常壓冷等離子體對(duì)食源性腐敗菌失活作用機(jī)制研究

陳玥，李書紅，孟琬星，楊同亮，陳野

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457）

近年來，生鮮食品具有新鮮、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)受到消費(fèi)者青睞，消費(fèi)者對(duì)其需求量也不斷增加。然而，由于其水分含量高、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，極易被食源性腐敗微生物污染[1]。消費(fèi)者購買、食用被污染的生鮮食品，易患相關(guān)食源性疾病，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。因此，生鮮食品在加工過程中需要進(jìn)行殺菌處理，以保證食品安全。

殺菌是食品加工業(yè)中的重要組成部分，其主要是通過加熱、氣調(diào)包裝、紫外、輻照、添加化學(xué)防腐劑等物理或化學(xué)手段引起腐敗微生物失活來完成殺菌過程[2]。然而，在確保食品安全的同時(shí)應(yīng)盡量減少對(duì)處理食品感官品質(zhì)及營養(yǎng)價(jià)值的破壞。因此，越來越多的研究報(bào)道集中在高壓、脈沖電場、超聲波以及冷等離子體等非熱加工技術(shù)[3]。20 世紀(jì)90 年代，人們首次將等離子體技術(shù)應(yīng)用于微生物的滅活試驗(yàn)中，隨后一直在不斷探索，以尋求一種適用于熱敏感材料的高效殺菌技術(shù)[4-6]。

目前，關(guān)于冷等離子體的殺菌研究越來越多，它是通過對(duì)氣體放電產(chǎn)生反應(yīng)活性物質(zhì)、帶電粒子以及紫外光等具有殺菌作用的物質(zhì)[7-8]，導(dǎo)致微生物的失活。冷等離子體對(duì)包括細(xì)菌、真菌、病毒、細(xì)菌孢子以及生物膜在內(nèi)的多種微生物均具有良好的殺滅作用[9-12]。然而，關(guān)于等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌的作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。本研究分別以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，將常壓冷等離子體技術(shù)應(yīng)用于不同類型食源性腐敗微生物中，研究常壓冷等離子體（atmospheric cold plasma，ACP）對(duì)不同食源性腐敗微生物細(xì)胞外膜及細(xì)胞內(nèi)含物的作用，探究常壓冷等離子體的殺菌機(jī)制，為開發(fā)常壓冷等離子體在不同類型食品殺菌中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（ATC51813）、金黃色葡萄球菌（CVCC3053）：天津科技大學(xué)菌種保藏中心。

肉湯（luria-bertani，LB）培養(yǎng)基（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胰酪大豆胨瓊脂（tryptose soya agar，TSA）培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基（生物試劑）：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、蛋白定量測試盒：南京建成生物工程研究所；細(xì)菌DNA 提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；戊二醛、氯化鈉、無水乙醇（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；磷酸鹽緩沖溶液（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CTP-2000K 低溫等離子表面處理儀：南京蘇曼等離子體科技有限公司；JSM-IT300LV 掃描電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

挑取適量大腸桿菌接種于50 mL 無菌LB 液體培養(yǎng)基中，于（37±1）℃下160 r/min 培養(yǎng)6 h 得到108CFU/mL大腸桿菌菌懸液；挑取適量金黃色葡萄球菌接種于50 mL 無菌7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中，于（37±1）℃下160 r/min 培養(yǎng)10 h 得到108CFU/mL 大腸桿菌菌懸液。

1.3.2 冷等離子體處理

利用介質(zhì)阻擋放電（dielectricbarrierdischarge，DBD）等離子體處理已制備好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌懸液。分別吸取0.1 mL 大腸桿菌及金黃色葡萄球菌菌懸液于無菌載玻片上，將帶有菌懸液的載玻片置于等離子體處理臺(tái)上，按照表1 所示試驗(yàn)條件進(jìn)行處理。

表1 等離子體處理?xiàng)l件Table 1 Plasma treatment conditions

1.3.3 菌落計(jì)數(shù)

等離子體處理對(duì)不同類型腐敗菌的菌落數(shù)根據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[13]進(jìn)行測定，并稍作修改。用1 mL 0.85%無菌生理鹽水將載玻片上菌懸液洗滌至9 mL 0.85%無菌生理鹽水中，依次進(jìn)行梯度稀釋、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。

1.3.4 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）

分別吸取5 mL 已制備得到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液于無菌等離子體處理槽內(nèi)70 W 下處理2 min，回收至無菌離心管內(nèi)，于4 ℃下冷凍離心，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min，離心10 min。棄去上層清液，用0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液將沉淀菌體重新懸浮，重復(fù)離心步驟。棄去清液，向底部沉淀菌體中加入2.5%戊二醛固定液，于4 ℃下固定2 h。離心棄去固定液，再向沉淀中加入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）對(duì)菌體進(jìn)行漂洗，反復(fù)這一步驟2 次，每次10 min ～15 min，再使用無菌雙蒸水重復(fù)漂洗步驟2 次。棄去漂洗液，向沉淀菌體中依次加入30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液對(duì)菌體進(jìn)行梯度脫水，每次10 min～15 min，最后用100%乙醇脫水，此步驟重復(fù)2 次，每次10 min ～15 min。棄去上層乙醇溶液，將試管放置于無菌的干燥室內(nèi)，自然干燥。將得到的菌體樣品貼于樣品臺(tái)上，進(jìn)行噴金處理，通過SEM 觀察不同菌體表面形態(tài)變化。

1.3.5 菌體蛋白泄露量

吸取已制備的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液置于無菌離心管內(nèi)，5 000 r/min 離心5 min，用無菌磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次，將培養(yǎng)基洗去，用無菌磷酸鹽緩沖溶液重懸，置于等離子體處理槽內(nèi)進(jìn)行殺菌處理，備用。吸取1 mL 菌液置于無菌離心管內(nèi)，5 000 r/min 離心5 min，吸取上清液通過蛋白質(zhì)定量試劑盒測定上清液中菌體蛋白的含量。

1.3.6 丙二醛（MDA）生成量

吸取已制備的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液置于無菌離心管內(nèi)，5 000 r/min 離心5 min，用無菌磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次，將培養(yǎng)基洗去，用無菌磷酸鹽緩沖溶液重懸，置于等離子體處理槽內(nèi)進(jìn)行殺菌處理，備用。吸取1 mL 菌液置于無菌離心管內(nèi)，5 000 r/min離心5 min，吸取上清液通過丙二醛（MDA）測試盒測定MDA 的生成量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 9.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，數(shù)據(jù)平均值差異性分析采用SPSS 22.0（p＜0.05）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響

2.1.1 處理時(shí)間對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響

處理時(shí)間對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響見圖1。

圖1 處理時(shí)間對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響Fig.1 Effect of ACP treatment time on colony number of food-borne spoilage microorganisms

如圖1 所示，隨著常壓冷等離子體處理時(shí)間的增加，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落數(shù)減少對(duì)數(shù)值均呈現(xiàn)增加趨勢。這表明殺菌效果隨等離子體處理時(shí)間的延長而增強(qiáng)。馬良軍等[14]也得到了類似的結(jié)論，處理時(shí)間的增加能顯著增強(qiáng)等離子體的殺菌效果。不僅如此，在處理時(shí)間較短時(shí)（＜10 s）大腸桿菌菌落數(shù)減少的對(duì)數(shù)值大于金黃色葡萄球菌菌落數(shù)減少的對(duì)數(shù)值，表明在較短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的等離子體中的活性物質(zhì)對(duì)大腸桿菌作用較強(qiáng)。

2.1.2 電源功率對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響

電源功率對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響見圖2。

圖2 電源功率對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響Fig.2 Effect of ACP power on colony number of food-borne spoilage microorganisms

如圖2 所示，隨著常壓冷等離子體電源功率的增大，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落數(shù)減少對(duì)數(shù)值均呈現(xiàn)增加趨勢。這表明，殺菌效果隨等離子體電源功率的增大而增強(qiáng)。不僅如此，大腸桿菌菌落數(shù)減少的對(duì)數(shù)值小于金黃色葡萄球菌菌落數(shù)減少的對(duì)數(shù)值，表明電源功率的增加激發(fā)得到的等離子體中存在不同活性物質(zhì)，且對(duì)不同類型微生物的作用效果不同。此外，當(dāng)氧氣濃度達(dá)到一定時(shí)，可激發(fā)得到的殺菌活性物質(zhì)含量達(dá)到飽和[14]，產(chǎn)生的氧化活性物質(zhì)含量受限。

2.1.3 電極間距對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響

電極間距對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響見圖3。

如圖3 所示，隨著常壓冷等離子體電極間距的減小，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落數(shù)減少對(duì)數(shù)值均呈現(xiàn)增加趨勢。這表明，殺菌效果隨等離子體電極間距的減小而增強(qiáng)。不僅如此，大腸桿菌菌落數(shù)減少的對(duì)數(shù)值大于金黃色葡萄球菌菌落數(shù)減少的對(duì)數(shù)值，表明大腸桿菌對(duì)常壓冷等離子體電極間距的變化更加敏感。

圖3 電極間距對(duì)不同食源性腐敗菌菌落數(shù)的影響Fig.3 Effect of ACP electrode spacing on colony number of food-borne spoilage microorganisms

2.2 等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌形態(tài)的影響

常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌形態(tài)的影響見圖4。

圖4 常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌形態(tài)的影響Fig.4 Effect of ACP on morphology of food-borne spoilage microorganisms

如圖4 所示，與未處理的大腸桿菌相比，等離子體處理后的大腸桿菌表面出現(xiàn)干癟、褶皺等現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)了菌體細(xì)胞破碎等現(xiàn)象。Laroussi 等[15-16]也得到了類似的結(jié)論，研究報(bào)道了革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞外膜被等離子體短時(shí)間處理后發(fā)生破裂等現(xiàn)象，隨后菌體內(nèi)含物外露。而等離子體處理的金黃色葡萄球菌與未處理組相比并未出現(xiàn)前者菌體破損的現(xiàn)象，僅僅是表現(xiàn)為菌體表面變得粗糙，出現(xiàn)不同程度的褶皺、干癟等現(xiàn)象，以及輕微的粘連現(xiàn)象。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性細(xì)菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性細(xì)菌。一般情況下，革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞外膜較革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞外膜更厚，導(dǎo)致其具有更大的張力及硬度[17]。Lunov 等[18]也得到了類似的結(jié)論，革蘭氏陰細(xì)菌比革蘭氏陽性細(xì)菌更容易受到等離子體對(duì)細(xì)胞膜的破壞。Vadillo-Rodríguez 等[19]也認(rèn)可革蘭氏陰性菌在生理結(jié)構(gòu)及功能上比革蘭氏陽性菌弱的假設(shè)。常壓冷等離子體對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的外膜均具有損傷作用，這可能是等離子體引起的脂肪酸過氧化物的形成[16]以及等離子體中的電荷在細(xì)胞外膜表面積累造成的菌體膜脂被破壞[20]。表面電荷的積累會(huì)使細(xì)胞膜表面張力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于產(chǎn)生的靜電力，從而誘發(fā)了微生物細(xì)胞膜被破壞[21]。

2.3 常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌菌體蛋白質(zhì)泄露量的影響

常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌菌體蛋白質(zhì)泄露量的影響見圖5。

圖5 常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌菌體蛋白質(zhì)泄露量的影響Fig.5 Effect of ACP on protein leakage quantity of food-borne spoilage microorganisms

如圖5 所示，與未處理的大腸桿菌相比，等離子體處理后的大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)泄露量出現(xiàn)增加。Yusupov 等[22]也得到了類似的結(jié)果，研究報(bào)道了等離子體中含有大量的活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS），主要包括·OH、O、O3和H2O2等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)上的重要化學(xué)鍵（即肽聚糖與肽聚糖之間的C-O 鍵、C-N 鍵或者C-C 鍵），導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁被破壞，內(nèi)含物泄露出來。當(dāng)微生物的細(xì)胞外膜遭到臭氧、過氧化氫、羥基自由基等氧化作用物的破壞，進(jìn)而失去自身防御機(jī)制而失活[23]。強(qiáng)氧化活性物不僅破壞微生物的外部保護(hù)結(jié)構(gòu)，改變其細(xì)胞外膜的通透性，還會(huì)破壞微生物內(nèi)外系統(tǒng)的平衡，引起微生物中的酶類、蛋白質(zhì)以及核酸等內(nèi)含物的變化，導(dǎo)致微生物失活[24-25]。不僅如此，等離子體處理金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)泄露量也得到了類似的結(jié)果，但其泄露量低于大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)的泄露量。這可能是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性細(xì)菌，其細(xì)胞外膜較革蘭氏陰性細(xì)菌更厚，經(jīng)等離子體處理仍然能保持其外膜的相對(duì)完整性，并未出現(xiàn)菌體整個(gè)破裂的現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的泄露量低于大腸桿菌。此外，蛋白質(zhì)、核酸、脂類、碳水化合物等對(duì)活性氧等強(qiáng)氧化性物質(zhì)較為敏感[26]，極易被氧化變性。在等離子體處理時(shí)間增加的過程中，出現(xiàn)蛋白質(zhì)泄露量的減少可能是因?yàn)榈蜏氐入x子體中含有大量活性氧，這些活性物質(zhì)極易造成蛋白質(zhì)的氧化損傷。Montie 等[16]也提出，等離子體對(duì)微生物的致死機(jī)制是由于氨基酸對(duì)氧化作用極其敏感，當(dāng)大量氧化性物質(zhì)其接觸后會(huì)引起蛋白質(zhì)被氧化而發(fā)生變性。另外，細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸的磷脂雙分子層也極易被氧化，導(dǎo)致多肽鏈斷裂，進(jìn)而引起氨基酸側(cè)鏈被氧化[27]。

2.4 常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌丙二醛生成量的影響

常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌丙二醛生成量的影響見圖6。

圖6 常壓冷等離子體對(duì)不同食源性腐敗菌MDA 生成量的影響Fig.6 Effect of ACP on MDA generation of food-borne spoilage microorganisms

如圖6 所示，隨著等離子處理時(shí)間的增加，大腸桿菌的丙二醛生成量呈現(xiàn)增加的趨勢，這表明隨著等離子體處理引起大腸桿菌細(xì)胞外膜被氧化生成脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是由于不飽和脂肪酸受到等離子體中產(chǎn)生的羥基自由基的攻擊造成的[16]，在等離子體氧化細(xì)胞膜的這一過程中，氧自由基作用于細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸產(chǎn)生丙二醛，導(dǎo)致丙二醛含量增加。不僅如此，丙二醛的產(chǎn)生還可引起大腸桿菌細(xì)胞膜的整體結(jié)構(gòu)被破壞以及功能特性喪失，進(jìn)而引起細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量的減少，細(xì)胞膜電勢發(fā)生變化，最終導(dǎo)致其細(xì)胞膜完全喪失流動(dòng)性。而隨著處理時(shí)間的增加，金黃色葡萄球菌的丙二醛生成量呈現(xiàn)波動(dòng)的趨勢。這可能是因?yàn)樵诘入x子體中存在大量的電子和離子以及自由基，丙二醛的產(chǎn)生是由自由基引起的[28]。金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較為特殊，抑制了自由基的氧化作用，放電區(qū)域內(nèi)電子及離子通過物理撞擊作用導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，而自由基則主要通過化學(xué)刻蝕作用導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂，在等離子體處理過程中自由基及帶電粒子交替破壞細(xì)胞外膜，而且SEM 觀察結(jié)果中顯示金黃黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜在等離子體處理后并未出現(xiàn)破碎等現(xiàn)象，僅出現(xiàn)褶皺干癟等現(xiàn)象，說明低溫等離子體對(duì)金黃色葡萄球菌致死機(jī)制可能更多的是與等離子體中帶電粒子的物理撞擊有關(guān)。

3 結(jié)論

采用常壓冷等離子體處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，得到隨著等離子體處理時(shí)間延長、電源功率的增大或者電極間距的減小，引起兩種不同類型的食源性腐敗菌的失活效果增加。不僅如此，常壓冷等離子體引起大腸桿菌的失活主要與其含有大量活性物的氧化作用引起菌體細(xì)胞外膜的破裂有關(guān)。常壓冷等離子體引起金黃色葡萄球菌的失活主要與其含有帶電粒子的物理撞擊作用引起菌體細(xì)胞外膜被刻蝕有關(guān)。因此，常壓等離子體引起不同類型食源性腐敗菌的失活效果明顯且作用機(jī)制不同，為常壓冷等離子體在熱敏食品殺菌中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。