酶活性降低幅度最大，比如，噴施ALA100mg/L處理T2B2各時間點(diǎn)與d0相比菊花酶活性分別下降34.60%、35.14%、31.35%。由此可見，即使噴施ALA，光照脅迫仍然能夠使菊花葉片中的SOD活性下降，但遮陽時間長度d10到d30間對SOD活性的效果未表現(xiàn)出顯著性差異，與沒有ALA處理的T1B1、T2B1趨勢一致。

盡管ALA噴施沒有阻止光照脅迫導(dǎo)致菊花葉片SOD活性的下降，但是ALA噴施對SOD活性下降的緩解作用十分明顯。在中度光照脅迫T1組，處理10d時，噴施ALA100、200mg/L，與沒有噴施ALA的T1B1相比，SOD活性分別增加7.75%、21.83%，d20分別增加14.07%、23.40%，d30分別增加11.71%、21.55%。在重度光照脅迫T2組，處理10d時，噴施ALA100、200mg/L，與沒有噴施ALA的T2B1的相比，SOD的活性分別增加7.80%、11.46%，d20分別增加2.72%、9.90%，d30分別增加9.65%、10.46%。

噴施效果整體表現(xiàn)為200mg/LALA>100mg/LALA>0mg/LALA;相比較不同的遮陽處理，ALA的噴施對于中度遮陽下菊花葉片SOD活性的影響更顯著，各處理組之間表現(xiàn)出顯著性差異，且在中度遮陽下噴施200mg/L的ALA展示的緩解效果最突出。

2.2ALA對光照脅迫下菊花葉片POD活性的影響

由表2可知，在正常光照條件下，ALA的噴施對菊花葉片中POD活性的影響不大，到后期d30體現(xiàn)了一定的促進(jìn)作用。但光照脅迫對POD活性影響是顯著的，d10、d20、d30遮陽但未噴施ALA（T1B1、T2B1）的處理POD活性隨著遮陽的強(qiáng)度和遮陽時間長度的增加逐步下降，效應(yīng)達(dá)到極顯著差異。在處理10d，[JP+1]中度遮陽、重度遮陽處理SOD活性比d0分別降低20.61%、29.20%，d20分別降低28.62%、38.82%，d30分別降低34.64%、47.71%。

對光照脅迫下的菊花噴施外源ALA處理，仍然導(dǎo)致菊花葉片POD活性明顯下降（表2，T1B2、T1B3、T2B2、T2B3）。處理10d時快速下降，中度遮陽下噴施ALA100、200mg/L處理SOD活性比d0分別下降16.14%、17.46%，重度遮陽下分別下降32.23%、19.37%。重度遮陽處理的SOD活性下降比中度遮陽處理幅度大得多，由此可見SOD活性下降的幅度與光照脅迫的強(qiáng)度密切相關(guān)。在中度遮陽和重度遮陽處理下，隨著遮陽時間的延長，POD活性呈現(xiàn)出明顯逐步降低，差異顯著，這與遮陽對菊花葉片SOD的活性影響表現(xiàn)不同。觀察d10、d20、d30，其中重度遮陽T2下的各時間點(diǎn)的酶活性降低幅度最大，比如，噴施ALA100mg/L處理T2B2各時間點(diǎn)與d0相比菊花酶活性分別下降23.23%、32.66%、39.72%。

不同濃度ALA噴施對POD活性下降的緩解作用不一樣。在中度光照脅迫T1組，噴施ALA對光照脅迫導(dǎo)致的POD活性降低的緩解作用前期不明顯，d20、d30時才有一定的促進(jìn)作用。在重度遮陽T2組，噴施ALA對光照脅迫導(dǎo)致的POD活性降低的緩解作用比中度遮陽效果更明顯，在處理10d觀察，噴施ALA100、200mg/L，與沒有噴施ALA的T2B1的相比，POD的活性分別增加9.71%、18.14%，d20分別增加11.37%、22.42%，d30分別增加16.65%、27.65%?？梢园l(fā)現(xiàn)，噴施ALA對光照脅迫導(dǎo)致POD活性降低的緩解作用在重度光照脅迫下，隨著脅迫時間的延長，其效果更明顯。

總之，噴施效果整體表現(xiàn)為200mg/LALA>100mg/LALA>0mg/LALA;相比較不同的遮陽處理，ALA的噴施對于重度遮陽下菊花葉片POD活性的影響更顯著。

2.3ALA對遮陽下菊花葉片過氧化氫酶CAT活性的影響

由表3可知，在正常光照條件下，ALA的噴施對菊花葉片中CAT活性的影響不大。但光照脅迫對CAT活性影響是顯著的，d10、d20、d30遮陽但未噴施ALA（T1B1、T2B1）的處理CAT活性隨著遮陽的強(qiáng)度和遮陽時間長度的增加逐步下降，效應(yīng)達(dá)到極顯著差異。在處理10d時，中度遮陽、重度遮陽處理CAT活性比d0分別降低16.05%、35.46%，d20分別降低22.40%、47.12%，d30分別降低33.33%、61.55%。

對光照脅迫下的菊花噴施外源ALA處理，仍然導(dǎo)致菊花葉片CAT活性升高（表3中T1B2、T1B3、T2B2、T2B3）。處理10d時快速下降，中度遮陽下噴施ALA100、200mg/L處理CAT活性分別比不施ALA的處理T1B1升高了8.25%和近持平，重度遮陽下分別升高了5.38%、22.15%。但總體來講，CAT活性隨著光照脅迫時間延長而持續(xù)下降。

與上述SOD、POD酶活性變化不同的是，ALA的噴施對緩解光照脅迫導(dǎo)致菊花CAT活性下降的作用明顯較弱，只在200mg/L的前期d10有所體現(xiàn)，隨著光照脅迫時間延長，緩解效應(yīng)逐步減弱，到d20、d30時期ALA的緩解作用已經(jīng)消失。

3結(jié)果與討論

外源ALA的噴施能夠通過影響植物的光合作用，從而提高植物的營養(yǎng)生長能力，提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)，已經(jīng)在很多的試驗(yàn)中獲得證實(shí)，如顯著提高黃瓜幼苗的全株干質(zhì)量、壯苗指數(shù)和根系活力[6，14]。但是對于在非生物逆境條件下，外源ALA對逆境效應(yīng)緩解作用的探討還不多，探討了ALA緩解喜樹幼苗[12]、酸棗幼苗[15]鹽害的生理機(jī)制，探討了ALA緩解干旱對早熟禾[18]、山定子[17]以及低溫對玉米幼苗[16]脅迫的生理機(jī)制，對菊花相關(guān)研究更少，僅見探討了ALA緩解低溫脅迫的光合作用和生理影響[19]。

抗氧化酶系統(tǒng)是逆境生理研究的重要指標(biāo)，不同的非生物逆境研究都涉及到SOD、POD和CAT等活性的研究[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，ALA緩解菊花光照脅迫的效應(yīng)中，SOD、POD和CAT活性的反應(yīng)模式是不一樣的。在光照脅迫下，ALA都能使SOD、POD下降中的活性得到一定程度的回升反應(yīng)，這一結(jié)果與花椰菜幼苗的研究[13]一致，該研究表明150mmol/LNaCl脅迫下，噴施10mg/LALA能夠顯著提高SOD、POD活性。本研究發(fā)現(xiàn)，光照脅迫下，在時間維度SOD活性下降幅度較小，也就是說，處理10～30dSOD活性下降較少，而POD活性在時間維度的穩(wěn)定性稍差，隨著脅迫時間持續(xù)，POD活性持續(xù)下降。

在酸棗種子萌發(fā)的研究發(fā)現(xiàn)，ALA的噴施能夠減緩鹽水對酸棗種子的脅迫作用，明顯提高CAT、SOD、POD活性和MDA含量[15]。而本研究發(fā)現(xiàn)，ALA對光照脅迫下緩解CAT活性下降有一定效果，但不如在酸棗幼苗中的作用顯著，且效應(yīng)的持續(xù)性差。

本研究從ALA濃度和持續(xù)時間2個維度觀察了在光照脅迫下，ALA對菊花葉片抗氧化酶活性的緩解效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了CAT、SOD、POD不一樣的反應(yīng)模式，特別是在時間維度ALA的效果持續(xù)性方面，3種酶的反應(yīng)不同，而這方面的研究目前還不多。今后將在ALA濃度梯度和時間長度方面進(jìn)一步拓展，在農(nóng)藝性狀到分子機(jī)制不同層面加強(qiáng)研究，為生產(chǎn)應(yīng)用提供更多的資料。

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