超高效液相色譜串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜快速檢測白酒中10種甜味劑

朱 明，李 巧，余 磊，戴 唯

（1.貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州貴陽 550081；2.貴陽學(xué)院，貴州生態(tài)環(huán)境中優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品殘留農(nóng)藥降解關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實驗室，貴州貴陽 550005）

隨著中國白酒越來越受世界消費(fèi)者的青睞，國際市場更加廣泛，因此，要求我國白酒企業(yè)的釀造工藝更加規(guī)范，衛(wèi)生質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)向國際化標(biāo)準(zhǔn)靠近[1]。貴州白酒文化歷史悠久，也是我國傳統(tǒng)白酒發(fā)源地和醬香型白酒的主要產(chǎn)區(qū)，白酒工業(yè)在貴州經(jīng)濟(jì)中占有重要的位置。貴州白酒生產(chǎn)企業(yè)既有茅臺、國臺等大型企業(yè)，也有眾多小作坊，大多數(shù)小作坊廠房簡陋，設(shè)備陳舊，技術(shù)落后。隨著白酒行業(yè)不斷的發(fā)展，國內(nèi)白酒行業(yè)各類安全隱患和事件凸顯，甜味劑問題等多種白酒事件頻發(fā)，這些問題在一定程度上制約了白酒行業(yè)的發(fā)展[2]。據(jù)貴州省市場監(jiān)管局食品不合格情況的通告，2019—2020年貴州省食品安全監(jiān)督抽檢結(jié)果涉及甜味劑的超范圍使用問題，其中白酒中不合格項目包括甜蜜素、糖精鈉、三氯蔗糖等甜味劑[3-4]。

甜味劑是賦予食品甜味的物質(zhì)，是一類重要的食品添加劑，已在美國、歐盟及中國等100 多個國家和地區(qū)廣泛使用，有的品種使用歷史已超過100年[5]。甜味劑有人工和天然之分，在食品中適量添加可改善食品風(fēng)味，但長期大量攝入人工甜味劑可能會導(dǎo)致高血糖、葡萄糖耐受不良、肥胖等代謝系統(tǒng)性疾病[6]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，復(fù)合甜味劑的使用和新型甜味劑的開發(fā)成為發(fā)展的潮流和趨勢，但這也對監(jiān)管提出了新的挑戰(zhàn)[7]。我國GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)范管理使用的甜味劑有甜菊糖苷、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、安賽蜜、甘草、木糖醇、麥芽糖醇等十余種，可以用于面包、糕點(diǎn)、餅干、飲料、調(diào)味品等食品中。根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，白酒中不允許添加天然或人工合成甜味劑[8]。因此白酒中檢出甜味劑屬于超范圍使用，原因可能是生產(chǎn)企業(yè)為增加產(chǎn)品的某方面口感，在產(chǎn)品中添加甜味劑來調(diào)節(jié)，也可能是原輔料帶入的因素。

食品中甜味劑的分析方法有液相色譜法[9-16]、氣相色譜法[17-20]、拉曼光譜法[20]、離子色譜法[21-24]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[25-50]。液相色譜檢測時由于甜蜜素與三氯蔗糖的紫外吸收較弱，不適宜使用紫外檢測器，使得多種甜味劑同時檢測受到限制，氣相色譜檢測甜蜜素需要衍生化且會產(chǎn)生假陽性情況。上述幾種檢測方法抗干擾能力弱、靈敏度低及特異性不強(qiáng)。目前檢測機(jī)構(gòu)多采用液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測白酒中甜味劑，但低分辨率質(zhì)譜的缺點(diǎn)是必須采用標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)做定性的依據(jù)。鑒于此，本研究針對白酒樣品的特性，建立了一種基于超高效液相色譜串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜同時檢測白酒中10 種甜味劑的快速檢測方法，該方法前處理簡單、快速，不僅可以實現(xiàn)甜味劑的精準(zhǔn)定性，同時可完成準(zhǔn)確定量，為白酒中甜味劑檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酒樣：市售某品牌白酒樣品。

甜味劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：安賽蜜（德國Dr 公司，批號：G137930）；甜蜜素（北京壇墨公司，批號：A1910277）；D(+)-甘露糖（德國Dr 公司，批號：G832837）；D-山梨糖醇（德國Dr 公司，批號：G145145）；糖精鈉（德國Dr 公司，批號：G154497）；阿斯巴甜（德國Dr 公司，批號：G132138）；阿力甜（加拿大Toronto Research Chemicals 公司，批號：A536500）；麥芽糖醇（美國TMstandard 公司，批號2221805）；紐甜（上海安譜公司，批號：44760100）；三氯蔗糖（德國Dr 公司，批號：G125127）；乙酸銨（色譜純，天津科密歐公司）；甲醇（色譜純，美國默克公司）；純水（18.2Ω，美國密理博公司）。

儀器設(shè)備：超高效液相色譜（美國賽默飛世爾公司，Ultimate-3000）和靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾公司，Q-Exactive）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品1.00 g，用純水定容至10.0 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用純水溶解后配制成1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冷藏保存。準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液繪制1.0～100 ng/mL 工作曲線。

1.2.3 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃。流動相為0.01 mol/L 乙酸銨溶液和甲醇；流速0.3 mL/min；采用梯度洗脫（見表1）；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫條件

1.2.4 質(zhì)譜條件

可加熱點(diǎn)噴霧離子源（HESI），負(fù)離子檢測模式；鞘氣流速：12 L/min（即40 arb）；輔助氣流速：3.6 L/min（即12 arb）；吹掃氣流速：0 L/min；噴霧電壓：3000 V；毛細(xì)管溫度：325 ℃；輔助氣加熱溫度：350 ℃；掃描模式：一級全掃描+數(shù)據(jù)依賴的二級掃描（Full scan+ddms2），母粒子掃描分辨率：70000，最大注入時間：200 ms，掃描范圍100～500 m/z，子粒子掃描分辨率：17500，觸發(fā)閾值：1×105，最大注入時間：50 ms。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理的選擇

在一個檢測過程中，樣品前處理通常會占用全程時間的50 %以上，因此在不影響檢測結(jié)果的前提下采用簡單、無損、低成本、環(huán)境友好的前處理方法是最優(yōu)選擇。針對白酒樣品，本方法采用樣品用水稀釋10 倍后直接上機(jī)檢測，結(jié)合色譜柱分離和精確質(zhì)量數(shù)定性定量，未見有基質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)。

2.2 流動相的選擇

本文對常用的流動相甲醇-水和乙腈-水進(jìn)行對比，結(jié)果表明，使用甲醇效果略好于乙腈。同時，將0.1 %甲酸水溶液和0.01 mol/L 乙酸銨溶液分別與甲醇作流動相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)流動相中含有0.1%甲酸時，部分甜味劑峰形拖尾，而用0.01 mol/L乙酸銨時，響應(yīng)較高，同時峰形較好。因此，本文采用0.01 mol/L乙酸銨水溶液-甲醇作流動相。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

采用Xcalibur 2.1 軟件計算的化合物加合離子的理論單一同位素的精確質(zhì)量數(shù)作為提取色譜圖的依據(jù)，表2 列出了10 種甜味劑的分析參數(shù)。理論精確質(zhì)量數(shù)與實測精確質(zhì)量數(shù)的相對偏差越小，則篩查結(jié)果的可信程度越高。

從表2 可看出，10 甜味劑的質(zhì)量數(shù)相對偏差全部＜3 μg/kg，按照歐盟2002/657/EC 增加的LC/MS目標(biāo)準(zhǔn)則，篩查要求質(zhì)量精度在±50 mDa 之間，分辨率＞10000，因此可根據(jù)保留時間、精確質(zhì)量數(shù)對白酒中非法添加甜味劑進(jìn)行快速篩查與確證。10種甜味劑相關(guān)色譜和質(zhì)譜信息見表2和圖1。

2.4 線性范圍和最低檢出限

關(guān)于高分辨質(zhì)譜的最低檢出限，有報道以10倍信噪比所對應(yīng)的濃度值作為最低檢出限[51-52]，但由于高分辨質(zhì)譜提取目標(biāo)離子的精確質(zhì)量數(shù)，基線噪音極低，以此方法計算出的最低檢出限與方法的真實性存在差距。本實驗采用基質(zhì)空白提取液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至儀器所能檢出的最低濃度，該濃度應(yīng)滿足在較長一段時間內(nèi)連續(xù)多次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低，然后將該濃度做為方法的最低檢出限。見表3。

表2 10種甜味劑的分子式、保留時間、理論精確質(zhì)量數(shù)和實測精確質(zhì)量數(shù)

圖1 10種甜味劑提取離子色譜圖和二級質(zhì)譜圖

表3 10種甜味劑的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限和回歸方程

表4 10種甜味劑加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 方法的回收率和精密度

以1 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg 3 個水平添加到空白樣品中，測定回收率和精密度，結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

本試驗建立了超高效液相色譜串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜快速檢測白酒中10 種甜味劑的方法，白酒樣品用水稀釋后即可直接進(jìn)樣分析，采用ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱同時對安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、麥芽糖醇、阿力甜、D-山梨糖醇、D-甘露糖及三氯蔗糖進(jìn)行色譜分離檢測，并采用高分辨質(zhì)譜與二級離子碎片進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。實際樣品檢測結(jié)果表明，該方法能夠滿足白酒中10 種甜味劑的精準(zhǔn)定性和準(zhǔn)確定量的快速檢測，極大地提高了分析效率和準(zhǔn)確性。