聚(對氧環(huán)己酮-co-l-苯丙氨酸氮芥)納米顆粒用于乳腺癌移植瘤治療

蒲宇，馮成敏，王冰，董軍

(1.醫(yī)學(xué)影像四川省重點實驗室，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院；2.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系耳鼻咽喉科；3.醫(yī)學(xué)影像四川省重點實驗室，川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室；4.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，四川 南充 637000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于肺癌[1]。隨著技術(shù)進步及對乳腺癌認知的不斷深入，越來越多的治療手段被應(yīng)用于臨床，如輔助化療、免疫治療、靶向治療等[2]。l-苯丙氨酸氮芥，又名l-溶肉瘤素，為烷化劑，是目前仍應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物；主要作用于DNA，適用于治療多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌[3-4]。其鹽酸鹽可靜脈注射，但該藥物毒性較大，全身給藥容易造成多種毒副作用，且其分子在水相環(huán)境中極不穩(wěn)定容易水解，導(dǎo)致藥物血液半衰期短，生利用率低[5-6]。因此，為了降低l-苯丙氨酸氮芥的毒副作用，提高其在水相環(huán)境中的穩(wěn)定性和生物利用率，本文將l-苯丙氨酸氮芥結(jié)合于疏水大分子鏈上制備了適用于局部注射或局部植入給藥的l-苯丙氨酸氮芥大分子前藥納米顆粒，并探究了其對乳腺癌移植瘤的治療作用。該納米顆粒通過大分子鏈的折疊、纏繞可有效減少l-苯丙氨酸氮芥與水相環(huán)境的接觸從而減少其自發(fā)水解作用。且隨著大分子的降解，l-苯丙氨酸氮芥被釋放至作用部位，從而提高藥物的生物利用率。另外，通過局部植入納米顆?？杀３炙幬镌诓≡畈课坏木植扛邼舛?，從而降低藥物的全身性毒副作用。

1 材料與方法

1.1 試劑、細胞及動物

L-苯丙氨酸氮芥(l-melphalan，成都艾科試劑)，對氧環(huán)己酮(PDO，北京伊諾凱試劑)，三光氣(北京伊諾凱試劑)，尼羅紅、辛酸亞錫(Sigma-Aldrich，美國默克)，戊巴比妥鈉(川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)，DMEM、胎牛血清、雙抗(Life Technologies，美國)。

人乳腺癌細胞株MCF-7購于中國科學(xué)院細胞庫/干細胞庫。

體重為18～22 g SPF級裸鼠10只來源于川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心 【SCXK(川)2013-18】，雄性，操作在川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心進行【SYXK(川)2013-076】，實驗過程對動物的處置符合相關(guān)動物倫理學(xué)要求。

1.2 實驗方法

聚(對氧環(huán)己酮-co-l-苯丙氨酸氮芥)(PDCM)大分子前藥、PDCM納米顆粒(PDCM NP)、聚對氧環(huán)己酮(PPDO)納米顆粒、尼羅紅標記PDCM靜電噴霧納米顆粒均按照本課題組先前報道的方法制備[7]。納米顆粒信息如表1所示。

表1 PDCM大分子前藥信息及其納米顆粒平均粒徑

MCF-7細胞接種于96孔板(2.5 ×103/孔)加入正常培養(yǎng)基貼壁12 h后，吸出原有培養(yǎng)基，分別加入正常培養(yǎng)基及含PDCM-1 NP、PDCM-2 NP、PDCM-3 NP和PPDO NP的培養(yǎng)基(納米顆粒經(jīng)環(huán)氧乙烷事先滅菌，濃度為200 mg/L，培養(yǎng)基含89% DMED，10%胎牛血清，1%雙抗)，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)1、3、5、7 d后加入CCK-8 培養(yǎng)4 h后將孔板置于酶標儀，450 nm檢測各孔吸光度(6復(fù)孔/組/時間點)。MCF-7細胞接種于96孔板(2.5 ×103/孔)加入正常培養(yǎng)基貼壁12 h后，吸出原有培養(yǎng)基，加入含200 mg/L尼羅紅標記PDCM-2 NP的培養(yǎng)基，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h后，DAPI染細胞核，置于倒置熒光顯微鏡下觀察PDCM NP被進入細胞情況。

將0.1 mL含107個MCF-7細胞的懸液注射于裸鼠右側(cè)腋窩部位皮下，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。注射細胞懸液后均予以單籠飼養(yǎng)(20～25 ℃保暖)，腫瘤體積達80～100 mm3后進行瘤內(nèi)給藥處理，記錄給藥前腫瘤體積并記為第0天。10只荷瘤裸鼠隨機均分為Control及PDCM-2 NP 兩組，Control組裸鼠瘤內(nèi)注射0.1 mL生理鹽水，PDCM-2 NP組裸鼠瘤內(nèi)注射0.1 mL含1 mg PDCM-2 NP的懸濁液。給藥第2、4、6、8、10、12、14、16、18及20天測量瘤體體積并記錄，并于第20天，采用頸椎脫臼法處死實驗裸鼠。同時，取下腫瘤組織，用4%中性甲醛溶液固定。對組織進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋處理后，切片。蘇木精-伊紅染色后于顯微鏡下腫瘤組織壞死及浸潤情況，TUNEL染色后觀察組織細胞凋亡狀況并用Image pro plus 軟件統(tǒng)計切片IOD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

PPDO NP及PDCM NP對MCF-7細胞增殖的影響如圖1所示，不含l-苯丙氨酸氮芥的PPDO NP與MCF-7細胞共培養(yǎng)1 d后表現(xiàn)出對細胞增殖的抑制作用，第3天及以后對細胞增殖無明顯抑制作用。PDCM NP在整個培養(yǎng)過程中均表現(xiàn)出對細胞增殖的抑制作用，且抑制效率與PDCM中所含的l-苯丙氨酸氮芥量成正比。PDCM NP對細胞增殖抑制的最高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)第3天，第3天后PDCM NP對細胞增殖的抑制作用有所減弱。

紅色熒光標記的PDCM-2 NP與MCF-7細胞共培養(yǎng)24 h后，用DAPI對細胞核著色，后用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖2所示。納米顆粒紅色熒光區(qū)域與細胞核藍色熒光區(qū)域重疊程度極高，表明PDCM NP可被MCF-7細胞吞入細胞內(nèi)部，這有助于l-苯丙氨酸氮芥在胞內(nèi)的釋放。

圖3為對照組及單次瘤內(nèi)注射PDCM-2 NP后MCF-7裸鼠移植瘤體積增長曲線，對照組裸鼠移植瘤體積在20 d內(nèi)持續(xù)增長，至第20天增長到處理前體積的2倍。注射瘤內(nèi)PDCM-2 NP的裸鼠移植瘤在20 d內(nèi)體積無明顯變化，表明PDCM-2 NP可有效抑制MCF-7細胞裸鼠移植瘤的生長。腫瘤組織病理學(xué)相關(guān)檢查結(jié)果如圖4所示。由圖4A可見，與對照組相比，PDCM-2 NP處理的腫瘤可觀察到較多的壞死組織。由圖4B及圖4C可得，與對照組相比，PDCM-2 NP處理的裸鼠腫瘤組織TUNEL著色范圍更廣，深度更深，單位面積IOD值更高，這表明PDCM-2 NP處理的腫瘤組織中有更多凋亡的腫瘤細胞?？梢奝DCM-2 NP處理可導(dǎo)致腫瘤組織壞死、促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤增殖。

MCF-7裸鼠移植瘤生長至80～100 mm3；瘤內(nèi)注射生理鹽水(Control)或PDCM-2 NP (PDCM-2)后腫瘤體積增長倍數(shù)=測得腫瘤體積(V)/處理前腫瘤體積(V0)(對照組腫瘤體積增長倍數(shù)與PDCM-2 NP處理組瘤體增長倍數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05)。

3 討論

PDCM NP可在體外抑制人乳腺癌細胞株MCF-7的增殖。與MCF-7細胞共培養(yǎng)的第1天，PPDO也表現(xiàn)出對MCF-7細胞增殖的抑制作用，這是由于PPDO NP的加入影響了MCF-7細胞的貼壁，而培養(yǎng)后期細胞貼壁完成后這種抑制作用消失，表明PPDO NP本身不具有抑制MCF-7細胞增殖的作用。PDCM NP與MCF-7細胞共培養(yǎng)1 d對細胞增殖僅表現(xiàn)出輕微的抑制作用且抑制作用與PDCM所含l-苯丙氨酸氮芥的量成正比。抑制作用不顯著可能是因為共培養(yǎng)時間過短，PDCM未能及時降解以釋放出l-苯丙氨酸氮芥。但PDCM NP對細胞增殖的抑制作用與PPDO NP相比并無明顯差別，這可能是因為PDCM分子鏈中含有的酰胺鍵更有利于細胞黏附、貼壁。PDCM NP對MCF-7細胞增殖的抑制作用在與細胞共培養(yǎng)的第三天達到峰值，之后逐漸衰減，這可能是由于細胞貼壁完成后進入快速增殖階段時由PDCM NP降解而釋放的l-苯丙氨酸氮芥濃度過低。從PDCM NP抑制MCF-7細胞增殖的情況來看，在培養(yǎng)第3天抑制率可達到50%，由此推斷除了PDCM NP胞外降解釋放l-苯丙氨酸氮芥以抑制MCF-7細胞增殖外，可能還存在其他途徑導(dǎo)致l-苯丙氨酸氮芥被快速釋放并被有效應(yīng)用。為此，本研究還制備了熒光標記的PDCM-2 NP，與DAPI染色的細胞核共定位來判斷PDCM是否可被癌細胞吞噬至胞內(nèi)從而實現(xiàn)胞內(nèi)釋放。結(jié)果顯示，PDCM NP確實可被癌細胞吞噬至胞內(nèi)，并且極可能被溶酶體捕獲。這主要是因為含有大量酯鍵和肽鍵的PDCM使溶酶體內(nèi)大量的酶加速降解，從而快速在胞內(nèi)釋放l-苯丙氨酸氮芥以抑制細胞的增殖。

此外，PDCM NP體內(nèi)抑制腫瘤細胞增殖的作用也在MCF-7裸鼠移植瘤模型中得以驗證。單次瘤內(nèi)注射PDCM NP后腫瘤的增長受到明顯抑制，腫瘤體積在處理后的20 d內(nèi)幾乎未發(fā)生明顯變化，這說明PDCM NP可在瘤內(nèi)長時間抑制腫瘤的生長。這說明l-苯丙氨酸氮芥的結(jié)構(gòu)得到了大分子前藥分子鏈的有效保護，且l-苯丙氨酸氮芥只能隨著PDCM NP在細胞外的水解或被癌細胞吞噬且酶解后才被釋放，即PDCM NP是l-苯丙氨酸氮芥的緩釋劑型。再者，移植瘤組織相關(guān)病理學(xué)檢測顯示PDCM NP對腫瘤增殖的抑制作用是通過促進腫瘤組織壞死、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而實現(xiàn)的。

綜上，PDCM NP可有效抑制MCF-7細胞體外增殖，且抑制作用的強弱與PDCM所含l-苯丙氨酸氮芥的量成正比。PDCM NP可被MCF-7吞噬至胞內(nèi)從而實現(xiàn)l-苯丙氨酸氮芥的胞內(nèi)釋放。作為l-苯丙氨酸氮芥的緩釋劑型，PDCM NP單次瘤內(nèi)注射可較長期地抑制MCF-7細胞裸鼠移植瘤的增殖，并且這個抑制作用是通過促進腫瘤組織壞死及細胞凋亡而實現(xiàn)的。