上調(diào)lncRNA SNHG12與miR-199a-5p/FZD6軸對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

周京濤，劉佳，努爾買買提·阿米都拉，閆軍，寇旭東，張鴿文

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院 普通外科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)第八人民醫(yī)院 急診科，新疆烏魯木齊 830000；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 肝臟與甲狀腺外科，湖南 長沙 410008）

肝細(xì)胞癌（HCC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一。據(jù)估計(jì)，每年約有50萬至100萬新病例被診斷為HCC，其病死率在癌癥中居第三位[1]。侵襲、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是導(dǎo)致HCC患者死亡的主要原因，而且肝癌患者通常診斷為晚期，具有較高的致命性[2]。因此深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。研究表明HCC的發(fā)生發(fā)展是一系列基因改變的多期過程，這些基因改變在肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起著至關(guān)重要的作用。目前，越來越多的研究報(bào)道了長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNA）在癌癥發(fā)生中的作用。lncRNA是一類長度超過200個(gè)核苷酸的RNA分子，不編碼蛋白質(zhì)，但具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力[3]。研究表明，lncRNA影響多種生物如發(fā)育、分化和致癌調(diào)控過程[4-5]。此外，lncRNA的失調(diào)可能與各類癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。例如，lncRNA HOXA11-AS通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。另外發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA SchLAH通過與FUS相互作用，抑制HCC的轉(zhuǎn)移[8]。lncRNA MLK7-AS1在結(jié)腸癌中高表達(dá)，其高表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[9]。最近研究揭示了HCC細(xì)胞中異常表達(dá)的lncRNA，如lncRNA RUSC1-AS1在HCC中表達(dá)上調(diào)，其可通過靶向調(diào)控miR-326的表達(dá)促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[10]。lncRNA MIF-AS1在HCC中表達(dá)升高，其表達(dá)水平與HCC患者惡性臨床病理特征及不良預(yù)后差密切相關(guān)，其作用機(jī)制可能通過促進(jìn)EMT過程有關(guān)[11]。lncRNA小核仁RNA宿主基因12（small nucleolar RNA host gene 12，SNHG12）作為重要的一種lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)其與胃癌、骨肉瘤和非小細(xì)胞肺癌等癌癥發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。有研究表明，lncRNA SNHG12在HCC組織表達(dá)明顯上調(diào)，但lncRNA SNHG12調(diào)控HCC發(fā)展的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬探究lncRNA SNHG12在HCC發(fā)展過程中的作用，為進(jìn)一步闡明HCC的進(jìn)展機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

HCC細(xì)胞H epG2和人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEC購自上海鈺博生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于美國Gibco公司；Turbofect Transfection Reagent、點(diǎn)突變試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒為購于美國Thermo公司；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser購于大連Takara公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體購自美國圣克魯斯生物科技有限公司；GAPDH、E-cadherin、N-cadherin抗體購自北京康為世紀(jì)生物公司；陰性對照質(zhì)粒（siRNA NC）、SNHG12下調(diào)質(zhì)粒（SNHG12 siRNA）、SNHG12過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-SNHG12）、模擬物對照組（mimics NC）、miR-199a-5p模擬物（miR-199a-5p mimics）、抑制劑對照組（inhibitor NC）、miR-199a-5p抑制劑（miR-199a-5p inhibitor）、FZD6下調(diào)質(zhì)粒（FZD6 siRNA）、FZD6過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-FZD6）由上海生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS 和1% 青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞和HIBEC 細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞按相應(yīng)密度接種于6 孔板或12 孔板中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長且狀態(tài)良好的細(xì)胞，細(xì)胞長滿后，加入胰酶消化，用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞鋪于12 孔板中，細(xì)胞密度匯合達(dá)75% 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液替換為新鮮10% FBS DMEM，采用Turbofect 轉(zhuǎn)染試劑按照說明書轉(zhuǎn)染各組重組質(zhì)粒，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后收集各組細(xì)胞RNA 樣和蛋白樣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.3 細(xì)胞增殖測定取對數(shù)生長且狀態(tài)良好的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密長滿時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，棄胰酶，加入含10% FBS DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于96 孔板中，細(xì)胞長到70%～80% 時(shí)，加入Turbofect 試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，每組重復(fù)8 個(gè)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，PBS 洗2 次，每孔加10 μLCCK-8 工作液，孵育4 h，在酶標(biāo)儀上讀取各孔在450 nm 處的吸光值（OD），并計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)-20 ℃保存的Matrigel 取出后置于4 ℃冰箱中融化，Matrigel 中加入無FBS DMEM 培養(yǎng)基使其濃度為1 mg/mL，將100 μL 稀釋后的Matrigel 添加于每個(gè)上室中，共同孵育5 h凝成膠狀。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞長滿后，PBS 洗兩次，加入胰酶消化，添加適量無FBS的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞懸液密度為5×105/mL，細(xì)胞懸液添加到Transwell 小室中，下室中添加10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，取出小室，PBS洗滌小室2 次，多聚甲醛固定20 min，0.1% 結(jié)晶紫染色15 min，隨機(jī)選取5 個(gè)視野細(xì)胞放在顯微鏡下觀察并記數(shù)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測用生物學(xué)信息軟件miRanda 和TargetScan 分別預(yù)測SNHG12 和miR-199a-5p 潛在結(jié)合基因，PCR 擴(kuò)增SNHG12 全長片段及FZD63'UTR 片段后，構(gòu)建SNHG12 wt、FZD6 wt 載體。SNHG12 wt、FZD6 wt 載體再通過點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建SNHG12和FZD6 突變體。取對數(shù)生長且狀態(tài)良好的細(xì)胞，用Turbofect 試劑轉(zhuǎn)染各組重組質(zhì)粒至細(xì)胞中，采用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.6 qRT-qPCR收取細(xì)胞RNA 樣，樣品中加入TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA，測定RNA濃度及純度后，通過Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA 為cDNA，程序?yàn)榈谝徊?2 ℃，2 min；37 ℃ 15 min，第二步85 ℃ 5 s，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的模板，進(jìn)行RTqPCR，使用2-△△Ct法分析定量結(jié)果。實(shí)驗(yàn)所用的引物見表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequence

1.2.7 Western blot 檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h 后收取細(xì)胞總蛋白樣，蛋白樣中加入100 μL 的蛋白裂解液、0.70 μL PMSF 配制預(yù)混劑，冰浴30 min，每隔10 min 彈1 次。4 ℃、12000 r/min 離心10 min。取2 μL 上清用BCA 檢測法檢測蛋白濃度，剩余上清加入5×SDS-PAGE 上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，取適量樣品上樣，進(jìn)行SDSPAGE 電泳，將電壓設(shè)置為70 V 30 min（濃縮膠），110 V 90 min（分離膠）；電泳完畢后，蛋白膠經(jīng)Bio-Rad 的半干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)印至0.22 μm 的PVDF 膜，在19 V 恒壓狀態(tài)下轉(zhuǎn)膜30 min。封閉：轉(zhuǎn)膜完成后，用含有50 g/L 脫脂奶粉的TBST 緩沖液室溫封閉2 h；封閉完成，將PVDF 膜放入用含20 g/L 脫脂奶粉的TBST 緩沖液稀釋好的一抗中，4 ℃過夜振蕩孵育，一抗孵育好后，用TBST 洗膜6 次；二抗室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗膜5 次后，使用凝膠成像儀曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，至少取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，當(dāng)P＞0.05時(shí)，表示差異不顯著；當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)SNHG12 對HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT 的影響

HepG2細(xì)胞中SNHG12的表達(dá)量明顯高于HIBEC細(xì)胞（P＜0.01）（圖1A）。與siRNA NC組比較，SNHG12 siRNA組的SNHG12表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）（圖1B）。CCK-8結(jié)果顯示，SNHG12 siRNA組的細(xì)胞增殖能力低于siRNA NC組（P＜0.05）（圖1C）。SNHG12 siRNA組細(xì)胞的侵襲數(shù)目低于siRNA NC組（P＜0.05）（圖1D-E）。與siRNA NC組比較，SNHG12 siRNA組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升，N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量明顯下降（均P＜0.01）（圖1F-I）。與SNHG12 siRNA組比較，siRNA NC組細(xì)胞形態(tài)變長，細(xì)胞間距變大，細(xì)胞間連接減弱（圖1J）。以上結(jié)果表明下調(diào)SNHG12能夠抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

圖1 下調(diào)SNHG12 抑制HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT A：qRT-PCR 檢測SNHG12 在HepG2 和HIBEC 細(xì)胞中的表達(dá)量；B：qRT-PCR 檢測干擾SNHG12 后HepG2 細(xì)胞中的SNHG12 的表達(dá)量；C：CCK-8 檢測SNHG12 對HepG2 細(xì)胞增殖的影響；D：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測SNHG12 對HepG2 細(xì)胞侵襲的影響；E：HepG2 細(xì)胞的侵襲數(shù)目；F：Western blot 檢測SNHG12對HepG2 細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin 表達(dá)的影響；G：E-cadherin、N-cadherin 蛋白的相對表達(dá)量；H：Western blot檢測SNHG12 對HepG2 細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響；I：MMP-2、MMP-9 蛋白的相對表達(dá)量；J：熒光顯微鏡觀察HepG2 細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Inhibitory effects of down-regulation of SNHG12 on proliferation,invasion and EMT of HepG2 cells A:The expression of SNHG12 in HepG2 and HIBEC cells detected by qRT-PCR;B:The expression level of SNHG12 in HepG2 cells after SNHG12 interference detected by qRT-PCR;C:The effect of SNHG12 on proliferation of HepG2 cells detected by CCK-8 assay;D:The effect of SNHG12 on invasion of HepG2 cells detected by Transwell assay;E:The invasion number of HepG2 cells;F:The effect of SNHG12 on the expressions of E-cadherin and N-cadherin in HepG2 cells determined by Western blot;G:Relative expression levels of E-cadherin and N-cadherin proteins;H:The effect of SNHG12 on the expressions of MMP-2 and MMP-9 in HepG2 cells determined by Western blot;I:Relative expression levels of MMP-2 and MMP-9 proteins;J:The morphology of HepG2 cells observed by fluorescence microscopy

2.2 SNHG12 和miR-199a-5p 之間的靶向關(guān)系

采用生物信息學(xué)軟件miRanda預(yù)測SNHG12和miR-199a-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果見圖2A。當(dāng)質(zhì)粒攜帶SNHG123'UTR wt時(shí)，miR-199a-5p的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01）；當(dāng)質(zhì)粒攜帶SNHG123'UTR mut時(shí)，miR-199a-5p的熒光素酶活性無變化（P＞0.05）（圖2B）。表明SNHG12和miR-199a-5p具有靶向關(guān)系。

圖2 SNHG12 和miR-199a-5p 之間的靶向關(guān)系 A：miRanda 預(yù)測SNHG12 和miR-199a-5p 之間的結(jié)合位點(diǎn)；B：熒光素酶表達(dá)量的測定Figure 2 Targeting relationship between SNHG12 and miR-199a-5p A:The binding sites between SNHG12 and miR-199a-5p predicted by miRanda;B:Determination of luciferase expression level

2.3 下調(diào)miR-199a-5p 對HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT 的影響

HepG2細(xì)胞中miR-199a-5p的表達(dá)量明顯低于HIBEC細(xì)胞（P＜0.01）（圖3A）。與inhibitor NC組比較，miR-199a-5p inhibitor組的miR-199a-5p表達(dá)量明顯下降（P＜0.01）（圖3B）。miR-199a-5p inhibitor組的細(xì)胞增殖能力明顯高于inhibitor NC組（P＜0.01）（圖3C）。miR-199a-5p inhibitor組細(xì)胞的侵襲數(shù)目高于inhibitor NC組（P＜0.05）（3D-E）。與inhibitor NC組比較，miR-199a-5p inhibitor組的E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降，N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量明顯上升（均P＜0.01）（圖3F-I）。與inhibitor NC組比較，miR-199a-5p inhibitor組細(xì)胞間距變大，細(xì)胞形態(tài)拉長，排列不規(guī)則（圖3J）。以上結(jié)果表明下調(diào)miR-199a-5p能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

2.4 SNHG12 通過miR-199a-5p 調(diào)控HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT

與mimics NC組比較，miR-199a-5p mimics組m i R-199 a-5 p 的表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）（圖4 A）。與pcDNA-3.1（+）+mimics NC組比較，pcDNA-SNHG 12+mimics NC組細(xì)胞增殖能力明顯增加（P＜0.01），細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加（P＜0.01），E-cadherin 蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.01），N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量明顯上升（均P＜0.01），細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)細(xì)長、間距變寬、部分細(xì)胞伸出偽足；與pcDNA-3.1（+）+mimics NC組比較，pcDNA-3.1（+）+miR-199a-5p mimics組的細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.05），細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升（P＜0.01），N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量明顯下降（均P＜0.01），細(xì)胞EMT形態(tài)學(xué)改變減弱；與pcDNA-3.1（+）+miR-199a-5p mimics組比較，pcDNA-SNHG12+miR-199a-5p mimics組的細(xì)胞增殖能力上升（P＜0.05），細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.01），N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量明顯上升（均P＜0.01），細(xì)胞間距變寬、形態(tài)逐漸變長，排列也不規(guī)整（圖4B-I）。表明SNHG12通過miR-199a-5p調(diào)控HepG2細(xì)胞增殖、侵襲和EMT。

圖3 下調(diào)miR-199a-5p 促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT A：RT-qPCR 檢測miR-199a-5p 在HepG2 和HIBEC 細(xì)胞中的表達(dá)量；B：qRT-PCR 檢測干擾miR-199a-5p 后細(xì)胞中miR-199a-5p 的表達(dá)量；C：CCK-8 檢測miR-199a-5p 對HepG2 細(xì)胞增殖的影響；D：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miR-199a-5p 對HepG2 細(xì)胞侵襲的影響；E：HepG2 細(xì)胞的侵襲數(shù)目；F：Western blot 檢測miR-199a-5p 對HepG2 細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin 表達(dá)的影響；G： E-cadherin、N-cadherin 蛋白的相對表達(dá)量；H：Western blot 檢測miR-199a-5p 對HepG2 細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9 表達(dá)的影響；I：MMP-2、MMP-9 蛋白的相對表達(dá)量；J：熒光顯微鏡觀察HepG2 細(xì)胞形態(tài)Figure 3 Enhancing effects of down-regulation of miR-199a-5p on proliferation,invasion and EMT of HepG2 cells A:The expression of miR-199a-5p in HepG2 and HIBEC cells detected by RT-qPCR;B:The expression level of miR-199a-5p in HepG2 cells after miR-199a-5p interference detected by qRT-PCR;C:The effect of miR-199a-5p on proliferation of HepG2 cells detected by CCK-8 assay;D:The effect of miR-199a-5p on invasion of HepG2 cells Transwell assay;E:The invasion number of HepG2 cells;F:The effect of miR-199a-5p on expressions of E-cadherin and N-cadherin in HepG2 cells determined by Western blot;G:Relative expression levels of E-cadherin and N-cadherin proteins;H:The effect of miR-199a-5p on the expressions of MMP-2 and MMP-9 in HepG2 cells determined by Western blot;I:Relative expression levels of MMP-2 and MMP-9 proteins;J:The morphology of HepG2 cells observed by fluorescence microscopy

圖4 SNHG12 通過miR-199a-5p 調(diào)控HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT A：qRT-PCR 檢測過表達(dá)miR-199a-5p 后細(xì)胞中的miR-199a-5p 表達(dá)量；B：SNHG12 通過miR-199a-5p 影響HepG2 細(xì)胞增殖；C：SNHG12 通過miR-199a-5p 影響HepG2 細(xì)胞侵襲；D：HepG2 細(xì)胞的侵襲數(shù)目；E：SNHG12 通過miR-199a-5p 影響HepG2 細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin表達(dá)；F：E-cadherin、N-cadherin 蛋白的相對表達(dá)量；G：SNHG12 對通過miR-199a-5p 影響HepG2 細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9 表達(dá)；H：MMP-2、MMP-9 蛋白的相對表達(dá)量；I：熒光顯微鏡觀察HepG2 細(xì)胞形態(tài)Figure 4 SNHG12 regulating the proliferation,invasion and EMT of HepG2 cells through miR-199a-5p A:The expression of miR-199a-5p in overexpressed miR-199a-5p cells detected by qRT-PCR;B:SNHG12 influencing the proliferation of HepG2 cells via miR-199a-5p;C:SNHG12 influencing the invasion of HepG2 cells via miR-199a-5p;D:The invasion number of HepG2 cells;E:SNHG12 influencing the expressions of E-cadherin and N-cadherin in HepG2 cells via miR-199a-5p;F:Relative expression levels of E-cadherin and N-cadherin proteins;G:SNHG12 influencing the expressions of MMP-2 and MMP-9 in HepG2 cells via miR-199a-5p;H:Relative expression levels of MMP-2 and MMP-9 proteins;I:The morphology of HepG2 cells observed by fluorescence microscopy

2.5 miR-199a-5p 和FZD6 之間的靶向關(guān)系

使用生物學(xué)軟件TargetScan預(yù)測miR-199a-5p和FZD6之間的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果見圖5A。當(dāng)質(zhì)粒攜帶FZD63'UTR wt時(shí)，miR-199a-5p的熒光素酶活性下降（P＜0.01）；當(dāng)質(zhì)粒攜帶FZD63'UTR m u t 時(shí)，m i R-199 a-5 p 的熒光素酶活性無變化（P＞0.05）（圖5B）。表明FZD6和miR-199a-5p之間存在靶向關(guān)系。

圖5 miR-199a-5p 和FZD6 之間的靶向關(guān)系 A：TargetScan 預(yù)測miR-199a-5p 和FZD6 之間的結(jié)合位點(diǎn)；B：熒光素酶表達(dá)量的測定Figure 5 Targeting relationship between miR-199a-5p and FZD6 A:TargetScan predicted binding sites between miR-199a-5p and FZD6;B:Determination of luciferase expression level

2.6 下調(diào)FZD6 對HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT 的影響

HepG2細(xì)胞中FZD6的表達(dá)量明顯高于HIBEC細(xì)胞（P＜0.01）（圖6A）。與siRNA NC組比較，F(xiàn)ZD6 siRNA組的FZD6表達(dá)量降低（P＜0.05）；和pcDNA-3.1（+）組比較，pcDNA-FZD6組的FZD6表達(dá)量明顯升高（P＜0.01)（圖6 B）。由圖6C CCK-8結(jié)果可知，F(xiàn)ZD6 siRNA組的細(xì)胞增殖能力低于siRNA NC組（P＜0.05）；pcDNAFZD6組的細(xì)胞增殖能力高于pcDNA-3.1（+）組（P＜0.05）。FZD6 siRNA組細(xì)胞的侵襲數(shù)目低于siRNA NC組（P＜0.05）；pcDNA-FZD6組的細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯高于pcDNA-3.1（+）組（P＜0.01）（圖6D-E）。與siRNA NC組比較，F(xiàn)ZD6 siRNA組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升（P＜0.01），N-cadherin、MMP-2和MMP-9 蛋白蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.01），細(xì)胞EMT形態(tài)學(xué)改變減弱；與pcDNA-3.1（+）組比較，pcDNA-FZD6組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降（P＜0.01），N-cadherin、MMP-2和MMP-9蛋白蛋白表達(dá)量明顯上升（P＜0.01），細(xì)胞出現(xiàn)排列不整齊，緊密連接逐漸變離散，有拉長現(xiàn)象（圖6F-J）。以上結(jié)果表明下調(diào)FZD6能夠抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，過表達(dá)FZD6能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT。

2.7 SNHG12 通過miR-199a-5p 調(diào)控FZD6 的表達(dá)

與siRNA NC組比較，SNHG12 siRNA組的FZD6表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與pcDNA-3.1（+）組比較，pcDNA-SNHG12組的FZD6表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）（圖7A-C），表明SNHG12和FZD6存在正調(diào)控關(guān)系。與siRNA NC組比較，SNHG12siRNA組的m i R-199 a-5 p 表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；與pcDNA-3.1（+）組比較，pcDNA-SNHG12組的miR-199a-5p表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）（圖7D），表明SNHG12和miR-199a-5p存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。與inhibitor NC組比較，miR-199a-5p inhibitor組FZD6表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）；與mimics NC組比較，miR-199a-5pmimics組FZD6表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）（圖7E-G），表明miR-199a-5p和FZD6存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。與siRNA NC+inhibitor NC組比較，SNHG12 siRNA+inhibitor NC組的FZD6表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），siRNA NC+miR-199a-5p inhibitor組FZD6表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），而與siRNA NC+miR-199a-5p inhibitor組比較，SNHG12 siRNA+miR-199a-5p inhibitor組FZD6表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）（圖7H-J）。表明SNHG12能夠通過miR-199a-5p調(diào)控FZD6的表達(dá)。

圖6 下調(diào)FZD6 抑制HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT A：qRT-PCR 檢測FZD6 在HepG2 和HIBEC 細(xì)胞中的表達(dá)量；B：qRT-PCR 檢測干擾及過表達(dá)FZD6 后HepG2 細(xì)胞中FZD6 的表達(dá)量；C：CCK-8 檢測FZD6 對HepG2 細(xì)胞增殖的影響；D：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測FZD6 對HepG2 細(xì)胞侵襲的影響；E：HepG2 細(xì)胞的侵襲數(shù)目；F：Western blot 檢測FZD6 對HepG2 細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin 表達(dá)的影響；G：E-cadherin、N-cadherin 蛋白的相對表達(dá)量；H：Western blot 檢測FZD6 對HepG2 細(xì)胞內(nèi)MMP2、MMP9 表達(dá)的影響；I： MMP2、MMP9 蛋白的相對表達(dá)量；J：熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)Figure 6 Inhibitory effects of down-regulation of FZD6 on proliferation,invasion and EMT of HepG2 cells A:The expression of FZD6 in HepG2 and HIBEC cells detected by qRT-PCR;B:The expression level of FZD6 in HepG2 cells after FZD6 interference detected by qRT-PCR;C:The effect of FZD6 on proliferation of HepG2 cells CCK-8 assay;D:The effect of FZD6 on invasion of HepG2 cells detected by Transwell assay;E:The invasion number of HepG2 cells;F:The effect of FZD6 on the expressions of E-cadherin and N-cadherin in HepG2 cells determined by Western blot;G:Relative expression levels of E-cadherin and N-cadherin proteins;H:The effect of FZD6 on expressions of MMP-2 and MMP-9 in HepG2 cells determined by Western blot;I:Relative expression levels of MMP-2 and MMP-9 proteins;J:The morphology of HepG2 cells observed by fluorescence microscopy

圖7 SNHG12 通過miR-199a-5p 調(diào)控FZD6 的表達(dá) A：qRT-PCR 檢測過表達(dá)及下調(diào)SNHG12 后FZD6 的mRNA 表達(dá)；B：Western blot 檢測過表達(dá)及下調(diào)SNHG12 后FZD6 的蛋白表達(dá)；C：FZD6 的蛋白相對表達(dá)量；D：qRT-PCR 檢測過表達(dá)及下調(diào)SNHG12 后miR-199a-5p 的表達(dá)；E：RT-qPCR 檢測過表達(dá)及下調(diào)miR-199a-5p 后FZD6 的mRNA 表達(dá)；F：Western blot 檢測過表達(dá)及下調(diào)miR-199a-5p 后FZD6 的蛋白表達(dá)；G：FZD6 的蛋白相對表達(dá)量；H：qRT-PCR 檢測SNHG12通過miR-199a-5p調(diào)控FZD6的mRNA表達(dá)；I：Western blot 檢測SNHG12通過miR-199a-5p調(diào)控FZD6的蛋白表達(dá)；J：FZD6 的蛋白相對表達(dá)量Figure 7 SNHG12 regulating the expression of FZD6 through miR-199a-5p A:FZD6 mRNA expression after overexpression or down-regulation of SNHG12 detected by qRT-PCR;B:FZD6 protein expression after overexpression or down-regulation of SNHG12 detected by Western blot;C:The relative expression of FZD6 protein;D:The expression of miR-199a-5p after overexpression or downregulation of SNHG12 detected by qRT-PCR;E:The mRNA expression of FZD6 after overexpression or down-regulation of miR-199a-5p detected by qRT-PCR;F:FZD6 protein expression after overexpression or down-regulation of miR-199a-5p detected by Western blot;G:The relative expression of FZD6 protein;H:The expression of FZD6 regulated by SNHG12 through miR-199a-5p detected by qRT-PCR;I:FZD6 protein expression regulated by SNHG12 through miR-199a-5p detected by Western blot;J:The relative expression of FZD6 protein

3 討論

越來越多的研究表明，lncRNA在多種生理、病理過程以及惡性疾病中失調(diào)[14-15]，且發(fā)現(xiàn)lncRNA在各種癌癥中異常表達(dá)，可作為癌癥的診斷和預(yù)后標(biāo)志物發(fā)揮作用[16-17]。如研究表明LncRNA SNHG15在膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，能通過負(fù)調(diào)控miR-153影響膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長[18]；lncRNA PVT1在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)，通過海綿miR-186促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[19]。最近研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG12與各種癌癥的發(fā)展過程密切相關(guān)。如有文獻(xiàn)[20]報(bào)道lncRNA SNHG12在非小細(xì)胞肺癌中通過海綿miR-181a激活MAPK/Slug通路，從而導(dǎo)致順鉑、紫杉醇、吉非替尼的耐藥。研究表明長lncRNA SNHG12通過上調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞中血管蛋白基因的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[12]。lncRNA SNHG12通過調(diào)節(jié)/β-catenin Wnt信號通路促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。而本研究lncRNA SNHG12在HCC中的臨床意義時(shí)，發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比，SNHG12在HCC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，干擾SNHG12的表達(dá)抑制了HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，而過表達(dá)SNHG12能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT進(jìn)程。以上結(jié)果表明SNHG12能夠作為癌基因在HCC發(fā)展過程中發(fā)揮作用，提示SNHG12可作為HCC的預(yù)后標(biāo)志物。

越來越多的研究[22-24]表明，lncRNA作為競爭內(nèi)源性RNA或miRNA海綿，參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)。本研究通過生物信息學(xué)分析觀察到SNHG12與miR-199a-5p具有靶向關(guān)系，且通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-199a-5p可以與SNHG12結(jié)合。最近研究表明miR-199a-5p能夠在各種癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如miR-199a-5p在HCC中作為Warburg效應(yīng)的抑制因子，和HIF-1α形成一個(gè)正反饋循環(huán)促進(jìn)HCC細(xì)胞的糖酵解[25]；下調(diào)miR-199a-5p通過調(diào)節(jié)MLK3/NF-κB通路有助于膀胱移行細(xì)胞癌的腫瘤發(fā)生[26]；此外沉默miR-199a-5p能夠上調(diào)DDR1和激活EMT相關(guān)信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展[27]，miR-199a-5p在體外能減弱人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲過程[28]。本研究首次研究miR-199a-5p的臨床意義，并探討其在HCC發(fā)展過程中的作用。結(jié)果表明，miR-199a-5p在HCC細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正常細(xì)胞。干擾miR-199a-5p促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，過表達(dá)miR-199a-5 p 則抑制了HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，且SNHG12能夠通過miR-199a-5p調(diào)控HCC細(xì)胞的發(fā)展。此外本研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-5p和FZD6具有靶向關(guān)系，并通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-199a-5p可以與FZD6結(jié)合。

研究表明FZD6是一個(gè)與EMT進(jìn)程和腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)的基因，如文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)直腸癌患者中FZD6高表達(dá)，過表達(dá)FZD6表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)展[29]；miR-21能夠靶向FZD6激活非典型Wnt通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[30]。研究還表明NPTX2與FZD6相互作用，使MYC、cyclin D1、snail和N-cadherin的表達(dá)增加，同時(shí)E-cadherin的表達(dá)減少[31]。研究發(fā)現(xiàn)FZD6在60%～90%的肝細(xì)胞癌組中表達(dá)上調(diào)，在50%癌前病變組織中高表達(dá)，且研究表明敲低FZDs可以抑制癌細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移，表明FZD6可能在HCC發(fā)展中起作用。我們發(fā)現(xiàn)FZD6在HCC細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞，下調(diào)FZD6的表達(dá)抑制了HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT，而過表達(dá)FZD6能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT進(jìn)程。且過表達(dá)SNHG12能夠促進(jìn)FZD6的表達(dá)，下調(diào)SNHG12抑制FZD6的表達(dá)，表明SNHG12和FZD6存在正調(diào)控關(guān)系；而過表達(dá)miR-199a-5p抑制FZD6的表達(dá)，下調(diào)miR-199a-5p促進(jìn)FZD6的表達(dá)，表明miR-199a-5p和FZD6存在負(fù)調(diào)控關(guān)系；另外發(fā)現(xiàn)SNHG12能夠通過miR-199a-5p調(diào)控FZD6的表達(dá)。

綜上所述，上調(diào)lncRNA SNHG12通過miR-199a-5p/FZD6軸促進(jìn)HCC的增殖、侵襲和EMT。本研究為進(jìn)一步了解HCC發(fā)展的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為HCC患者的臨床診斷和治療提供了試驗(yàn)依據(jù)。但是這僅僅只是一方面，有關(guān)lncRNA SNHG12、miR-199a-5p和FZD6在HCC中的作用機(jī)制還需更近一步研究。