黃素單加氧酶3及其代謝產(chǎn)物水平的變化對(duì)高原地區(qū)膽囊膽固醇結(jié)石形成影響的實(shí)驗(yàn)研究

桑海泉，任偉強(qiáng)，陳鵬

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 普通外科，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.西藏自治區(qū)那曲市人民醫(yī)院 普通外科，西藏 那曲852000）

膽囊結(jié)石是常見的消化系統(tǒng)疾病，同時(shí)也是造成膽囊癌的常見誘發(fā)因素，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們飲食習(xí)慣的改變，發(fā)病率呈不斷增加趨勢(shì)[1-3]。據(jù)調(diào)查研究顯示每10年增加約2倍，在我國(guó)平原地區(qū)膽囊結(jié)石發(fā)病率約為3.5%～5.0%，而在西藏等高原地區(qū)的發(fā)病率為平原地區(qū)的數(shù)倍，高達(dá)12.5%，給高原地區(qū)居民帶來嚴(yán)重困擾[4]。從現(xiàn)有報(bào)道來看，膽囊膽固醇結(jié)石（GCS）是主要的發(fā)病類型，主要是由膽汁分泌和消化道系統(tǒng)功能紊亂、環(huán)境及基因等多因素共同導(dǎo)致，其中脂質(zhì)代謝紊亂被認(rèn)為是膽固醇結(jié)石形成的始發(fā)因素，其高發(fā)病率與該地區(qū)獨(dú)特的自然環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)和飲食習(xí)慣有密切的關(guān)系[5-6]。然而，目前其更全面的發(fā)病機(jī)制并未闡明清楚。

隨著對(duì)GCS發(fā)病機(jī)理的逐漸認(rèn)識(shí)，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)失調(diào)與膽固醇結(jié)石形成過程存在密切聯(lián)系。目前已有充足的研究表明腸道菌群失調(diào)參與膽囊結(jié)石等膽系疾病[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可將膽堿類物質(zhì)代謝為三甲胺（TMA），經(jīng)腸道吸收入血進(jìn)入肝臟后，TMA在黃素單加氧酶（FMO3）的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)槿装?N-氧化物（TMAO），腸道微生物主要通過調(diào)控FMO3/TMAO通路干預(yù)脂質(zhì)代謝，從而引起膽汁酸代謝紊亂[10-11]。但上述FMO3和TMAO在高原地區(qū)的GCS形成中的作用尚未進(jìn)行研究。本研究通過檢測(cè)小鼠肝FMO3 mRNA表達(dá)和血漿TMAO并分析其意義，以期為有效診治高原地區(qū)GCS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與處理

將成年雄性C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)在西藏那曲（海拔4500 m），適應(yīng)性飼喂1周后，隨機(jī)均分為2組（膽囊結(jié)石-模型組、對(duì)照組）。飼養(yǎng)期間小鼠不限飲食、攝水。針對(duì)模型組喂養(yǎng)高脂飲食（基礎(chǔ)日糧+15%脂肪+1%膽固醇+0.5%膽酸）以誘發(fā)膽囊結(jié)石，對(duì)照組采用正常飼料進(jìn)行飼喂。連續(xù)8周后處死小鼠，以膽囊內(nèi)出現(xiàn)膽固醇結(jié)石為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，共20只，另匹配對(duì)照組小鼠20只。取血液、膽汁、結(jié)石及肝臟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1）。

圖1 模型動(dòng)物取材Figure 1 Sample harvest from the animal model

1.2 研究方法

1.2.1 膽囊結(jié)石化學(xué)成分分析生理鹽水反復(fù)沖洗膽囊結(jié)石至干凈，晾干研磨后稱取結(jié)石1 mg 和溴化鉀粉末100 mg，充分混合均勻后采用紅外光譜分析法檢測(cè)膽囊結(jié)石成分以確定為膽固醇結(jié)石。

1.2.2 脂質(zhì)分析使用BEKMAN 公司的全自動(dòng)生化分析儀采用酶法檢測(cè)血清和膽汁總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）等指標(biāo)，計(jì)算膽固醇飽和指數(shù)（cholesterol saturation index，CSI）[12]，所有試劑和耗材均來自BEKMAN 公司。

1.2.3 高效液相色譜法檢測(cè)血漿TMAO測(cè)時(shí)取50 μL 血漿，加入200 μL 內(nèi)標(biāo)物（5 μmol/L），渦旋1 min，15000 r/min、4 ℃離心25 min，取上清液2 μL 進(jìn)行檢測(cè)。按照高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)血漿TMAO。流動(dòng)相為A:B=80%:20%，流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-水液，流動(dòng)相B 為甲醇；流速：0.5 mL/min；氣體：氮?dú)?。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離（ESI）；掃描方式為正離子模式，計(jì)算峰面積。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè)運(yùn)用qRT-PCR 檢測(cè)肝臟組織FMO3 mRNA 表達(dá)水平。提取肝臟組織總RNA，分別采用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 濃度、純度和完整性。采用SYBR Green 法進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)FMO3引物，引物序列見表1。ExicyclerTM 96 熒光定量?jī)x進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；Spearman相關(guān)系數(shù)分析觀測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性；多因素Logistic回歸分析危險(xiǎn)因素。以P＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠血脂和膽汁生化指標(biāo)比較

與對(duì)照組相比，模型組血清TC、TG和LDL升高，HDL降低，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。同時(shí)，模型組膽汁TC、膽汁酸、磷脂和CSI明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2）（表2）。

圖2 兩組小鼠血脂指標(biāo)比較Figure 2 Comparison of blood lipids between two groups of mice

表2 兩組小鼠膽汁成分比較Table 2 Comparison of bile components between two groups of mice

2.2 兩組小鼠血漿TMAO 比較

HPLC檢測(cè)顯示，模型組TMAO水平為（12.36±1.06）μmol/L，對(duì)照組為（6.51±0.59）μmol/L，模型組TMAO水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.3 兩組小鼠肝臟FMO3 mRNA 表達(dá)

對(duì)照組FMO3 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.08±0.09，模型組FMO mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.19±0.12，模型組FMO3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

2.4 FMO3 mRNA、TMAO 與血脂和膽汁成分相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，F(xiàn)MO3 mRNA、TMAO與血漿TC、TG、LDL、膽汁TC、膽汁酸、磷脂和CSI均呈明顯正相關(guān)（均P＜0.05），與HDL呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表3）。

P＜0.0516141210 TMAO（μmol/L）86420漿血對(duì)照組模型組

圖3 兩組小鼠血漿TMAO 比較Figure 3 Comparison of plasma TMAO levels between two groups of mice

圖4 兩組小鼠肝臟FMO3 mRNA 表達(dá)比較Figure 4 Comparison of FMO3 mRNA expression levels in the liver between the two groups of mice

表3 FMO3 mRNA、TMAO 與血脂、膽汁成分相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of FMO3 mRNA and TMAO with blood lipid and bile composition

2.5 多因素Logistic 回歸分析危險(xiǎn)因素

進(jìn)一步分析FMO3 mRNA和TMAO是否為GCS的危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示，F(xiàn)MO3 mRNA和TMAO是影響GCS的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）（表4）。

表4 多因素logistics 回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis

3 討論

膽囊結(jié)石是較為常見的外科消化道疾病，且主要為GCS[13-14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)西藏地區(qū)膽結(jié)石的發(fā)病率為23%，且女性高于男性，約為男性兩倍[15-16]。高原地區(qū)膽囊結(jié)石的發(fā)病率明顯高于平原地區(qū)，與高原地區(qū)特殊的自然環(huán)境、飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)存在密切聯(lián)系[17]。目前已發(fā)現(xiàn)GCS形成的最基礎(chǔ)的病理機(jī)制為膽固醇及膽汁酸代謝及分泌異常[18]。肝臟合成的膽汁酸經(jīng)膽道排入腸道，其代謝過程受腸道菌群的調(diào)節(jié)，而菌群的分布和結(jié)構(gòu)又受膽汁酸影響[19-20]。因此，探討腸道微生態(tài)與GCS的關(guān)系有利于深入研究發(fā)病機(jī)制。

腸道菌群在生理?xiàng)l件下是腸道微環(huán)境的重要組成部分，在機(jī)體物質(zhì)與能量的代謝、免疫功能完善及穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。腸道菌群可通過其產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)和膽汁酸代謝[21]。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可將膽堿類物質(zhì)代謝為TMA，經(jīng)腸道吸收入血后進(jìn)入肝臟氧化成TMAO參與脂質(zhì)代謝[22]。膳食干預(yù)同樣會(huì)影響TMA生成及其氧化生成的TMAO，提示體內(nèi)TMAO水平可以通過膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整來調(diào)節(jié)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組血清TC、TG和LDL升高，HDL降低（均P＜0.05），同時(shí)模型組膽汁TC、膽汁酸、磷脂和CSI明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05）。通過HPLC檢測(cè)血漿TAMO發(fā)現(xiàn)模型組血漿TMAO水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且模型組血漿TAMO水平比平原地區(qū)相似小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果高近2倍[24]。這些結(jié)果說明高原地區(qū)的高脂飲食進(jìn)一步增加體內(nèi)TMAO水平從而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常。

FMO3是黃素單加氧酶家族成員，能催化許多親核含硫和含氮異生物質(zhì)的氧化，其中FMO3是膽固醇代謝的調(diào)節(jié)劑[25]。正如在Miao等[26]的研究中所見，F(xiàn)MO3敲除顯著降低了LDLr-/-小鼠的極低密度脂蛋白（VLDL）和LDL膽固醇水平，進(jìn)而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)揮了保護(hù)作用。FMO3能有效地催化腸道微生物來源的TMA形成TMAO，而TMAO在調(diào)節(jié)脂代謝方面具有重要作用，能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展[27-29]。不僅如此，最新的研究證明，F(xiàn)MO3及其代謝產(chǎn)物TMAO共同參與了GCS的形成（平原地區(qū)）[24]。脂質(zhì)代謝紊亂是GCS形成過程中肝細(xì)胞所出現(xiàn)的重要表型變化，同時(shí)腸道微生物穩(wěn)態(tài)是維持正常脂質(zhì)代謝的重要基礎(chǔ)，但FMO3和TMAO在高原GCS中的表達(dá)并未闡明清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組血漿TMAO和肝臟FMO3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），提示TMAO可作為膽固醇代謝和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的工具，F(xiàn)MO3高表達(dá)可延緩膽囊中膽汁分泌，降低膽固醇的腸道吸收，抑制膽汁酸的代謝，長(zhǎng)時(shí)間的膽汁酸減少則可引發(fā)膽固醇過飽和，從而出現(xiàn)了膽結(jié)石[30]。為進(jìn)一步明確兩者的臨床意義，分析兩者與血脂和膽汁生化指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示血漿TAMO與肝臟FMO3與血漿TC、TG、LDL、膽汁TC、膽汁酸、磷脂和CSI均呈明顯正相關(guān)（P＜0.05），而與HDL呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明TAMO與FMO3與脂質(zhì)代謝紊亂存在明顯關(guān)系，腸道微生態(tài)互為因果，互相促進(jìn)疾病進(jìn)展。最后通過多因素Logistic回歸分析顯示，TAMO與FMO3升高均為高原地區(qū)GCS小鼠的危險(xiǎn)因素，表明TAMO與FMO3升高可能參與高原地區(qū)GCS的發(fā)病過程，提示及早檢測(cè)兩種水平可有助于及時(shí)為診治提供依據(jù)。

綜上所述，F(xiàn)MO3和TMAO在高原地區(qū)GCS小鼠呈高水平，與GCS的形成密切相關(guān)。未來的后續(xù)研究將通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究高原地區(qū)缺氧對(duì)FMO3的影響，以期為GCS提供新的治療干預(yù)點(diǎn)。