枯草芽孢桿菌J530菌株產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件的優(yōu)化及雞糞氨減排效果

張 穎,杜國霞,馮麗麗,王曉玉,劉 雙,王 超,姜軍坡,王世英

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定071000； 2.石家莊市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河北 石家莊 050000；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所,河南 鄭州 450002； 4.河北省畜牧總站，河北 石家莊050000)

氨是禽舍產(chǎn)量最多、危害最大的有害氣體。舍內(nèi)氨氣濃度超標(biāo)會(huì)對家禽上呼吸道產(chǎn)生腐蝕和刺激作用，引發(fā)多種呼吸道疾病，誘發(fā)腹水綜合征[1]，降低脾臟的免疫作用[2]，也會(huì)使家禽的血氨濃度升高引起氨中毒[3]，影響其健康和生產(chǎn)性能[4-5]。同時(shí)威脅飼養(yǎng)員的身體健康[6]，造成周圍空氣、土壤和水體的污染[7]。降低家禽糞便氨排放對提高家禽生長性能、促進(jìn)環(huán)保養(yǎng)殖和養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

由于雞的消化道很短且具有糞尿合一的特點(diǎn)，因此，食物只在消化道中短暫停留，大部分含氮化合物都隨糞便排出體外。而尿酸是家禽排泄物中氮存在的主要形式，可占到總氮的70%，尿酸分解是禽舍氨氣的主要來源[8]。尿酸經(jīng)尿酸酶、尿囊素酶、尿囊酸酰胺水解酶及脲基羥基乙酸酶等一系列酶的作用生成尿素和乙醛酸，隨后尿素在糞便微生物脲酶的作用下轉(zhuǎn)化為氨(銨)和二氧化碳[9]。在氨氣產(chǎn)生過程中，脲酶起到了關(guān)鍵的作用。因此，抑制雞糞便中脲酶的活性可以阻止尿素向氨的轉(zhuǎn)化，從而降低氨氣的排放。將脲酶抑制劑用于家禽養(yǎng)殖業(yè)氨減排已有較多研究，張洪芳[10]通過在家禽排泄物中添加NBPT可降低氨氣排放達(dá)71.86%，孫得發(fā)等[11]通過在肉仔雞日糧中添加脲酶抑制劑顯著降低了雞舍中的氨氣濃度，張金鳳[12]通過在肉雞日糧中添加乙酰氧肟酸降低了排泄物中的脲酶活性和氨態(tài)氮含量?？傊壳半迕敢种苿┰诩仪菁S便氨減排研究中的主要應(yīng)用方式是在家禽日糧中或其糞便中直接添加一些天然的或人工合成的脲酶抑制劑，而利用產(chǎn)脲酶抑制劑的微生物進(jìn)行氨減排的研究尚未見報(bào)道。

J530菌株是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室篩選得到的1株枯草芽孢桿菌，其搖瓶發(fā)酵液對大豆脲酶活性抑制率為98.35%。為提高J530菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)芽孢濃度，并探究其在雞糞氨減排中的應(yīng)用效果，以芽孢濃度為指標(biāo)，對該菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，并研究其菌劑對新鮮雞糞的氨減排效果，為該菌株在養(yǎng)殖業(yè)氨減排中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種

J530菌株：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，從雞糞中分離篩選得到的能抑制脲酶活性的菌株。

1.2 樣品

新鮮雞糞取自保定市清苑區(qū)某蛋雞養(yǎng)殖場。

1.3 培養(yǎng)基

NA、NB培養(yǎng)基：按文獻(xiàn)[13]配方配制。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、Na2HPO40.2%、KH2PO40.2%、pH值7.0。

1.4 菌種活化及種子液的制備

用滅菌竹簽從4 ℃保存的J530菌種斜面上挑取少量菌苔，接種于NA斜面，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，備用。

取5 mL無菌水倒入上述菌種斜面，刮取菌苔制成菌懸液，接入裝液量為100 mL(250 mL錐形瓶)的NB培養(yǎng)基中，37 ℃條件下150 r/min搖床培養(yǎng)12 h，即為種子液。

1.5 芽孢濃度的測定

發(fā)酵液芽孢濃度：先將發(fā)酵液在80 ℃水浴處理15 min，10倍梯度稀釋后，采用平板活菌計(jì)數(shù)法測定[13]。選擇30～300 cfu/皿的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。芽孢濃度(cfu/mL)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂布菌液的體積。

菌劑芽孢濃度：稱取5.0 g菌劑加入到裝有45 mL無菌水和15 粒玻璃珠的250 mL錐形瓶中，置于180 r/min搖床上搖動(dòng)15 min，制成均勻的芽孢懸濁液。后續(xù)步驟和計(jì)算同上。

1.6 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

1.6.1 碳源的優(yōu)化 分別以葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉、玉米粉替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，含量為1.5%，其他培養(yǎng)條件為裝液量100 mL、接種量6.0%、37 ℃條件下150 r/min搖床培養(yǎng)48 h。測定發(fā)酵液芽孢濃度，并以芽孢濃度為指標(biāo)確定最佳碳源。

1.6.2 氮源的優(yōu)化 以上述最佳碳源作為碳源，分別以蛋白胨、酵母浸膏、硫酸銨、黃豆餅粉、磷酸二氫銨、胰蛋白胨替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源，含量均為1.0%，其他培養(yǎng)條件同上。測定發(fā)酵液芽孢濃度，并以芽孢濃度為指標(biāo)確定最佳氮源。

1.6.3 無機(jī)鹽的優(yōu)化 以上述最佳碳源、最佳氮源為碳源、氮源，分別以NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無機(jī)鹽，含量為0.5%，其他培養(yǎng)條件同上。測定發(fā)酵液芽孢濃度，并以芽孢濃度為指標(biāo)確定最佳無機(jī)鹽。

1.6.4 培養(yǎng)基組成優(yōu)化正交試驗(yàn) 利用單因素試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平見表1，利用L9(33)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。以搖瓶發(fā)酵液芽孢濃度為指標(biāo)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成。

表1 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)的因素水平

1.6.5 其他發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn) 利用培養(yǎng)基優(yōu)化后的配方配制搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，以發(fā)酵液芽孢濃度為指標(biāo)，利用L9(34)正交表對搖瓶發(fā)酵時(shí)間、裝液量、初始pH值、接種量等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。因素水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)的因素水平

1.7 菌劑應(yīng)用試驗(yàn)

1.7.1 菌劑制備 采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件搖床培養(yǎng)5.0 L發(fā)酵液，6 000 r/min離心，取菌體用適量麩皮吸附，50～55 ℃鼓風(fēng)干燥，粉碎制成芽孢濃度為1.0×1010cfu/g的菌劑。

1.7.2 菌劑活化 將以上菌劑按1∶100(m/V)與2.0%的紅糖水混勻，在室溫(25～35 ℃)下活化4 h，備用。

1.7.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取200.0 g新鮮雞糞放入1 000 mL廣口瓶中，接入上述活化菌劑22.0 mL并充分混勻，使接種后雞糞中J530菌體的濃度為1.0×107cfu/g。然后再在廣口瓶里的雞糞上放一個(gè)盛有40.0 mL氨氣吸收液[14]的100 mL小燒杯。同時(shí)以22.0 mL紅糖水代替活化菌劑作為對照。蓋好瓶塞，30 ℃靜置5 d后測定雞糞芽孢桿菌濃度、脲酶活性、氨氣釋放量、pH值及氨氮、尿素、尿酸、總氮等含量。

1.7.4 雞糞中芽孢桿菌濃度測定 測定方法與1.5中的菌劑芽孢濃度測定相同。

1.7.5 雞糞pH值檢測 稱取雞糞10.0 g于250 mL錐形瓶中，加入去離子水20.0 mL，充分?jǐn)嚢杈鶆颍? 000 r/min離心15 min，用pH計(jì)精確測定上清液。

1.7.6 其他指標(biāo)檢測方法 雞糞中脲酶活性檢測采用文獻(xiàn)[15]所示方法；雞糞中氨態(tài)氮及雞糞氨氣釋放量檢測采用文獻(xiàn)[14]的方法；雞糞中尿素、尿酸含量檢測采用文獻(xiàn)[16—17]中的試劑盒法(試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，編號為C012-1、C013-1)；雞糞中總氮含量測定采用文獻(xiàn)[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對J530菌株搖瓶發(fā)酵液芽孢濃度的影響

碳源種類對J530菌株搖瓶發(fā)酵液芽孢濃度的影響見圖1。玉米粉為碳源時(shí)芽孢濃度最高，達(dá)到6.55×108cfu/mL，且玉米粉廉價(jià)易得，故選擇玉米粉為最優(yōu)碳源。

圖1 碳源種類對芽孢濃度的影響

2.2 氮源對J530菌株搖瓶發(fā)酵液芽孢濃度的影響

氮源種類對J530菌株搖瓶發(fā)酵液芽孢濃度的影響見圖2。以黃豆餅粉作為氮源時(shí)，芽孢濃度達(dá)到最高，為1.70×109cfu/mL。因此，選擇黃豆餅粉為最佳氮源。

圖2 氮源種類對芽孢濃度的影響

2.3 無機(jī)鹽對J530菌株搖瓶發(fā)酵液芽孢濃度的影響

無機(jī)鹽種類對J530菌株搖瓶發(fā)酵液芽孢濃度的影響見圖3。以MgSO4·7H2O作為無機(jī)鹽時(shí)，芽孢濃度最高，達(dá)到了3.35×109cfu/mL。因此，選擇MgSO4·7H2O為最適無機(jī)鹽。

圖3 無機(jī)鹽種類對芽孢濃度的影響

2.4 培養(yǎng)基組成優(yōu)化

培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由極差分析結(jié)果可知，R玉米粉>R黃豆餅粉>RMgSO4?？梢姡瑢530菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)芽孢影響最大的是玉米粉，其次是黃豆餅粉。

表3 培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn)結(jié)果

比較各因素水平的均值可得：A2>A3>A1，B3>B2>B1，C1>C2>C3，故最佳培養(yǎng)基組成為A2B3C1，即玉米粉1.5%、黃豆餅粉1.5%、MgSO4·7H2O 0.3%，該組合下?lián)u瓶發(fā)酵液的芽孢濃度為4.26×109cfu/mL。

2.5 其他發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間、裝瓶量、初始pH值、接種量對搖瓶發(fā)酵液芽孢濃度的影響見表4。

從表4均值分析可知，最優(yōu)組合為A2B1C3D1，但該組合未在上述試驗(yàn)中出現(xiàn)。因此，將最優(yōu)組合A2B1C3D1和芽孢濃度最大的5號組合A2B2C3D1進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果最優(yōu)組合A2B1C3D1條件下的芽孢濃度為7.30×109cfu/mL，而A2B2C3D1培養(yǎng)條件下芽孢濃度為6.88×109cfu/mL。因此，確定最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B1C3D1，即發(fā)酵時(shí)間36 h、裝瓶量50 mL、初始pH值8.0、接種量4.0%。

綜上所述，枯草芽孢桿菌J530菌株產(chǎn)芽孢的最優(yōu)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件：玉米粉1.5%、黃豆餅粉1.5%、MgSO4·7H2O 0.3%、Na2HPO40.2%、KH2PO40.2%、發(fā)酵時(shí)間36 h、裝瓶量50 mL、初始pH值8.0、接種量4.0%、培養(yǎng)溫度37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。J530菌株搖瓶發(fā)酵液的芽孢濃度較優(yōu)化前(3.27×108cfu/mL)提高了20.32倍。

表4 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 J530菌劑應(yīng)用效果

從表5可知，與對照組相比，5 d后試驗(yàn)組的芽孢桿菌含量提高了60.29倍(P<0.01)、脲酶活性降低了80.78%(P<0.01)、5 d氨氣釋放量減少了67.78%(P<0.01)、pH值降低了1.35(P<0.05)、氨氮含量降低了48.57%(P<0.01)、尿素含量提高了24.79%(P<0.05)、總氮含量提高了8.53%(P>0.05)、尿酸含量提高了0.91%(P>0.05)。5 d后，試驗(yàn)組雞糞中芽孢桿菌含量增加，說明J530菌株可在雞糞中生長繁殖，這與雞糞中脲酶活性降低、pH值降低及其他參數(shù)的變化均具有直接或間接的因果關(guān)系。

表5 J530菌劑應(yīng)用效果

3 結(jié)論與討論

3.1 發(fā)酵條件優(yōu)化指標(biāo)

枯草芽孢桿菌的芽孢具有較強(qiáng)的抗逆性，能耐熱、酸、堿等不良環(huán)境。芽孢濃度是這類微生物制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)。因此，發(fā)酵液的芽孢濃度也成為該類菌株發(fā)酵條件優(yōu)化時(shí)的主要指標(biāo)[19-20]，標(biāo)志著產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)水平。本研究以發(fā)酵液芽孢濃度為指標(biāo)優(yōu)化枯草芽孢桿菌J530菌株的搖瓶發(fā)酵條件，為其芽孢菌劑的發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)。

3.2 J530菌株的氨減排作用

目前，利用微生物進(jìn)行家禽養(yǎng)殖業(yè)氨減排的研究多集中在篩選產(chǎn)蛋白酶的菌株以增強(qiáng)家禽對飼料蛋白的消化能力[21]、篩選能夠抑制產(chǎn)氨菌生長的微生物[22]、篩選具有高效氨氮降解能力的菌株[23]等方面。但在家禽糞便中添加抑制脲酶活性的微生物用于氨減排的研究尚未見報(bào)道。J530菌株是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室從雞糞便中分離得到的氨氮高效利用并能產(chǎn)生脲酶抑制劑的菌株。因此，該菌株在應(yīng)用試驗(yàn)中可以利用雞糞便中的氨氮及菌劑活化所提供的糖分等作為營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長，同時(shí)產(chǎn)生脲酶抑制劑，抑制糞便中的脲酶活性，減少尿素向氨的轉(zhuǎn)化，從而引起糞便氨氮含量顯著降低，pH值隨之降低，同時(shí)也引起尿素的積累。但試驗(yàn)組尿酸含量與對照組相比無顯著變化，可能是尿酸轉(zhuǎn)化為尿素的中間步驟未受到影響所致。以上結(jié)果提示，該菌劑如能用于雞糞便的堆肥，可減少雞糞便的氨排放，降低對環(huán)境的污染，同時(shí)起到糞便保氮、提高肥效的作用。

3.3 J530菌株的應(yīng)用前景

在豬、雞、牛、羊等各種畜禽養(yǎng)殖過程中都會(huì)產(chǎn)生氨氣，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球70%～80%的氨氣均來自畜牧生產(chǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了工業(yè)氨氣排放，而其中50%以上是由畜禽糞便產(chǎn)生的[24]。以養(yǎng)豬為例，豬只能利用飼料中30%～55%的氮，其余大部分以糞尿形式排出，而尿氮中97%的氮是以尿素的形式存在，占總攝入氮的50%左右[4]。J530菌株可以產(chǎn)脲酶抑制劑，用于畜禽糞便堆肥，能抑制糞便中尿素向氨的轉(zhuǎn)化，從而減少氮素?fù)p失，提高堆肥產(chǎn)品的含氮量；用于生產(chǎn)微生物飼料添加劑，可降低動(dòng)物腸道脲酶活性，從而降低腸氨、血氨等，降低氨代謝所需要的能量，提高生長性能[3]，且隨糞便排出體外后仍具有氨減排效果。該研究為健康、環(huán)保養(yǎng)殖提供了新菌源。

綜上，發(fā)酵條件優(yōu)化后，J530菌株搖瓶發(fā)酵液的芽孢濃度較優(yōu)化前提高了20.32倍；應(yīng)用試驗(yàn)表明，J530菌株可在雞糞便中生長繁殖，使雞糞便脲酶活性、氨氮含量及pH值顯著降低，尿素含量顯著提高，總氮含量有所提高，從而顯著降低雞糞便的氨氣排放量。