麥胚球蛋白對亞硝酸鹽急性中毒大鼠肝損傷的保護作用研究

趙肅，吳興泉*，黃繼紅，2*，潘龍，廖愛美，李肖肖，苑永建，鄭帥楠，董瑜琪，張杰

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.河南科譜特醫(yī)藥科技研究院有限公司，河南洛陽471000）

亞硝酸鹽是人體內(nèi)正常成分，在體內(nèi)直接或間接還原為一氧化氮后，在細胞呼吸轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)天然免疫力、改善腸胃和心血管健康等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[1]。在食品領(lǐng)域，亞硝酸鹽作為著色劑、風味劑和抗氧化劑經(jīng)常用于肉類制品加工中[2]。在工業(yè)上，它被用于合成染料、化學(xué)品以及橡膠的制造[3]。在醫(yī)學(xué)上，它被用作血管擴張劑和氰化物解毒劑[4]。根據(jù)研究報道，低劑量的亞硝酸鹽對人們的健康有一定益處，但是高水平的亞硝酸鹽會造成高鐵血紅蛋白癥、呼吸道疾病、神經(jīng)功能障礙以及癌癥等健康問題[5]。

近些年來，食源性天然產(chǎn)物用于輔助藥物治療或預(yù)防亞硝酸鹽中毒成為一種趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)5 mg/kg魚肝油能夠提高大鼠組織抗氧化能力，保護大鼠肝細胞免受氧化應(yīng)激損傷[6]。Elsherbiny 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，25 mg/kg 和50 mg/kg 百里香坤（thymoquinone，TQ）都能夠抑制亞硝酸鹽引起的氧化應(yīng)激，恢復(fù)促炎和抗炎因子平衡，對大鼠腎損傷具有明顯的保護作用。此外，還有藏紅花[8]、大蒜油[9]以及姜黃素[10]等一系列食源性天然產(chǎn)物對亞硝酸鹽危害具有預(yù)防作用。

麥胚球蛋白（wheat-embryo globulin，WEG）是以脫脂小麥胚為原料制備分離的一種植物蛋白，氨基酸比例均衡，具有抗炎、抗衰老以及提高機體免疫力等作用[11-12]。但是預(yù)防亞硝酸鹽急性中毒尚未見報道。因此本研究探討麥胚球蛋白對單次口服亞硝酸鹽引起肝損傷的保護作用，旨在為麥胚球蛋白高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD 雄性大鼠，體重160g～180g，由鄭州大學(xué)動物實驗中心提供（動物質(zhì)量合格證號NO.4100 3100006 969，許可證號SCXK 豫2017-0001）。

1.2 材料與試劑

麥胚球蛋白口服液（其中麥胚球蛋白≥1%）：河南省科譜特醫(yī)藥科技研究院有限公司。

亞硝酸鈉（≥99.999%）：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；維生素C（食品級）：石藥集團維生藥業(yè)（石家莊）有限公司。總蛋白定量測定試劑盒（bicinchonininc acid，BCA）：南京建成生物工程研究所；5-磺基水楊酸（≥99.0%）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）：北京索萊寶科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：湘中地質(zhì)實驗研究所；氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、多聚甲醛、四乙氧基丙烷（≥97.0%）：上海麥克林生化科技有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

5810R 臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf 公司；XHF-D 高速分散器：寧波新生物股份有限公司；LT1002E 電子天平、723N 可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AU5800 全自動生化分析儀：美國貝殼曼公司；Tecan Infinite pro 酶標儀：瑞士帝肯有限公司；FMB-20 制冰機：杭州聚同電子有限公司。

1.4 實驗動物分組及處理

將42 只雄性大鼠飼養(yǎng)于河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，室溫控制在24 ℃～26 ℃，相對濕度為40%～70%，定期更換墊料和進行鼠籠消毒，飼料標準符合GB 14924-2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》，飲用水標準符合GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》，宿舍標準符合GB 14925—2010《實驗動物環(huán)境及設(shè)施標準》。參照文獻[13]，略作修改，將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，用隨機數(shù)字表法把大鼠分為空白組、模型組、麥胚球蛋白組（80 mg/kg）、麥胚球蛋白低劑量組（40 mg/kg）、麥胚球蛋白中劑量組（80 mg/kg）、麥胚球蛋白高劑量組（160 mg/kg）以及維生素C 組（80 mg/kg），每組6 只。末次給藥12 h 后，空白組和麥胚球蛋白組給予等體積的生理鹽水，其它各組按60 mg/kg NaNO2進行灌胃，所有劑量都用去離子水配制。動物在整個治療期間均可自由獲取食物和水，無死亡，在最后一次治療24 h后，用乙醚麻醉后處死大鼠。動物實驗方案獲得河南工業(yè)大學(xué)倫理委員批準。

1.5 方法

1.5.1 肝臟指數(shù)測定

大鼠眼球取血后立即斷頸處死，取肝臟組織，用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)=器官質(zhì)量（mg）/體重（g）

1.5.2 肝勻漿制備

取大鼠肝組織塊放在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，精確稱取0.3 g，按料液比1∶9（g/mL）加入生理鹽水，在冰浴上用剪刀剪碎后，放入勻漿管中，用組織勻漿機制成10%勻漿，3 500 r/min 離心15 min，取上清液待測。

1.5.3 血清生化指標檢測

實驗結(jié)束后，每只大鼠眼球取血，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的活性。

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1.5.4 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定

按文獻[14-15]等的方法，取2 mL 磷酸鹽緩沖液（空白組）、粗酶液（樣品組），加入2 mL NBT 反應(yīng)液，均勻照光3 min～5 min，以加入緩沖液的不照光的反應(yīng)液作為空白對照，于560 nm 波長測定吸光度。以（A空白-A樣品）/A空白×100 表示抑制率（%），SOD 活力以抑制NBT 光還原的50%為一個酶活單位。

1.5.5 谷胱甘肽（gluthione，GSH）的測定

采用文獻[16-17]等的方法，取10%肝勻漿0.5 mL，加入0.5 mL 4%磺基水楊酸，3 000 r/min 離心10 min，取上清液0.5 mL，加入4.5 mL DTNB，混勻后室溫25 ℃放置10 min，423 nm 波長處測定吸光度，空白管加入同體積4%磺基水楊酸調(diào)零。在標準曲線上查出GSH濃度值，即可計算出原樣品中GSH 的含量。

1.5.6 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定

參考文獻[18]等的方法，取0.1 mL 10%肝勻漿，加入0.2 mL 8.1%SDS，再加入1.5 mL 0.2 mol/L 乙酸鹽緩沖液，最后加入0.8%TBA，迅速混合，避光沸水浴1 h 后，流水迅速冷卻，于532 nm 波長處測定吸光度。標準管中以40 nmol/L 四乙氧基丙烷代替肝勻漿，空白組以蒸餾水代替肝勻漿，其它操作同樣品管。

1.5.7 肝組織病理學(xué)檢查

將大鼠肝左葉部位的肝組織塊放入10%的多聚甲醛中固定，經(jīng)過酒精脫水和石蠟包埋后，蘇木晴-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，200 倍光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽急性中毒大鼠前后一般情況觀察

各組大鼠在染毒前飲食、飲水，活動正常，毛色平整、光澤。染毒后，活動明顯減少，表現(xiàn)為呆滯無神或靜臥不動，尤其以模型組為主，蜷臥聚團，活力下降，呼吸明顯加快、加深，尾巴顏色明顯變黑。與模型組相比，麥胚球蛋白低、中、高劑量組、維生素C 組飲食、飲水尚可，精神狀態(tài)較好，活動增多。

2.2 麥胚球蛋白對亞硝酸鹽急性中毒大鼠血清中ALT、AST、LDH 活性以及肝臟指數(shù)的影響

麥胚球蛋白對血清中ALT、AST、LDH 活性以及肝臟指數(shù)影響結(jié)果見表1。

表1 大鼠血清中ALT、AST、LDH 活性以及肝臟指數(shù)變化Table 1 Effect of ALT，LDH，AST activities in serum and liver index from rats

模型組大鼠肝臟指數(shù)和血清中ALT、LDH 以及AST 活性均顯著高于空白組（p＜0.05），且具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明一次過量亞硝酸鹽中毒會導(dǎo)致肝功能出現(xiàn)異常。而相比于模型組，維生素C 組和麥胚球蛋白各劑量組大鼠肝臟指數(shù)、ALT、LDH 以及AST 的活性均顯著下降（p＜0.05），其中，麥胚球蛋白高劑量組大鼠血清LDH 和AST 活性下降程度最大，表明給予麥胚球蛋白可以有效降低亞硝酸鹽對肝臟造成的損害。

2.3 麥胚球蛋白對亞硝酸鹽急性中毒大鼠肝臟中SOD 活性、GSH 以及MDA 含量的影響

麥胚球蛋白對血清中SOD 活性、GSH 以及MDA含量的影響見表2。

與空白組相比，模型組大鼠肝臟SOD 活性和GSH含量均顯著降低，MDA 含量顯著升高，表明亞硝酸鹽中毒引起肝臟抗氧化能力下降，脂質(zhì)過氧化水平增加，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生。然而，與模型組相比，麥胚球蛋白低、中、高劑量組以及維生素C 組SOD 活性和GSH含量顯著升高（p＜0.05），MDA 含量顯著降低（p＜0.05）；其次，麥胚球蛋白各劑量組還增加了GSH 含量（p＜0.05）。結(jié)果表明麥胚球蛋白能提高肝臟的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，有效預(yù)防氧化應(yīng)激的發(fā)生。

表2 大鼠肝臟中SOD、GSH 以及MDA 水平變化Table 2 Effect of SOD，GSH and MDA activities in liver from rats

2.4 病理切片分析

大鼠肝臟組織病理學(xué)變化見圖1。

空白組肝細胞整齊排列，細胞核呈橢圓形，細胞正常；模型組肝細胞出現(xiàn)肝細胞變性、壞死、腫脹嚴重，具有明顯炎癥損傷。麥胚球蛋白組和空白組無異。低劑量組中肝細胞腫脹嚴重，在中央靜脈周圍有明顯炎癥，細胞核形狀不規(guī)則；中劑量組中央靜脈周圍仍有炎癥損傷，腫脹范圍減小，程度減輕；高劑量組中肝細胞排列整齊，只有少數(shù)肝細胞腫脹，未見明顯細胞變性及壞死；陽性對照組中，肝細胞結(jié)構(gòu)及肝索排列基本接近正常，細胞核形狀規(guī)則，肝細胞輕微腫脹。

圖1 大鼠肝臟組織病理學(xué)變化（200×）Fig.1 Histopathologic changes of liver in rat（200×）

3 結(jié)論與討論

本實驗結(jié)果顯示，一次性灌胃60 mg/kg 亞硝酸鹽，可造成嚴重肝組織細胞損傷，而麥胚球蛋白預(yù)處理可明顯提高肝組織抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化程度，減少肝組織炎癥，改善亞硝酸鹽導(dǎo)致的急性肝損傷。本研究之所以選擇60 mg/kg 亞硝酸鹽作為中毒劑量，是根據(jù)課題組之前做的預(yù)實驗；其次，相關(guān)文獻中也報道了60 mg/kg 的亞硝酸鹽劑量不會造成大鼠死亡，但是會引起大鼠中毒[19]。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽在體內(nèi)與自由基反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽，這會進一步導(dǎo)致細胞組織和結(jié)構(gòu)受損[20]。肝臟在維持健康方面發(fā)揮著重要的作用，ALT 和AST 是存在于肝細胞內(nèi)的酶，當肝細胞被破壞時，ALT 和AST 都會流入到血液當中，因此ALT 和AST 的活性是判斷肝損傷的指標[21]。乳酸脫氫酶是機體糖酵解途徑的一種重要氧化還原酶，當組織器官缺氧或損害時，LDH 會發(fā)生顯著變化，這對判斷肝損傷程度具有重要意義[22]。SOD 和GSH 是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的主要成分，大鼠在亞硝酸鹽急性中毒情況下，活性氧自由基產(chǎn)生將增加，機體則會通過SOD 和GSH 等對活性氧自由基進行清除。其中，SOD 是體內(nèi)的一種重要抗氧化酶，具有明顯的抗脂質(zhì)過氧化以及自由基清除等作用，可將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2[23]。另外，GSH 是非酶體系的重要抗氧化劑和自由基清除劑，與體內(nèi)自由基結(jié)合，維護機體氧化平衡[24]。本實驗結(jié)果顯示，麥胚球蛋白低、中、高劑量組以及陽性對照組（維生素C 組）預(yù)處理都可以明顯提高大鼠肝臟SOD 活性和GSH 含量，能夠快速增強亞硝酸鹽中毒大鼠肝臟對活性氧的清除能力，從而發(fā)揮保護細胞的作用。其可能機制涉及到抑制NO 產(chǎn)生，減輕亞硝酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，恢復(fù)肝組織中的SOD 活性來阻斷亞硝酸鈉的抗氧化活性，對肝損傷具有保護作用[25]。

從病理切片觀察可以看出，模型組中肝細胞中央靜脈擴大，肝索排列紊亂，肝細胞明顯腫脹，與模型組相比，麥胚球蛋白各劑量組肝細胞腫脹減少，炎癥減退。病理切片顯示的情況和各項指標的測定結(jié)果相符合，進一步說明麥胚球蛋白可以有效保護肝細胞，提高肝細胞對亞硝酸鹽中毒的抵御能力。

綜上，麥胚球蛋白對亞硝酸鹽急性中毒肝損傷有保護作用。因此，在預(yù)防和治療亞硝酸鹽中毒方面具有一定應(yīng)用前景。